1250463194

Biochemia: Ćw. 11 - Metoda RT-PCR

1.2.    Określenie stężenia oraz czystości RNA metodą spektrofotometryczną

Kwasy nukleinowe selektywnie pochłaniają światło ultrafioletowe (UVj wykazując maksimum absorbancji przy długości fali 260 nm. Zjawisko to znajduje zastosowanie w oznaczaniu stężenia kwasów nukleinowych, np. w preparatach kwasów nukleinowych po izolacji. Ekstrakty kwasów nukleinowych mogą być zanieczyszczone np. białkami łub odczynnikami używanymi do izolacji. W celu określenia czystości przygotowanego preparatu mierzy się OD również przy dl. fali 280 nm, stanowiącą maksimum absorbancji dla białek. Preparat uznaje się za czysty wówczas, kiedy stosunek wartości absorbancji A2&SA2B0 dla RNA jest równy lub zbliżony do 2.0. W przypadku, gdy stosunek wartości A261ZA2S0 jest niższy, roztwór RNA jest zanieczyszczony białkami.

Wykonanie: W spektrofotometrze do mikroobjętości (Thermo Scientific Nano-Drop 2000) zmierzyć absoibancję przy dl. fali 260 i 280 nm względem próby ślepej (wody wolnej of RNaz). Spektrofotometr dla warstwy absorbującej równej 10 mm w oparciu o zadaną wartość współczynnika absorbancji (dla RNA 1 jednostka A260 równa jest 40 pg/ml) przelicza zmierzoną wartość absorbancji na stężenie wyrażone w ng/pl. Wyliczona przez spektrofotometr wartość ilorazu A260/A280 świadczy o czystości preparatu.

1.3.    Precypitacja RNA

W przypadku uzyskania preparatu RNA o bardzo małym stężeniu (często uniemożliwiającym pomiar metodą spektrofotometryczną) roztwór możemy zagęścić przez precypitację (strącanie) z użyciem środków odwadniających. Najczęściej do precypitacji używa się alkoholi: etanolu lub izopropanolu. Wydajność precypitacji kwasu nukleinowego zwiększa użycie schłodzonego alkoholu: samą precypitację też wykonuje się w niskiej temperaturze (4°C lub -20°C).

Wykonanie: Przygotować sterylną probówkę typu eppendorf o poj. 0.5 ml. Do 100 pi roztworu wyjściowego RNA dodać 10 pl 3M CHsCOONa, pH 5.2 (RT) oraz 250 pl 96% etanolu (z temp. -20°C). Wymieszać dokładnie i inkubować przez 30 min w temp. -20°C. Wytrącone RNA wirować przez 10 min, 13000 RCF, RT (wirówka miniSpin plus, Eppendorf). Zebrać dokładnie nadsącz końcówką kapilarną a peletę przemyć 250 pl 70% etanolu (RT) i zworteksować. Ponownie żwirować przez 10 min, 13000 RCF, RT (wirówka miniSpin plus, Eppendorf). Po dokładnym zebraniu nadsączu końcówką kapilarną peletę wysuszyć pod lampką (ok.10 min) a następnie rozpuścić w 10 pl wody dejonizowanej.

W celu określenia odzysku RNA po precypitacji zmierzyć jego stężenie w roztworze wyjściowym oraz precypitacie (pkt. 1.2). Określić ilość RNA w roztworze wyjściowym i precypitacie oraz procent RNA odzyskany po precypitacji. Wyniki zamieścić w tabeli 1. Skomentować czystość roztworów RNA oraz wydajność precypitacji RNA.

Tab.1. Bilans precypitacji RNA.

roztwór RNA	A260	A20O	A260/A280	stężenie RNA [ng/pl]	ilość RNA w danej objętości [pg]	odzysk RNA [%]
wyjściowy
precypitat

2