Genetyka kliniczna – ćwiczenia 2012

Strona 1

Ćwiczenie 1
Temat: Cytogenetyczne hodowle komórkowe.

Chromosom – skondensowane DNA, 4 MB par zasad
Aberracje chromosomowe mogą być liczbowe lub strukturalne i są widoczne w mikroskopie
świetlnym.

Pacjenci z wadami wrodzonymi:
-opóźnienie w rozwoju, pre-/postnatalne opóźnienie rozwoju somatycznego, cechy dysmorfii twarzy,
zaburzenia zachowania (spektrum cech autystycznych)
-zaburzenia rozwoju cielesno-płciowego (np. zespół Turnera, zespół nadnerczowo-płciowy [ZNP] ma
kariotyp żeński 46XX, a płciowe narządy męski; kariotyp 45X/46XY)
-zaburzenia płodności (zawsze badamy Ją i Jego!) : niepłodność żeńska i męska, poronienia
nawykowe, rodzenie dzieci z wadami

Pacjenci bez wad wrodzonych: pacjenci z kariotypem nabytym – to pacjenci hematoonkologiczni z
białaczkami

Materiał do analizy cytogenetycznej:
1. Krew obwodowa – limfocyty T (mają korzystny czas podziału kom.; łatwo pobranie materiału –
krwi; znamy czynnik mitogenny – stymulujący podziały, mają nierozczłonowane jądro)
2. Fibroblasty skóry – gdy wynik kariotypu konstytucyjnego krwi obwodowej (Limf T) nie odpowiada
fenotypowi pacjenta
3. Amniocyty – złuszczony naskórek płodowy z płynu owodniowego (amnipunkcja wczesna: 11-14
tyg, późna: 15-17 tyg)
4. Szpik kostny (białaczki) – kariotyp nabyty
5. Komórki guzów litych: wykonuje się rzadko, bardzo drogie badanie

Etapy hodowli:
1. Pobranie:
- jałowe pobranie krwi na heparynę (aktywność 4,35 j.; służy jako antykoagulant) o temp 37 st.C
- ok. 5 ml (krew), 2-4 ml (szpik, pobranie w warunkach szpitalnych)
- proporcje heparyna:krew -> 1:2
- krew nie musi być natychmiast wysyłana do lab. ( 12-24h można przetrzymać w lodówce, -4 st. C)
- W ciągu 6 tygodni przed nie można przyjmować antybiotyków i żadnych rentgenów!
2. Zakładanie hodowli komórkowej
- w 2 sterylnych flakonach – na wszelki wypadek!
- 4 ml podłoża RPMI (gotowe podłoże hodowlane) z 1 ml surowicy płodowej cielęcej lub ludzkiej
(surowica grupy AB – brak przeciwciał)
- mitogen np. LF-7 (0,2 ml); dawniej mukoproteina z wyciągu z fasoli; do szpiku nie dodajemy bo ma
większe możliwości podziału
- antybiotyk o szerokim spektrum – dodajemy tylko do jednego flakonu
- krew pełna: 5-10 kropli
3. Warunki hodowli: 72h (szpik 24h) w 37 st.C z dopływem 5% CO2 -> warunki podobne do tych w
organizmie. W ciągu ostatniej godziny hodowli musimy nagromadzić komórki w stadium metafazy
dodajemy więc kolchicyny, by zahamować anafazę (nie powstaną prawidłowe wrzeciona
kariokinetyczne).
4. zahamowanie hodowli i opracowanie:
- szok hipotoniczny (0,075 M KCl, 37 st.C): 40 min – szpik kostny, 20 min – limfocyty; zachodzi
zjawisko dyfuzji i osmozy: mechaniczne rozerwanie błon komórkowych
- odwirowanie
- supernatant odlewamy, ważny jest osad; komórki muszą pęknąć

Genetyka kliniczna – ćwiczenia 2012

Strona 2

- odwirowanie
- 3x utrwalanie w mieszaninie metanol:lodowaty kwas octowy w stosunku 3 : 1
Materiał taki kładziemy na szkiełko podstawowe (odtłuszczone, trzymane w lodowce) i szukamy
metafaz.

Barwienie chromosomów:
- GTG (prążki G, trypsyn+ Giemsa) - najczęściej stos. do oceny kariotypu , prążki ciemne zawierają
skondensowaną chromatynę = heterochromatynę (dostęp trypsyny do niej jest utrudniony), bogatą
w pary zasad A-T, zawierającą stos. mało aktywnych genów. Jest to obszar wolnoreplikujący
(replikuje się późno w fazie S) Prążki jasne zawierają euchromatynę, 80% aktywnych genów, dużo par
C-G, obszary te replikują się wcześnie.
- CBG (prążki C, Ba(OH)+ Giemsa) - Ba(OH)2 wiąże się z heterochromatyną konstytucyjną, występuje
ona w centromerach wszystkich chromosomów, więc metoda ta służy wybarwianiu centromerów
ciepło, Giemsa) - prążki barwią się na odwrót niż w GTG, metoda ta może być użyteczna w badaniu
aberracji w regionach telomerowych.
- RHG (prążki R, hydroliza na ciepło+ Giemsa) - prążki barwią się na odwrót niż w GTG (R-reverse),
metoda ta może być użyteczna w badaniu aberracji w regionach telomerowych.
- RBG (wodorotlenek baru BrdU + Giemsa)
- QFQ (prążki Q, fluorochrom, quinakryna)
- DA/DAPI (fluorochrom DAPI)
- AgNOR uwidocznienie rejonów satelitarnych i okołojąderkowych, traktowanie chromosomów
solami srebra;
- FPG (fluorescencyjny barwnik + Giemsa z BrdU)

Pierwsza litera: to rodzaj prążkowy
Druga litera: czynnik trawiący (T-trypsyna)
Trzecia litera: rodzaj barwnika

Kariogram – zestaw poukładanych parami chromosomów
Ułożenie kariogramu: wybieramy 20 metafaz, które są podobne (z 15 najlepszych – dokumentacja, z
5 – kariogramy); wytyczne układania kariogramu ISCN 2005 wg położenia i wielkości centromeru (od
największego)

Grupy chromosomów:
A – 1, 2, 3 – duże metacentryczne
B – 4, 5 – duże submetacentryczne
C – 6 – 12, X – średnie submetacentryczne
D – 13 – 15 – duże akrocentryczne
E – 16 – 18 – średnie metacentryczne
F – 19 – 20 – małe metacentryczne
G – 21 – 22, Y – małe akrocentryczne
+ na końcu układamy parę chromosomów płciowych

Czułość i rozdzielczość różnych metod oceny kariotypu:

 Metody cytogenetyki klasycznej ~3-5 Mpz, odsetek ludzi w populacji: 2-5%
 FISH ~40-250 kpz, 6%
 HR-CGH > 3Mpz, 10%
 CGH do mikromacierzy ~1mpz-20pz, 16-18%
 MLPA sekwencjonowanie ~40-1 pz, 30%

Przyczyna MPD to w 70% nierozpoznana choroba genetyczna!

Genetyka kliniczna – ćwiczenia 2012

Strona 3

Ćwiczenie 2
Temat: Aberracje chromosomowe.

Aberracja submikroskopowa – zmiana niewidoczna w mikroskopie świetlnym, jej identyfikacja
wymaga zastosowania czulszych metod, np. technik cytogenetyki molekularnej FISH.

Mozaikowatość – 2 lub kilka kompilacji komórek o różnym zestawie chromosomów w jednym
organizmie

Aberracje – zaburzenia w liczbie lub strukturze chromosomów; mutacje materiału genetycznego
widoczne pod mikroskopem świetlnym. Mogą dotyczyć autosomów, ch. XY; mogą powstawać de
novo lub dziedziczyć się.

- liczbowe (nieprawidłowa liczba chromosomów)

* aneuploidie - 2n – 1, 2n +1 (złe rozchodzenie się chromosomów lub chromoatyd
siostrzanych w anafazie = nondysjunkcja; np. monosomie, trisomie, podwójna
monosomia 2n-1-1; nullisomia 2n-2)
* poliploidie – 3n, 4n; (powstają: z zapłodnienia komórki jajowej przez 2 (dispermia)
lub więcej plemników, zaburzenia podziału zygoty, zaburzenia podziału dojrzałego
jaja lub plemnika i powstanie gamety diploidalnej; wielokrotność haploidalnej liczy
chromosomów)

- strukturalne (komórki somatyczne zawierają jeden lub więcej chromosomów
nieprawidłowych; mogą dotyczyć autosomów lub chromosomów płci):

* zrównoważone – nie ma zmiany w ilości materiału genetycznego, np. translokacja
wzajemna, inwersja; skutki nie zawsze są widoczne: zmiana ramki odczytu; są
przyczyną powstawania w mejozie gamet z nieprawidłowym zestawem
chromosomów. Może być przekazana na następne pokolenie jako zrównoważona lub
niezrównoważona
* niezrównoważone – zwiększenie materiału, np. duplikacja, addycja lub ubytek –
delecje; skutki fenotypowe są widoczne

Aberracje strukturalne:
- powstają w wyniku złamań chromosomów
- w miejscu złamania powstają lepkie końce, które zazwyczaj łączone są dzięki systemom
naprawczym
-częstość występowania jest większa pod wpływem promieniowania jonizującego lub chorób
dziedzicznych

a) Translokacje – przemieszczenie materiału genetycznego pomiędzy chromosomami (ale nie
utrata!); nosiciel jest zdrowy, ale potomstwo jest obarczone ryzykiem wystąpienia
niezrównoważonego kariotypu

- wzajemne – wymiana materiału między 2 chromosomami np. t(8;22)(q34;q11);
powstaje w wyniku złamań chromosomów niehomologicznych lub przez
przypadkową rekombinacje między chromosomami podczas mejozy
-niewzajemne
-zrównoważone (j.w.)
-niezrównoważone (j.w.)
- robertsonowskie = fuzje centryczne; dotyczy 2 chromosomów akrocentrycznych
grupy D/G, w których złamanie następuje w centromerze lub blisko niego; powstaje
chromosom z 2 centromerami; krótkie ramiona zawierające nieczynną genetycznie
heterochromatynę są eliminowane
- insercyjne – jeden chromosom ma 2 pęknięcia, a drugi jedno (w sumie 3 złamiania),
nosiciel jest zdrowy, a u potomstwa delecja lub duplikacja (nigdy obie zmiany
jednocześnie)

Genetyka kliniczna – ćwiczenia 2012

Strona 4

b) Inwersje – chromosom pęka w dwóch miejscach i dochodzi do odwrócenia materiału
genetycznego 180 stopni

- paracentryczne – złamanie w obrębie jednego ramienia i nie obejmuje centromeru
- pericentryczne – złamanie w obrębie obu ramion łącznie z centromerem

c) Delecje – utrata fragmentu chromosomu; powstaje w wyniku: utraty części chromosomu
między dwoma punktami złamań, niezrównoważonego crossing-over, rodzicielskiej
translokacji; fragment który uległ delecji jest acentryczny i jest eliminowany podczas
następnego podziału

- terminalna – złamanie w części dystalnej chromosomu
- interstycjalna – podwójne złamanie i połączenie dystalnych części chromosomu
- szczególny typ: chromosom pierścieniowy (p. dalej)
- mikrodelecje – j.w.

d) Duplikacje – podwojenie fragmentu chromosomu w wyniku nierównego crossing-over,
błędnych procesów zachodzących w mejozie u któregoś z rodziców; są mniej szkodliwe od
delecji
e) Izochromosom – powstaje w wyniku poprzecznego podziału centromeru; duplikacja
jednego ramienia i delecja drugiego; skutki fenotypowe: najczęściej ilościowe zmiany letalne,
jeżeli dotyczy ch. 21 - z. Downa (jeśli powstaną 3 sztuki 21(q), bo tam jest region krytyczny z.
Downa); najczęściej dotyczą ch. X(q) oraz Y;
f) Chromosom pierścieniowy (r) – powstaje przez jednoczesną delecję części dystalnej obu
ramion krótkich bądź długich jednego chromosomu  „lepkie” końce łączą się ze sobą;
często występuje w obrębie ch. X u kobiet z zespołem Turnera

Kariotyp prawidłowy: 46, XX lub 46, XY
Kariogram – graficzny zapis kariotypu
ISCN – sposób zapisywania kariotypów
46, XX [20] <- liczba analizowanych komórek
46, XX, t(2;5) <- rodzaj aberracji i zaangażowane chromosomy

Jeżeli aberracja chromosomowa obecna jest we wszystkich komórkach somatycznych, mówimy
wówczas o homogenności.
Mogą jednak istnieć różne linie komórkowe – z aberracja i bez, nazywamy to mozaikowością.
Może mieć również miejsce mozaikowatość gonadalna -> komórki somatyczne i gonady mają różny
kariotyp.

Ćwiczenie 3
Temat: Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ – FISH oraz inne nowoczesne metody stosowane w
genetyce i hematoonkologii (SKY, HR-CGH, aCGH)

FLUORESCENCYJNA HYBRYDYZACJA IN SITU (FISH)
FISH łączy w sobie elementy cytogenetyki klasycznej i metod molekularnych.
Zasada metody: hybrydyzacja - polega na tworzeniu dwuniciowych kompleksów między sondą
molekularną a badanym jednoniciowym fragmentem DNA lub RNA (zgodnie z zasadą
komplementarności).
Etapy FISH ogólnie:
-sporządzenie i wyznakowanie sondy
-przygotowanie preparatu
-denaturacja sondy i preparatu (termiczna, mocnymi kwasami i zasadami)
-hybrydyzacja

Genetyka kliniczna – ćwiczenia 2012

Strona 5

Sonda molekularna – fragment DNA, którego sekwencja nukleotydów jest specyficzna względem
badanego regionu. Sondą może być:
- syntetyczny lub naturalny gen lub jego fragment
- syntetyczny oligonukleotyd (<50 p.z.)
- cDNA
- fragment chromosomu
- fragment genomowego DNA

Metody otrzymywania sond:
- klonowanie odpowiedniego fragmentu DNA
- synteza chemiczna ( dla oligonukleotydu 20 – 50 pz)
- sondy złożone otrzymuje się przez klonowanie całego chromosomu, cięcie go enzymami
restrykcyjnymi, elektroforeza, denaturacja; wszystkie fragmenty znakuje się tym samym
fluorochromem.

Fluorochromy:
- rodamina – barwnik czerwony,
- FITC – zielony,
- czerwień Texasu – czerwony,
- DAPI – niebieski,
- Aqua – niebieski,
- Cyjanina C3 – pomarańczowy,
- TRIC – czerwony.
DAPI bardzo szybko wnika do struktur – można oglądać już po 5 min.!

FISH inter- i metafazalny:
Przygotowanie materiału:



materiał po hodowli k.k., rozmaz krwi lub szpik kostny, musi być utwardzony



szkiełko odtłuszczone



chromosomy nie mogą być w cytoplazmie, utrudniona jest penetracja sondy



materiał nie może być zbyt gęsto i zbyt rzadko naniesiony na szkiełko

Oceniamy 1-5 metafaz; u chorych na nowotwory interfaza (kom. nie dzielą się po chemioterapii)
Etapy FISH szczegółowo:

1) nałożenie materiału na szkiełko (odwodnienie szkiełka w szeregu alkoholi 70%, 80%, 99,8%

przez 2 minuty w każdym)

2) nałożenie odpowiedniej sondy molekularnej ogrzanej do temp 37 stopni
3) zaklejenie szkiełka klejem silikonowym
4) denaturacja materiału badanego i sondy (terminczna, chemiczna lub promieniowanie UV)
5) hybrydyzacja (w komorze wilgotnej, 37 stopni, 12h, ciemność)
6) odpłukanie niespecyficzne związanej sondy i sondy, która nie związała się wcale, w buforze

płuczącym PBD przez 2 min

7) nałożenie DAPI na analizowane pole i przykrycie szkiełkiem nakrywkowym
8) detekcja sondy (działanie promieniowaniem, które wzbudza świecenie znacznika)
9) analiza mikroskopowa

Detekcja sondy:

a. lampa rtęciowa – źródło promieniowania, które wzbudza emisję znacznika

fluoroscencyjnego

b. zestaw filtrów – przez który przechodzi promieniowanie o danej dł. Fali
c. mikroskop fluorescencyjny – obserwujemy emisję fluorochromu
d. aparat cyfrowy/system komputerowy – dokumentacja obserwowanego w

mikroskopie obrazu

Genetyka kliniczna – ćwiczenia 2012

Strona 6

Rodzaje sond molekularnych stosowanych w FISH:

1) specyficzne (unikatowe) – dla danej sekwencji DNA
2) złożone (malujące) – specyficzne dla całego chromosomu lub jego ramienia
3) komplementarne – do sekwencji powtórzonych

Sondy specyficzne (unikatowe):
- do identyfikacji mikrodelecji, submikroskopowych aberracji i genów fuzyjnych
- stosowane w czasie metafazy oraz dla jąder interfazalnych
- fuzje genowe – analizuje się przy białaczkach – 95% pacjentów z CML (ostra białaczka limfatyczna)
ma t(9;22)(q34;q11) z fuzją genową BCR/ABL1 (tzw. chromosom Philadelphia) i ABL1/BCR (9q+)
- identyfikacja pewnych genów istotnych w rozwoju nowotworów (np. gen p53

-Mikrodelecyjne zespoły:

• Williamsa 7q11.23
• Di George’a 22q11.2
• Millera-Diekera 17p13.3
• Cri du chat (kociego krzyku) 5p15
• Retinoblastoma 13q14
• Pradera-Willeeego/ Angelmana 15q12 ( w zależności od imprintingu genomowego)

Sondy złożone (malujące):
- specyficzne dla całego chromosomu z wył. centromeru
- tylko metafazy!
- do identyfikacji: chromosomów markerowych, dodatkowego materiału chromosomowego,
złożonych/ukrytych translokacji, aneuploidii, zaburzeń ilości chromosomów płci
Sondy komplementarne do sekwencji powtórzonych:
-

metafazy + interfazy

o centromerowe
o telomerowe
o komplementarne do regionów heterochromatyny konstytucyjnej

- stosowane w diagnostyce aneuploidii, hematoonkologii, do identyfikacji chromosomów
markerowych, aberracji chromosomowych i mozaikowatości komórek (np. allele zespołu Klinefeltera
czy Turnera)
- wykorzystuje się je przy przeszczepach, w celu sprawdzenia jak się przyjęły, gdy dawca i biorca
różnili się płcią = chimeryzm przeszczepowy)

Chromoprobe FISH:
-dla wykrywania białaczek (ALL, AML) gotowe testy do badania,
- niepełnosprawność intelektualna – utrata fragmentów sub-/telomerowych – 30%
- na charakterystyczne aneuploidie -> badania prenatalne
- bardzo szybki wynik
CGH, HR-CGH:
- hematoonkologia, genetyka kliniczna, gdy mamy materiał niezrównoważony rzędu 2 m p.z. i więcej
- krew/szpik -> izolacja DNA ->znakowanie fluorochromem ->2 probówka z wzorcowym DNA -> na
szkiełko wzorcowe z wzorcową metafazą -> współzawodnictwo o komplementarność między DNA
zrównoważonym i niezrównoważonym; jeśli więcej któregoś DNA to ono przyłączy się do metafaz
(więcej tego koloru fluorescencji)

Mikromacierze: jest to metoda bardzo dokładna (1 Mpz, a w niektórych sytuacjach nawet 10-100
kbp). Na bardzo małej płytce umieszczamy dużą ilość krótkich fragmentów DNA o znanych
sekwencjach. Mikromacierze kliniczne – umożliwiają wykrycie wszystkich mikrodelecji jakie znamy
(pacjentowi robi się screening) lub wykrycie aberracji subtelomerowych. Mikromacierze kliniczne –
analiza kariotypu w przypadkach kiedy fenotyp pacjenta nie odpowiada określonemu zespołowi
chromosomowemu.

Genetyka kliniczna – ćwiczenia 2012

Strona 7

Ćwiczenie 4 +7
Temat: Diagnostyka molekularna cz.1 + cz. 2.

1) Materiał do badań:



Krew obwodowa pobrana na EDTA (antykoagulant)



Śluzówka policzka



Komórki naskórka



Nasienie



Fibroblasty



Cebulki włosa



Inne komórki np. kosmówka, mięśnie itp.



Kości, zęby <- zwęglone zwłoki

2) Etapy izolacji DNA:



Wstępne przygotowanie materiału biologicznego do izolacji DNA:
W zależności od rodzaju i pochodzenia materiału wstępne przygotowanie może
obejmować oczyszczenie z różnego rodzaju zanieczyszczeń zewnętrznych, pożywki i
pozostałości innych komórek, a następnie rozdrobnienie, homogenizację, później
zawieszenie jednolitej masy w odpowiednim buforze



Liza komórek:
Lizę komórek prowadzi się w zależności od rodzaju komórek i tkanek np. poprzez:
homogenizację (miękkie tk. zwierzęce), rozcieranie (tk. roślinne, kom. bakteryjne),
lizę detergentami (komórki z hodowli komórkowych, krew), lizę enzymatyczną
(komórki bakteryjne, drożdżowe, krew). Destrukcji błony towarzyszy uwolnienie DNA
i innych komponentów komórkowych do roztworu.



Inaktywacja nukleaz komórkowych w celu zabezpieczenia DNA (np. proteinaza K)



Oddzielenie kwasu nukleinowego od pozostałych komponentów kom.:
W tym celu stosuje się m.in. sole (SDS), które degradują białka (także białka
histonowe)



Zagęszczenie preparatu DNA i usunięcie zanieczyszczeń małocząsteczkowych celem
uzyskania roztworu DNA o pożądanej czystości i gęstości. Po wytrąceniu (98%
etanolem) i przemyciu (70% etanolem) DNA pozostawia się do wyschnięcia i
następnie zawiesza się w małej objętości buforu o niskiej sile jonowej lub w wodzie.

3) Standardowe metody izolacji DNA:



Izolacja metodą ekstrakcji fenolowej



Izolacja z pełnej krwi z użyciem nadchloranu sodowego zamiast fenolu



Izolacja metodą odsalania białek



Izolacja z pełnej krwi metodą z użyciem Igepalu (IGEPAL – nazwa handlowa
preparatu)



Izolacja za pomocą kolumienek (najczęściej stosowana i najszybsza)



Izolacja automatyczna

4) Reakcja łańcuchowej polimerazy, PCR:
 Została opracowana w 1983 roku przez Kary’ego Mullisa, za co otrzymał on Nagrodę Nobla w

1993 roku

 Umożliwia specyficzną amplifikację (powielanie) in vitro wybranych odcinków DNA i RNA

(przepisanych na cDNA) dzięki wykorzystaniu dwóch starterów komplementarnych do
sekwencji docelowej

 Stanowi odwzorowanie procesu replikacji DNA, ponieważ dochodzi do syntezy

komplementarnej nici DNA

Genetyka kliniczna – ćwiczenia 2012

Strona 8

 Skład mieszaniny reakcyjnej:

-

Matryca (DNA, cDNA)

-

Polimeraza Taq

-

Bufor

-

Woda

-

Jony Mg

2+

-

Startery

-

Nukleotydy (dNTP)

 Matryca – DNA lub RNA przepisane na cDNA nie może być zdegradowane, ani

zanieczyszczone białkami, inhibitorami enz. (np. etanol, heparyna)

 Termostabilna polimeraza Taq - wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus, nie wykazuje

aktywności 3’-5’ egzonukleazy - jednego z mechanizmów naprawy błędów podczas syntezy
DNA, a więc nie ma możliwości naprawy błędów replikacji. replikacja zachodzi z prędkością
ok 1000 pz w czasie 30 s w temperaturze 72 stopni C. Główny enzym przeprowadzający PCR.

 Bufor – zapewnia odpowiednie warunki do działania polimerazy (pH 8,3-8,8), jest

dostarczany przez producenta do polimerazy

 Woda – środowisko reakcji
 Jony Mg

2+

- wiązane są przez startery, matrycę, polimerazę i dNTP; dokładność reakcji PCR

jest proporcjonalna do stężenia wolnych jonów Mg

2+

- z reguły stosuje się st. jonów nieco

większe niż stężenia dNTP, co zwiększa dokładność polimerazy

 Startery (primery) – zapewniają specyficzność reakcji; komplementarne do określonego

fragmentu nici DNA (matryca) oskrzydlającego analizowany fragment genu; są to krótkie ( 18-
28 nukleotydów), jednoniciowe fragmenty DNA; wyróżniamy 2 rodzaje starterów: forward i
reverse.

 Nukleotydy (dNTP) – dATP, dCTP, dGTP, dTTP
 Czas trwania: ok. 2 godz.
 Przebieg PCR: są to wielokrotnie (30-40) powtarzane 3-etapowe cykle:

I.

DANATURACJA (94-95 st. C) – rozplatanie podwójnej nici DNA, czas ok. 30-60 s

II.

WIĄZANIE STARTERÓW (40-65 st. C) – przyłączanie (hybrydyzacja) starterów do
matrycy ustalane doświadczalnie w zależności od składu nukleotydowego
starterów, czas ok. 30-60 s

III.

SYNTEZA NICI/ELONGACJA (72 st. C) - właściwa amplifikacja pożądanego
fragmentu genu przez polimerazę Taq

 Zastosowanie PCR:

-

Ginekologia, położnictwo – m. in. niepłodność (mutacja genu CFTR), nawracające
poronienia (analiza mutacji Leiden), przedwczesne wygaszanie czynności jajników
(ekspansja powtórzeń (CGG)

n

w genie FMR1)

-

Gastroenterologia – celiakia, choroba Wilsona, hemochromatoza, nietolerancja
laktozy typu dorosłego, fruktozemia, zespół Gilberta

-

Kardiologia – hipercholesterolemia (analiza mutacji genu LDLR oraz APOB),
zakrzepica żył (analiza mutacji genu MTHFR), zespół hipoplazji lewego serca (analiza
mutacji w genie GJA1), zespół wydłużonego QT

-

Neurologia – choroba Alzheimera (analiza mutacji genu PSEN1), drżenie samoistne,
wada cewy nerwowej, zespół łamliwego chromosomu X, choroba Huntingtona

-

Onkologia – badanie mutacji genu BRCA1, BRCA2 (nowotwory piersi, jajnika),
polipowatość jelita grubego, siatkówczak (retinoblastoma), rak rdzeniasty tarczycy,
czerniak

-

Okulistyka – zwyrodnienie siatkówki

-

Dermatologia – AZS, czerniak

-

Choroby metaboliczne, endokrynologia – choroba Gauchera, fenyloketonuria,
galaktozemia, niewrażliwość na hormony tarczycy, otyłość (analiza genu dla
receptora melanokortyny)

Genetyka kliniczna – ćwiczenia 2012

Strona 9

-

Inne: mukowiscydoza, tromobocytopenie (postać rodzinna), określanie płci pacjenta
(z poronienia lub gdy makroskopowo po urodzeniu lekarz nie może stwierdzić),
sekwencjonowanie genów, hybrydyzacja, monitorowanie leczenia, mikrobiologia
(HIV, prątki gruźlicy, H.pylori, Hepatitis virus A, B, C), ustalenie grupy krwi, medycyna
sądowa, farmakogenetyka (podawanie leków na miarę genomu pacjenta –
indywidualny polimorfizm)

5) Metoda PCR w czasie rzeczywistym (real time PCR, RT-PCR):



Umożliwia amplifikację danego fragmentu DNA z jednoczesną detekcją przyrostu ilości w
czasie rzeczywistym



Pomiar ilość produktu jest możliwy dzięki zastosowaniu technik fluorescencyjnych



Może być używany do jakościowych i ilościowych analiz materiału genetycznego –
wykrywanie zmian pojedynczych nukleotydów, np. pacjenci hematoonkologiczni



Różnica między RT-PCR a PCR: w mieszaninie mamy dodatkowo specyficzne sondy lub
SybrGreen



Rodzaje sond do RT-PCR:

o Sondy hybrydyzujące
o Sondy TaqMan
o Molecular Beacon
o I inne…



SybrGreen:

o Barwnik fluorescencyjny wiążący się z dwuniciowym DNA (dsDNA) – to nie jest

SONDA!

o Silnie i specyficznie wiąże się do mniejszej bruzdy DNA, dając silny sygnał wprost

proporcjonalny do ilości DNA

o Wzrastająca ilość nowosyntetyzowanych nici powoduje wzrost sygnału

fluorescencji

o Nie wiąże się do ssDNA (jednoniciowe DNA)
o SybrGreen rozpoznaje sekwencje niespecyficzne
o Nietoksyczny – teoretycznie :P
o Wykorzystywany do oceny ekspresji produktu



Sondy hybrydyzujące:

o Zbudowane z 2 cz. – każda wyznakowana barwnikiem fluorescencyjnym
o Są komplementarne do sekwencji bez lub z mutacją
o W obecności światła o określonej długości fali barwnik umieszczony na końcu

jednej z sond ulega wzbudzeniu i uwalnia energię



Sondy TaqMan:

o Jednoniciowa (20-30 pz)
o 1 koniec – barwnik fluorescencyjny
o 2 koniec – wygaszacz
o Gdy barwnik od wygaszacza zostanie oddzielony następuje emisja promieni ->

wiemy że jest mutacja

o Sonda niehybrydyzująca – brak fluorescencji
o W czasie PCR sonda przyłącza się do sekwencji między starterami



Molecular Beacon:

o 1-niciowa
o Tworzy strukturę spinki do włosów
o Końce są znakowane: jeden koniec fluorochromem, a drugi wygaszaczem
o W obecności komplementarnej sekwencji sonda rozwija się i hybrydyzuje do

matrycy

o Oddzielenie się od siebie fluorochromu i wygaszacza powoduje fluorescencję

Genetyka kliniczna – ćwiczenia 2012

Strona 10

o Bardzo duża czułość tej metody



Zasady RT-PCR:

o Wykonujemy minimum 3 powtórzenia dla danej próby (ze względu na

ograniczoną czułość)

o Kontrola pozytywna
o Kontrola negatywna (NTC – non template control)
o Wewnętrzna kontrola ilości ( np. β-aktyna)



Zastosowanie RT-PCR: wykrywanie mutacji i polimorfizmów, porównanie aktywności
genu, badanie lekooporności, monitorowanie choroby resztkowej, oznaczenie
zawartości GMO w produktach spożywczych, diagnostyka mikrobiologiczna i wirusologia

6) Sekwencjonowanie DNA: technika umożliwiająca ustalenie sekwencji (kolejności zasad) w

DNA, nie musimy przy tym bawić się w sondy, obecnie jest to zloty standard; najczęściej
sekwencjonowanie wykonuje się techniką Sangera.

Ludzki genom: ponad 3 mld pz z czego 2% to sekwencje kodujące (>20 tys. genów kodujących
białka, >8 tys. genów kodujących RNA, >12 tys. pseudogenów), a 98% to sekwencje
niekodujące (introny + sekwencje niekodujące)

Metoda Sangera (metoda „dideoksy”): jest to metoda enzymatyczna; punktem wyjścia jest
prąd PCR, następnie dodajemy dideoksynukleotydy (ddNTP zamiast dNTP). Do ddNTP
dołączony jest barwnik fluorescencyjny w różnych kolorach – wynik badania to
elektroforegram.

NGS (next generations sequencing) – w Polsce analizy całego genomu jeszcze nie
przeprowadza, koszt 1,5 tys $, czas 1 tydzień, problemem jest tylko odczyt wyników za
względu na ogromną ilość polimorfizmów w obrębie jednego genu; NGS jest to szybka, tania i
wydajna metoda, mało precyzyjna w porównaniu z Sangerem. Zastosowanie:
sekwencjonowanie całych genów, sekwencjonowanie wyłącznie eksonów.

MLPA – metoda do analizy mikrodelecji, na pograniczu cytogenetyki molekularnej; polega na
hybrydyzacji DNA z sondami; zastosowanie: diagnostyka prenatalna i nowotworowa

Genetyka kliniczna – ćwiczenia 2012

Strona 11

Ćwiczenie 5
Temat: Choroby monogenowe. Poradnictwo genetyczne.

Poradnictwo genetyczne – udzielenie pomocy osobom chorym lub osobom ryzyka genetycznego w
zrozumieniu istoty choroby dziedzicznej, sposobu jej dziedziczenia, a także przekazanie informacji o
istniejących możliwościach diagnostyki.
Cele poradni genetycznej:

1) Uzyskanie pełnej informacji o rozpoznanej chorobie genetycznej, jej przebiegu oraz

istniejących możliwości leczenia i rehabilitacji

2) Zrozumienie istoty genetycznego uwarunkowania choroby oraz ocena jej wystąpienia u

określonych członków rodziny

3) Właściwe zinterpretowanie ryzyka ponownego wystąpienia choroby u potomstwa
4) Przyjęcie takiego postępowania, które będzie wynikiem decyzji podjętej przez

konsultowanych w zgodzie z uzyskaną wiedzą, przekonaniem oraz uznawanymi celami
życiowymi

5) Podjęcie takich form działania, które umożliwiają optymalne przystosowanie chorego do

życia w środowisku oraz podjęcie działań zmierzających do zmniejszenia ryzyka ponownego
wystąpienia choroby w rodzinie.

Etapy poradnictwa genetycznego:



Ustalenie lub weryfikacja rozpoznania



Analiza rodowodu



Ustalenie ryzyka genetycznego



Przekazanie porady



Koordynacja działań terapeutycznych oraz rehabilitacyjnych (także planów prokreacyjnych)



Ocena efektywności porady

Odległość międzyźreniczna:
- większa od oczekiwanej: hiperteloryzm
- mniejsza od oczekiwanej: hipoteloryzm

Odległość międzykątowa wewnętrzna:
- większa od oczekiwanej przy prawidłowej odległości międzyźrenicznej -> telecanthus

1 cecha dysmorficzna to jeszcze NIE rozpoznanie choroby genetycznej!

Prawa G. Mendla:
I prawo czystości gamet: Z pary alleli do komórek rozrodczych (gamet) przechodzi tylko jeden allel a
prawdopodobieństwo połączenia się różnych gamet w procesie zapłodnienia jest jednakowe
II prawo niezależnej segregacji: Geny leżące na różnych chromosomach dziedziczą się niezależnie od
siebie.

Choroby autosomalne dominujące (AD):



Z reguły przynajmniej jedno z rodziców osoby chorej również jest chore



Choroba dotyka osoby obu płci

Zespół cech

morfologicznych

fenotyp

Rozpoznanie

kliniczne

+ wyniki badań

dodatkowych

+ piśmiennictwo,

POSSUM, LDDB

Genetyka kliniczna – ćwiczenia 2012

Strona 12



Ryzyko wystąpienia choroby u dziecka osoby chorej i zdrowej wynosi z reguły 50%



Występuje więcej chorób dominujących niż recesywnych



Rodzinna hipercholesterolemia – szybciej chorują mężczyźni, u kobiet z początku
łagodniejszy przebieg bo cholesterol jest potrzebny do produkcji estrogenów -> szybkie
nasilenie choroby po menopauzie



Mutacja w genie BRCA1 u mężczyzn powoduje wzrost ryzyka wystąpienia raka trzustki



Często są to choroby o późnym początku – w 3., 4., 5. dekadzie życia – np. nowotwory, ch.
Huntingtona, zespół Marfana. Możemy być dominującymi nosicielami – dopóki nie wystąpią
objawy chorobowe.



Zmienna ekspresja fenotypowa: np. nerwiakowłókniakowatość (Recklinghausena), zespół
Marfana



Zespół Noonan – AD; 4-41% przypadków rodzinnych; 3:1 częściej po matce, występowanie
1/1000; cechy dysmorficzne słabo zaznaczone: opadanie powiek, smutny wyraz twarzy,
płetwiasta szyja, niska linia włosów na karku, asymetryczne powieki, lekkie upośledzenie
umysłowe



Penetracja genu – odsetek osób, które mają mutcję + fenotyp do wszystkich osób z mutacją;
np. penetracja 60% kobiet z mutacją BRCA1 -> 60/100 kobiet zachoruje na raka piersi -> daje
nam to tzw. „luki genetyczne”; 100% penetracji – achondroplazja (objaw: karłowatość)



Choroba Huntingtona – postępująca choroba neurodegeneracyjna o późnym początku,
choroba jest monogenowa, autosomalna, dominująca: 4p16.3, gent IT15 -> białko
huntingtonina; objawy: demencja (otępienie podkorowe), zaniki neuronów w obrębie jądra
ogoniastego i zwojów podstawy (prążkowie) -> tam odkłada się białko, ruchy mimowolne i
trudność w ruchach zamierzonych, zmiany w zachowaniu. Czynnik etiologiczny: mutacja
dynamiczna w obrębie genu IT15; sama zmiana nie powoduje objawów choroby, dopiero po
zwielokrotnieniu wadliwej trójki nukleotydów pojawiają się objawy. W następnych
pokoleniach objawy występują szybciej i są cięższe

 10-26 (CAG)

n

– zakres prawidłowej liczby powtórzeń

 > 36 (CAG)

n

– patogenna ekspresja

 27-39 (CAG)

n

- problematyczna interpretacja wyników

o Allele pośrednie: 27-35 powtórzeń
o Allele o „niekompletnej penetracji”: 26-39 powtórzeń

Choroby autosomalne recesywne (AR):



Osoby takie mają z reguły zdrowych rodziców, będących bezobjawowymi nosicielami



Choroby dotykają obu płci



Często są charakterystyczne dla dennego terenu – jako przystosowanie ewolucyjne, „mutacje
założycielskie”



Ryzyko wystąpienia choroby gdy poprzednie dziecko jest chore wynosi z reguły 25%



Objawiają się wcześnie, objawy muszę być leczone, często są to choroby metaboliczne



Mukowiscydoza – zaburzenie transportu jonów sodowych i chlorkowych, gen CFTR



Fenyloketonuria (PKU):

o Nosicielstwo 1:46
o 420 różnych mutacji
o Mutacje R408W stanowi 2/3 wszystkich zachorowań
o Defekt enzymu rozkładającego fenyloalaninę (PAA, hydroksylaza fenyloalaninowa):

brak tyrozyny do syntezy hormonów i przekaźników, powstają toksyczne metabolity
fenyloalaniny które utrzymując się dłużej we krwi i płynach tkankowych powodują
toksyczne działanie na rozwijający się układ nerwowy dziecka

o Objawy: jasna karnacja, suche, szorstkie włosy, zaburzenia czynności tarczyc, efekt

toksyczny, mysi zapach moczu

Genetyka kliniczna – ćwiczenia 2012

Strona 13

o Skutki nierozpoznania/nieleczenia: upośledzenie umysłowe, małogłowie, drgawki,

hiperaktywność niekontrolowane ruchy

o Leczenie: dieta bez Phe wzbogacona w Tyr – powinna być stosowana do ukończenia

mielinizacji włókien nerwowych, a u kobiet przez cały okres rozrodczy (toksyczne
metabolity przechodzą przez łożysko!)

Choroby gonosmalne:
- Sprzężone z ch. X recesywne:



Chore głównie osoby płci męskiej



Chore dzieci zdrowych rodziców: matka jest zdrowym nosicielem i może mieć chorych
krewnych: hemofilia, daltonizm, DMD



Kobiety mogą być chore, gdy chory jest ojciec a matka jest nosicielką lub czasem na skutek
nielosowej inaktywacji chromosomy X

- Sprzężone z X dominujące:



Kobiety chorują częściej (zasady prawdopodobieństwa), dla mężczyzn często letalne



Rodzinna krzywica hipofosfatemiczna (FNR) – pseudoniedoborowa krzywica wit. D-oporna,
wynik zaburzonego wchłaniania fosforanów w kanalikach nerkowych. Rozpoznawana
najczęściej po 1 r.ż.: niski wzrost (<3 centyl), szpotawość, chód kaczkowaty, niskorosłość.
Nieleczeni dorośli 130-165 cm, dziewczynki mają łagodniejszy przebieg. Diagnostyka:
biochemiczna, radiologiczna, genetyczna

- Sprzężone z Y:



Gen SRY – ramię p – geny odpowiedzialne za rozwój jądra, za uruchomienie kaskady
mullerowskiej – zaburzenia powodują odwrócenie fenotypowej płci; ramię q – geny
spermatogenezy, region AZF, delecja -> zaburzenia spermatogenezy, utrudnienie płodności

Dziedziczenie mitochondrialne:



Duże odstępstwa od praw Mendla – ryzyko ciężkie do określenia



mitDNA także może podlegać mutacjom



najczęściej choroby nerwowo-mięśniowe



choroba Lebera – trwałe uszkodzenie nerwu wzrokowego (neuropatia Lebera), częstsza u
chłopców



najwięcej mitochondriów jest w mięśniach, mózgu, wątrobie -> tych narządów dotyczą
choroby dziedziczone z mitDNA



dziedziczenie od matki – komórka jajowa ma mitochondria bo żyje długo, a plemnik ma tylko
parę mitochondriów, które giną przy odrzuceniu witki podczas zapłodnienia

RYZYKO GENETYCZNE

• Jest oceniane jako prawdopodobieństwo wystąpienia zdefiniowanego zaburzenia
• Powinno być ocenione ilościowo
• Dotyczy zawsze określonej pary

- MAŁE < 5 % (ch. środowiskowe)
- ŚREDNIE 5 - 10 % (ch. wielogenowe, niektóre monogenowe)
- DUŻE > 10 % (zazwyczaj ch. monogenowe)

-Ryzyko teoretyczne:
- wyliczone z praw Mendla dla chorób jednogenowych, rodzinnych aberracji strukturalnych
chromosomów
- Ryzyko empiryczne:
- z obserwacji populacyjnych, dla chorób wielogenowych, aberracji liczbowych chromosomów,
zespołów wad

Genetyka kliniczna – ćwiczenia 2012

Strona 14

Ćwiczenie 6
Temat: Zespoły zaburzeń autosomów i heterosomów. Choroby poligenowe. Wady wrodzone.
Cechy dysmorficzne.

Dziedziczenie wielogenowe, wieloczynnikowe - odnosi się do tych procesów, w których choroba lub
wada jest rezultatem sumującego się efektu działania jednego lub wielu genów i czynników
środowiskowych
Cechy wielogenowe: wzrost, inteligencja, kolor skóry
Choroby dziedziczone wielogenowo: cukrzyca t. 1 i 2, RZS, nadciśnienie tętnicze, schizofrenia,
Alzheimer, nowotwory, wady wrodzone, miażdżyca.

Są to choroby bez cech dziedziczenia mendlowskiego z niecharakterystycznym ukł. rodowodu!

Często dana cecha u potomstwa wykazuje regresję do średniej, np. dzieci obojga rodziców muzyków
wcale nie muszę być muzykami, albo jak jest 2 wysokich rodziców to dziecko nie musi być wysokie

Ryzyko choroby u krewnych I rzędu:

- AD: 50%
- AR: 25%
- wielogenowe: 0,5-0,9%

W III stopniu pokrewieństwa – ryzyko tych chorób jest właściwie równe ryzyku populacyjnemu
Choroby wielogenowe występują częściej od monogenowych.
Im większa wada tym większe prawdopodobieństw dziedziczenia tej wady!

Czasami różne prawdopodobieństwo u różnej płci:
Kobiety: RZS, dyasplazja bioder
Mężczyźni: nadciśnienie, stopy końsko-szpotawe, wytrzewienie

WADY WRODZONE:

 Etiologia wad wrodzonych (wady wrodzone posiadają 2-3% noworodków):



Nieznana (50%)



Wielogenowa (20%)



Monogenowa



Chromosomalna (6%)



Infekcje wrodzone



Leki, alkohol

 Gdy znajdujemy jedną wadę, to szukamy następnej, gdyż zazwyczaj występują następczo.
 Wady budowy ciała:

• Malformacje – wady rozwojowe narządu lub części ciała powstające w wyniku zaburzenia

ich rozwoju w pierwszym trymestrze ciąży, co prowadzi do niepewnej lub nieprawidłowej
morfogenezy, np. po zażyciu talidomidu

• Deformacje – nieprawidłowości budowy, kształtu lub ułożenia jakiejś części ciała

spowodowane jej uciskiem wewnątrz macicy

• Dysrupcje – wady wynikające z zaburzenia prawidłowego dotychczas rozwoju danego

układu lub narządu

 Deformacje:
-

wady powstające zwykle w III trymestrze ciąży pod wpływem czynników mechanicznych

-

Przyczyny:

 wady rozwojowe macicy, np. macica dwurożna
 mała macica

Genetyka kliniczna – ćwiczenia 2012

Strona 15

 mała miednica
 guzy macicy (mięśniaki, włókniaki)
 małowodzie
 nieprawidłowe ułożenie płodu, duży płód
 choroby ograniczające możliwości poruszania się płodu – zaburzenia neurologiczne,

pierwotne choroby mięśni, wady stawów

- zdeformowaniu ulegają najczęściej kości, stawy i chrząstki
- po urodzeniu – widoczne w postaci:

- skręcenia lub skrzywienia kości
- ograniczenia ruchomości stawów
- spłaszczenia nosa i uszu

- większość deformacji podlega samoistnemu odkształceniu w ciągu kilku miesięcy lub lat
- sekwencja deformacyjna – gdy ucisk mechaniczny wywołuje wiele deformacji, np. sekwencja Potter

 Dysrupcje – zespół taśm owodniowych, np. podczas infekcji lub gdy matka ma defekt tkanek

kolagenowych. Płód zaplątuje się w taśmę -> może wystąpić martwica pierwotnie
prawidłowo wytworzonego narządu, tzw. amputacja wewnątrzmaciczna. są wadami
morfologicznymi wynikającymi z przerwania lub zakłócenia pierwotnie prawidłowego
procesu rozwojowego

-

w przeciwieństwie do deformacji – nie są wyłącznie skutkiem działania sił
mechanicznych, ale mogą być wywołane przez niedokrwienie, wylew krwi lub zrosty
tkankowe

-

mogą być skutkiem działania czynnika teratogennego lub pojawiać się z nieznanej
przyczyny

-

występują sporadycznie

 Wady cewy nerwowej (najczęstsze): holoprosencefalia (nierozejście się płatów czołowych),

przepuklina mózgowa (powstaje przez niezamknięcie się dolnego odcinka cewy nerwowej;
worek przepuklinowy może przechodzić np. przez gałkę oczną, gorsze rokowania dla worka
tylnego -> wada letalna), płody bezczaszkowe, bezmózgowe (100% letalność, niedobór kw.
foliowego, powikłania dla matki), przepuklina oponowo-rdzeniowa (najczęstsza z wad cewy
nerwowej, może być leczona wewnątrzmacicznie), przepuklina rdzeniowo-kręgowa
(niezamknięcie tylnego odc. cewy nerwowej, konsekwencje b. różne, częste problemy ze
zwieraczami i z chodzeniem), potworniak kości krzyżowo-guzicznej (rokuje stosunkowo
dobrze, poród poprzez cesarskie cięcie, guz jest dobrze unaczyniony - > może to powodować
przeciążenie serca -> niewydolność krążenia, często szybsze rozwiązanie ciąży)

 Kwas foliowy jest potrzebny do 21 dnia po zapłodnieniu (zamknięcie cewy nerwowej)!!!
 Wady serca
 Wady przewodu pokarmowego: np. przepuklina pępkowa (stosunkowo dobre rokowania,

jest jednym z markerów aneuploidii, im większa tym mniejsze ryzyko wystąpienia zespołu
genetycznego, jest wskazaniem do amniopunkcji), niedrożność przewodu pokarmowego

 Małogłowie (mikrocefalia) – może występować np. w zespole Edwardsa, toksoplazmozie,

fenyloketonurii lub też jako izolowana cecha dziedziczona recesywnie jako cecha
monogenowa (wtedy tylko cecha osobnicza)

 Wady kończyn
 Amelia – całkowity brak kończyny/kończyn
 Rozszczep wargi/podniebienia
 Wady małżowin usznych
 Wodobrzusze (cytomegalia)
 Macroglosia – za duży język, może towarzyszyć np. zespołowi Downa