5783290849

WYKONANIE ĆWICZENIA

Przygotowanie próbki (wykonane w okresie przygotowania ćwiczenia)

Odważyć 2 g igieł sosny, albo trawy, albo zielonych liści. Próbkę homogenizować poprzez ucieranie w moździerzu z 10 ml acetonu i ok. 5 g bezwodnego siarczanu sodu. Supematant utworzony w moździerzu przesączyć przez filtr celulozowy 0,4 pm i ciecz zawartą w przesączu odparować w strumieniu sprężonego azotu, a suchą masę rozpuścić w eluencie, albo w izopropanolu (w ok. 1 - 2ml). Tak przygotowane próbki poddać analizie chromatograficznej.

Warunki dozowania, rozdzielania i detekcji

1.    Ustawić stalą prędkość przepływu eluentu o składzie heksan MTBE :    THF =

55:8:6,4, albo innym - wskazanym przez prowadzącego - w zakresie 0,5 do 1,5 ml/min (warunki izokratyczne, albo elucji gradientowej);

2.    Ustabilizować warunki (stabilna linia podstawowa, powierzchnia sorpcyjna kolumny „zrównoważona” ze stosowanym eluentem), zmierzyć natężenie przepływu eluentu za pomocą cylinderka miarowego, albo przepływomierza;

3.    Po ustabilizowaniu warunków rozdzielania, wprowadzić do kolumny 10 do 50 mikrolitrów roztworu próbki (w przypadku dozownika zaworowego wprowadzić do pętli dozującej co najmniej 2,5 krotność jej objętości w położeniu „load” rotora, stosując strzykawkę z płaską końcówką igły (!!!), a następnie szybko przestawić zawór w położenie „inject”, w przypadku dozownika membranowego wstrzyknąć próbkę bezpośrednio do strumienia eluentu za pomocą mikrostrzykawki);

4.    Zbadać jak zmienia się retencja rozdzielanych substancji ze zmianą składu fazy ruchomej. Próbka zostanie poddana rozdzielaniu w kolumnie chromatograficznej typu CN, albo Si 60 w różnych warunkach tj. przy różnym składzie fazy ruchomej (np. heksan : MTBE : THF = 50:15:8; heksan : MTBE : THF = 51:19:10 i innych).

Przykładowy chromatogram rozdzielania chlorofili wyekstrahowanych z igieł sosny, otrzymany z zastosowaniem detektora UWIS/DAD (warunki rozdzielania zbliżone do optymalnych dla kolumny 250x4 mm typu CN 5 urn - heksan : MTBE : THF = 71,25 : 16,25 : 12,5).

OPRACOWANIE WYNIKÓW

Na podstawie zarejestrowanych chromatogramów należy obliczyć / wyznaczyć:

•    współczynniki retencji k dla głównych składników badanej próbki (Jest to obiektywny parametr pozwalający porównać selektywność różnych układów chromatograficznych. W odniesieniu do konkretnej substancji wiąże on parametry eluentu i parametry fazy stacjonarnej). Współczynnik retencji k wyznacza się na podstawie chromatogramu korzystając z zależności zwanej równaniem elucji V_R = V₀ (1+k) lub t_R = to (1+k), gdzie: V_R t_R - objętość, czas retencji określonej substancji, Vo,to- objętość, czas martwy kolumny

•    na podstawie zależności wartości k poszczególnych substancji od składu eluentu: lg(k) = f (Xs) (X_s-ułamek molowy składnika polarnego w eluencie), albo lg (k) = f (Cs), (Xs, Cs - odpowiednio ułamek molowy, stężenie składnika polarnego w eluencie) po stwierdzeniu która z tych funkcji posiada

6