Wykład: 
Genetyka bakterii fermentacji mlekowej 
 

 

Trochę historii 
1.  Badania  nad  genetyką  bakterii  fermentacji  mlekowej  rozpoczęto  dopiero  na  początku  lat  70-tych  ubiegłego 

stulecia. 

2.  Pierwsze badania dotyczyły plazmidów oraz naturalnego transferu genów u laktokoków. 
 
Obecny stan badań nad genetyką LAB 



 

Pogłębianie wiedzy z zakresu genetyki LAB: głównie transferu genów i inżynierii genetycznej LAB. 



 

To obecnie jedna z najważniejszych dziedzin mikrobiologii żywności. 

 
Budowa komórki bakteryjnej 
Lokalizacja genów 



 

Na chromosomie (nukleoidzie),   



 

Na pozachromosomowych kawałkach DNA zwanych plazmidami. 



 

Poszczególne gatunki bakterii różnią się między sobą wielkością genomu (wielkością DNA i ilością genów 
kodujących informację o komórce). 

 
Chromosom i plazmidy 
bp (z ang. base pairs) = par zasad = par nukleotydów 
 
Nukleoid   



 

Obszar komórki bakteryjnej (priokariotycznej) będący odpowiednikiem jądra komórkowego   
u organizmów wyższych (eukariotycznych),   



 

Nukleoid nie jest oddzielony od cytoplazmy otoczką jądrową,   



 

Zawiera genofor (chromosom bakteryjny), czyli pojedynczą, kolistą cząsteczkę DNA,   



 

Nukleoid wraz z plazmidami zawiera pełną informację genetyczną komórki (genom). 

 
Chromosom 



 

Jest to względnie mała, pojedyncza kolista cząsteczka DNA, o długości ok. 200 nm, zawiera 1,8  - 3,4 Mb 
(mln par zasad) (dla porównania: u ludzi genom ma długość 2 metrów i wielkość 3,5 - 5,6 mld pz),   



 

Niezwykle  długa  w  porównaniu  do  wielkości  komórek  bakteryjnych,  niezwykle  silne  poskręcana  (tzw. 
superhelikalny DNA), co pozwala na jej upakowanie w komórce bakteryjnej. 

Chromosom 



 

Prawie wszystkie geny u bakterii są zlokalizowane na chromosomie (reszta na plazmidach), 



 

Około 75 - 85% DNA chromosomu bakteryjnego to geny, pozostałe 15 - 25% to tzw. międzygenowy DNA, 
oddzielający poszczególne geny (w genomie człowieka te proporcje są odwrócone – tylko ok. 5% genomu 
koduje jakieś białka!). 



 

Niektóre geny w chromosomie są pogrupowane w rodziny zwane operonami, 



 

Operony  kodują  białka  związane  ze  sobą  funkcjami,  zaś  geny  w  jednym  operonie  są  regulowane  z 
skoordynowany sposób, 



 

Inne geny są rozmieszczone w chromosomie bakteryjnym przypadkowo. 



 

Terminy związane z elementami strukturalnymi chromosomu: 
- introny i eksony, 
- otwarta ramka odczytu (ORF), 
- transpozony. 

 

Introny i eksony 



 

Sekwencje kodujące informację są zwykle rozdzielone na serię odcinków DNA, zwanych eksonami. 



 

Eksony są porozdzielane przez introny, które nie zawierają użytecznych informacji, 



 

Przed  wykorzystaniem  informacji  biologicznej  genów  do  syntezy  białka,  introny  muszą  być  usunięte  z 
ciągu sekwencji kodującej,   



 

W komórkach bakteryjnych intronów jest niewiele. 

 
Otwarta ramka odczytu 



 

ORF – z ang. open reading frame,   



 

Jest to ciąg nukleotydów rozpoczynający się od kodonu startowego ATG i kończący kodonem końcowym. 
To znaczy, że ORF określa potencjalny gen, kodujący jakiś peptyd, 



 

Aby  dany  OFR  mógł  być  określony  jako  potencjalny  gen  musi  mieć  długość  co  najmniej  50  kodonów 
(kodon, inaczej triplet, jest to sekwencja 3 nukleotydów kodująca jeden aminokwas), 



 

Liczba ORF w genomie wskazuje na liczbę genów kodujących białka. 

 
Transpozony   



 

Są elementami sekwencji DNA zdolnymi do przemieszczania się w genomie (w bakteryjnym chromosomie 
i plazmidach), 



 

Mogą  być  wstawione  w  dowolnym  miejscu  chromosomu  lub  przenoszone  w  dowolne  miejsce  w 
chromosomie 



 

Są  to  elementy  niezależne  –  każdy  transpozon  koduje  enzym  transponazę,  katalizującą  transpozycję 
transpozonu. 



 

Są najprostszymi elementami ruchomymi.   



 

Występują u wielu LAB, 



 

Znanych jest wiele rodzajów transpozonów,   



 

Przykładem są sekwencje insercyjne (IS, z ang. insertion sequences), które mogą być przenoszone nawet z 
jednej  komórki  bakteryjnej  do  innej  podczas  koniugacji  komórek  (jednego  gatunku  lub  gatunków  blisko 
spokrewnionych) przy użyciu plazmidów. 



 

Zdolność do przemieszczania się w genomie oznacza, że mogą powodować mutację genów, do których są 
wprowadzone,   



 

Mogą  kodować  np.  zdolność  do  wytwarzania  nizyny,  fermentacji  sacharozy,  oporność  na  bakteriofagi, 
antybiotyki lub metale ciężkie  (i mogą te zdolności przekazywać innym bakteriom własnego gatunku lub 
gatunków blisko spokrewnionych). 



 

Rozprzestrzenianie się wankomycynooporności. Gen vanB gene (z lewej) na 64 kb transpozonie jest częścią 
250 kb elementu ruchomego przenoszonego z jednej komórki enterokoka do innej.   

 
Transpozony u LAB 



 

U szczepów Lac. lactis spotyka się 5 różnych sekwencji insercyjnych (IS) i u większości takich szczepów 
występują one w co najmniej dwóch kopiach, 



 

Niektóre szczepy posiadają koniugacyjne transpozony (wielkości 68 kbp),   



 

Sekwencje  IS  są  stwierdzane  również  u  bakterii  z  rodzaju  Lactobacillus  i  Leuconostoc,  ale  nie  u  Str. 
thermophilus.   

 
Plazmidy 



 

Są  kolistymi,  superzwiniętymi  dwuniciowymi  cząsteczkami  DNA,  występującymi  obok  chromosomu 
bakteryjnego prawie u wszystkich bakterii.   



 

Są  niezależnie  replikowanymi  cząsteczkami  DNA  (ich  replikacja  odbywa  się  niezależnie  od  replikacji 
chromosomu komórki), 



 

LAB  mają  plazmidy  w  różnej  liczbie  kopii: niskokopiowe  (liczba  kopii  1  -  50) i  wysokokopiowe  (liczba 
kopii 100 - x100).   



 

Nie są niezbędne dla życia - mogą być usunięte bez szkody dla komórki (nie kodują funkcji, które byłyby 
konieczne do jej życia, ale zwiększają różnorodność zajmowanych środowisk),   



 

Ilość  genów  zgromadzonych  w  plazmidach  odgrywa  znaczącą rolę  w  ewolucji  i zdolności  adaptacyjnych 
komórek, w których się znajdują.   



 

Niektóre małe plazmidy wykorzystują do replikacji (powielania się) enzymy komórkowe, większe plazmidy 
posiadają często geny kodujące własne enzymy replikacyjne, 



 

Istnieje wiele różnych plazmidów bakteryjnych,   



 

Poszczególne gatunki bakterii mogą posiadać nawet kilka typów plazmidów, ale nie muszą   
posiadać wszystkich. 

 
5 typów plazmidów 



 

Typu R – zawierają geny kodujące oporność np. na antybiotyki, bakteriocyny, metale ciężkie. 
Mogą przenosić oporność na antybiotyki między gatunkami bakterii, co ma ogromne znaczenie   
w pojawianiu się antybiotykoopornych szczepów bakterii patogennych.   
Powszechne stosowanie antybiotyków w lecznictwie, doprowadziło do rozpowszechnienia się plazmidów R   
wśród chorobotwórczych bakterii.   



 

Typu  F  i  umożliwiają  przenoszenie  genów  między  komórkami  bakteryjnymi  w  procesie  zwanym 
koniugacją.   
Mogą zawierać dodatkowe geny, przejęte z chromosomu, które są przenoszone do drugiej komórki podczas 
koniugacji. 



 

Kolicynowe – na których zlokalizowane są geny kodujące białka zabijające inne bakterie (bakterioncyny). 



 

Degradacyjne  –  kodujące  białka  pozwalające  metabolizować  nietypowe  związki  chemiczne,  np.  toluen, 
nikotynę. 



 

Wirulencji – kodujące zdolność wywoływania chorób. 

 
Plazmidy u LAB 



 

Są powszechniejsze u laktokoków niż u pałeczek mlekowych, 



 

Większość szczepów laktokoków zawiera po 4 - 7 różnych plazmidów, 



 

Często spotykane u pałeczek mlekowych i pediokoków,   



 

Czasami  stwierdzane  u  Str.  thermophilus,  Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  bulgaricus  i  pałeczek 
pochodzenia jelitowego. 

 
Plazmidy u laktokoków 
1.  Mają  szczególne  znaczenie,  gdyż  warunkują  cechy  użyteczne  dla  bakterii  -  kodują  istotne  dla  procesu 

fermentacji mlekowej takie zdolności bakterii, jak: 
- metabolizm cukrów, np. laktozy i galaktozy,   
- aktywność proteinaz (aktywność proteolityczna),   
- transport oligopeptydów,   
- oporność na bakteriofagi i bakteriocyny,   
- wytwarzanie egzopolisacharydów (EPS), 
- wykorzystanie kwasu cytrynowego (fermentacja cytrynianów). 

Zaburzenia  w  replikacji  lub  zmiana  warunków  środowiskowych  (np.  temperaturowych)  bytowania  komórek 
bakteryjnych powodują, że bakterie gubią plazmidy,   
Gubienie plazmidów przez komórki bakteryjne powoduje brak stabilności cech szczepów przemysłowych podczas 
przeszczepiania i pasażowania (np. utratę zdolności fermentacji laktozy, cech proteolitycznych, oporności na fagi lub 
bakteriocyny). 
 
Problemy z plazmidami u LAB 



 

Komórka  bezplazmidowa  DAJE  w  następnym  pokoleniu  już  tylko  komórki  bezplazmidowe,  a  ta,  która 
zawiera jeszcze plazmidy MOŻE dać potomstwo bezplazmidowe. 



 

LAB posiadają 2 typy plazmidów: 
-  teta  -  o  masie  ponad  10  tys.  par  zasad,  w  trakcie  replikacji  daje  2  identyczne,  stabilne  cząsteczki 
plazmidów   
-  RCR  (rolling-circle  replicating)  -  o  masie  ok.  10  tys.  par  zasad,  wysokokopiowe,  ale  niestabilne,  przy 
zaburzeniach w replikacji może dać komórki bezplazmidowe. 



 

Małe plazmidy  (< 5 kb) stwierdzane u Lactobacillus spp., podobnie jak wiele innych plazmidów  bakterii 
Gram-dodatnich, wykazują organizację modułową i są replikowane jak plazmidy RCR.   

 

Wymiana informacji genetycznej między LAB 
1.  Koniugacja 
2.  Transdukcja 
3.  Transformacja 
 
Koniugacja   
1.  Koniugacja wymaga bezpośredniego kontaktu komórek,   
2.  Zachodzi za pośrednictwem plazmidów, głównie typu F, przenoszenie jest kierowane przez geny   

znajdujące się w plazmidach. 

3.  Przenoszonym materiałem genetycznym może być plazmid lub fragment chromosomu, który jest transferowany 

dzięki plazmidowi. 

4.  Plazmid  F  może  być  autonomiczny  lub  zintegrowany  z  chromosomem  bakterii  (ten  drugi  przypadek  ułatwia 

przeniesienie genów do innej komórki bakteryjnej w procesie koniugacji). 

 
Transdukcja   
LAB  mogą  pozyskiwać  nowe  geny  poprzez  transdukcję,  czyli  przeniesienie  materiału  genetycznego  z 
wykorzystaniem bakteriofagów. Zazwyczaj przenoszony jest tylko mały fragment DNA. Nie wszystkie bakteriofagi 
mają zdolność do transdukcji, nie każda bakterię można transdukować.   
 
Transformacja   



 

Metodą transformacji, czyli przekazania  genów w formie rozpuszczalnego DNA, uwolnionego z komórek 
bakteryjnych. Ten sposób przekazywania genów między bakteriami został wykryty jako pierwszy. 



 

W  warunkach  in  vitro  transformacja  polega  na  wymieszaniu  czystych  hodowli  bakteryjnych  z 
wyizolowanym  i  oczyszczonym  DNA,  pobranym  od  innych  bakterii.  Te  komórki,  które  pobrały  DNA,  są 
następnie selekcjonowane i namnażane w hodowlach.   



 

Metoda  transformacji  jest  wykorzystywana  w  laboratoriach  do mapowania  (poznawania) i manipulowania 
informacją genetyczną (modyfikacji genetycznych). 



 

Sposoby transformacji: 
- kompetencja (naturalna zdolność niektórych gatunków bakterii do pobierania DNA, np. Streptococcus), 
- indukcja kompetencji różnymi zabiegami (u komórek niezdolnych do kompetencji naturalnej), 
- protoplastyzacja komórek Gram-dodatnich, 
-  elektroporacja  (zmiana  przepuszczalności  błon  biologicznych  pod  wpływem  pola  elektrycznego  i 
transformacja plazmidowego DNA). 

 
Po co nam wiedza o genach LAB? 



 

Ułatwia  lub  umożliwia  bardzo  dokładną  klasyfikację  i  identyfikację  LAB  (homologia  genów,  głównie 
sekwencjonowanie i porównanie fragmentów restrykcyjnych 16S rDNA w reakcji PCR). 



 

drzewo filogenetyczne oparte na 16S rRNA 



 

Ale poznanie sekwencji genów to nie jest wszystko - trzeba jeszcze poznać białka, które są kodowane   
i ich właściwości. 



 

Pozwala na poznanie narzędzi (np. wektorów plazmidowych)do udoskonalania szczepów LAB   
stosowanych przemysłowo. 



 

Umożliwia otrzymanie nowych szczepów LAB o lepszych lub nowych właściwościach:   
-  zdolnościach  fermentacyjnych  lub  wzrostowych  (np.  szybsza  fermentacja,  lepsze  cechy  sensoryczne 
żywności fermentowanej, hamowanie rozwoju patogenów lub mikroflory psującej żywność),   
- brak wytwarzania niepożądanych substancji ubocznych fermentacji, np. gorzkich peptydów,   
- większej odporności na czynniki stresowe   
lub bakteriofagi. 



 

Umożliwia otrzymanie szczepów LAB o nowych właściwościach, np.:   
-  wytwarzania  substancji  antybiotycznych,  utrwalających  żywność,  składników  odżywczych  (takich  jak 
witaminy, aminokwasy),   
-  rozkładania  lub  neutralizacji  substancji  szkodliwych,  np.  alergenów,  mykotoksyn,  metali  ciężkich, 
cholesterolu. 



 

Możliwość wykorzystania LAB dla poprawy zdrowia ludzi (profilaktycznie i jako terapeutyki, bez skutków 
ubocznych dla organizmu człowieka). 



 

Możliwość regulacji szlaków metabolicznych LAB 

 
Najnowsze efekty? 



 

Regulacja metabolizmu aminokwasów i peptydów podczas wzrostu w mleku proteinazo-dodatnich (Prt+) i 
-ujemnych (Prt-) szczepów Lactococcus lactis. 



 

Badania  nad  zwalczaniem  bakterii  patogennych  metodą  alternatywną  do  antybiotyków,  przy  użyciu 
plazmidów, zwaną strategią „Konia trojańskiego”. 



 

Strategia  „Konia  trojańskiego”  polega  na  zabiciu  patogennej  bakterii  przez  wprowadzenie  zabójczego 
plazmidu przy pomocy koniugacji z komórką nieszkodliwej bakterii.   



 

Bakterie mlekowe być może pomogą walczyć z AIDS. Naukowcom z Brown Medical School w USA udało 
się  zmodyfikować  bakterie  mlekowe  w  ten  sposób,  że  wytwarzają  lek  przeciwko  HIV  (białko  nazwane 
cynowiryną, które łączy się z wirusem HIV i zapobiega jego przyłączeniu do komórek błony śluzowej). 



 

Zespół naukowców dokonał tego używając metody elektroporacji. Przez komórki bakterii, zawieszone   
w  roztworze  ochronnym  (PEG,  glikol  polietylenowy),  przepuścili  impulsy  silnego  prądu  stałego. 
Spowodowało  to  utworzenie  małych  porów  w  błonie  komórkowej  bakterii.  Dzięki  temu,  zawieszone  w 
roztworze  cząsteczki  DNA  mogły  wniknąć  do  wnętrza  komórek  bakteryjnych  i  bakterie  zaczęły 
produkować białko, którego gen został do nich wprowadzony.