1250463195

Biochemia: Ćw. 11 - Metoda RT-PCR

2. Odwrotna transkrypcja

Cząsteczki kwasu mRNA przed amplifikacją w reakcji PCR należy przepisać na cDNA (ang. complementary DNA) w procesie odwrotnej transkrypcji z użyciem enzymu - odwrotnej transkiyptazy (RT, ang. reverse transcriptase).

Wykonanie: W probówce typu eppendorf o poj. 0.5 ml 1 pg RNA rozcieńczyć wodą wolną od RNaz do obj. 5 pi. W kolejnej probówce o poj. 0.5 ml przygotować mieszaninę reakcyjną składającą się z: buforu 10-krotnie stężonego, roztworu czterech deoksyrybonukleozydotrifosforanów (dNTP), krótkich fragmentów oligodeoksyrybonukleotydowych (dT23), wody wolnej od RNaz oraz enzymu - odwrotnej transkryptazy. Zamieszczona poniżej tabela 2 zawiera skład mieszaniny reakcyjnej na jedną próbkę.

Tab.2. Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji odwrotnej transkrypcji.

	składniki mieszaniny	objętość h-ilj
1.	bufor 10x stężony	2
2.	5mM dNTP	2
3.	70 pM oligo dT23	0,3
4.	woda wolna od RNaz	9,7
5.	odwrotna transkryptaza	1
	objętość całkowita	15

Równocześnie z próbką badaną przygotować kontrolę negatywną: mieszanina reakcyjna z wodą wolną od RNaz w miejsce RNA. Odwrotną transkryptazę dodać na końcu, tuż przed dodaniem mieszaniny do probówki zawierającej RNA. Po żwirowaniu, probówki umieścić w bloku grzejnym i prowadzić reakcję zgodnie ze schematem podanym w tabeli 3.

Tab.3. Etapy odwrotnej transkrypcji.

	nazwa cyklu	temperatura	czas [min]
1.	wstępna denaturacja	65°C	5
2.	odwrotna transkrypcja	37°C	60
3.	przerwanie reakcji	95"C	5
4.	koniec reakcji	4°C