Wykład:
Genetyka bakterii fermentacji mlekowej

Trochę historii
1. Badania nad genetyką bakterii fermentacji mlekowej rozpoczęto dopiero na początku lat 70-tych ubiegłego

stulecia.

2. Pierwsze badania dotyczyły plazmidów oraz naturalnego transferu genów u laktokoków.

Obecny stan badań nad genetyką LAB



Pogłębianie wiedzy z zakresu genetyki LAB: głównie transferu genów i inżynierii genetycznej LAB.



To obecnie jedna z najważniejszych dziedzin mikrobiologii żywności.

Budowa komórki bakteryjnej
Lokalizacja genów



Na chromosomie (nukleoidzie),



Na pozachromosomowych kawałkach DNA zwanych plazmidami.



Poszczególne gatunki bakterii różnią się między sobą wielkością genomu (wielkością DNA i ilością genów
kodujących informację o komórce).

Chromosom i plazmidy
bp (z ang. base pairs) = par zasad = par nukleotydów

Nukleoid



Obszar komórki bakteryjnej (priokariotycznej) będący odpowiednikiem jądra komórkowego
u organizmów wyższych (eukariotycznych),



Nukleoid nie jest oddzielony od cytoplazmy otoczką jądrową,



Zawiera genofor (chromosom bakteryjny), czyli pojedynczą, kolistą cząsteczkę DNA,



Nukleoid wraz z plazmidami zawiera pełną informację genetyczną komórki (genom).

Chromosom



Jest to względnie mała, pojedyncza kolista cząsteczka DNA, o długości ok. 200 nm, zawiera 1,8 - 3,4 Mb
(mln par zasad) (dla porównania: u ludzi genom ma długość 2 metrów i wielkość 3,5 - 5,6 mld pz),



Niezwykle długa w porównaniu do wielkości komórek bakteryjnych, niezwykle silne poskręcana (tzw.
superhelikalny DNA), co pozwala na jej upakowanie w komórce bakteryjnej.

Chromosom



Prawie wszystkie geny u bakterii są zlokalizowane na chromosomie (reszta na plazmidach),



Około 75 - 85% DNA chromosomu bakteryjnego to geny, pozostałe 15 - 25% to tzw. międzygenowy DNA,
oddzielający poszczególne geny (w genomie człowieka te proporcje są odwrócone – tylko ok. 5% genomu
koduje jakieś białka!).



Niektóre geny w chromosomie są pogrupowane w rodziny zwane operonami,



Operony kodują białka związane ze sobą funkcjami, zaś geny w jednym operonie są regulowane z
skoordynowany sposób,



Inne geny są rozmieszczone w chromosomie bakteryjnym przypadkowo.



Terminy związane z elementami strukturalnymi chromosomu:
- introny i eksony,
- otwarta ramka odczytu (ORF),
- transpozony.

Introny i eksony



Sekwencje kodujące informację są zwykle rozdzielone na serię odcinków DNA, zwanych eksonami.



Eksony są porozdzielane przez introny, które nie zawierają użytecznych informacji,



Przed wykorzystaniem informacji biologicznej genów do syntezy białka, introny muszą być usunięte z
ciągu sekwencji kodującej,



W komórkach bakteryjnych intronów jest niewiele.

Otwarta ramka odczytu



ORF – z ang. open reading frame,



Jest to ciąg nukleotydów rozpoczynający się od kodonu startowego ATG i kończący kodonem końcowym.
To znaczy, że ORF określa potencjalny gen, kodujący jakiś peptyd,



Aby dany OFR mógł być określony jako potencjalny gen musi mieć długość co najmniej 50 kodonów
(kodon, inaczej triplet, jest to sekwencja 3 nukleotydów kodująca jeden aminokwas),



Liczba ORF w genomie wskazuje na liczbę genów kodujących białka.

Transpozony



Są elementami sekwencji DNA zdolnymi do przemieszczania się w genomie (w bakteryjnym chromosomie
i plazmidach),



Mogą być wstawione w dowolnym miejscu chromosomu lub przenoszone w dowolne miejsce w
chromosomie



Są to elementy niezależne – każdy transpozon koduje enzym transponazę, katalizującą transpozycję
transpozonu.



Są najprostszymi elementami ruchomymi.



Występują u wielu LAB,



Znanych jest wiele rodzajów transpozonów,



Przykładem są sekwencje insercyjne (IS, z ang. insertion sequences), które mogą być przenoszone nawet z
jednej komórki bakteryjnej do innej podczas koniugacji komórek (jednego gatunku lub gatunków blisko
spokrewnionych) przy użyciu plazmidów.



Zdolność do przemieszczania się w genomie oznacza, że mogą powodować mutację genów, do których są
wprowadzone,



Mogą kodować np. zdolność do wytwarzania nizyny, fermentacji sacharozy, oporność na bakteriofagi,
antybiotyki lub metale ciężkie (i mogą te zdolności przekazywać innym bakteriom własnego gatunku lub
gatunków blisko spokrewnionych).



Rozprzestrzenianie się wankomycynooporności. Gen vanB gene (z lewej) na 64 kb transpozonie jest częścią
250 kb elementu ruchomego przenoszonego z jednej komórki enterokoka do innej.

Transpozony u LAB



U szczepów Lac. lactis spotyka się 5 różnych sekwencji insercyjnych (IS) i u większości takich szczepów
występują one w co najmniej dwóch kopiach,



Niektóre szczepy posiadają koniugacyjne transpozony (wielkości 68 kbp),



Sekwencje IS są stwierdzane również u bakterii z rodzaju Lactobacillus i Leuconostoc, ale nie u Str.
thermophilus.

Plazmidy



Są kolistymi, superzwiniętymi dwuniciowymi cząsteczkami DNA, występującymi obok chromosomu
bakteryjnego prawie u wszystkich bakterii.



Są niezależnie replikowanymi cząsteczkami DNA (ich replikacja odbywa się niezależnie od replikacji
chromosomu komórki),



LAB mają plazmidy w różnej liczbie kopii: niskokopiowe (liczba kopii 1 - 50) i wysokokopiowe (liczba
kopii 100 - x100).



Nie są niezbędne dla życia - mogą być usunięte bez szkody dla komórki (nie kodują funkcji, które byłyby
konieczne do jej życia, ale zwiększają różnorodność zajmowanych środowisk),



Ilość genów zgromadzonych w plazmidach odgrywa znaczącą rolę w ewolucji i zdolności adaptacyjnych
komórek, w których się znajdują.



Niektóre małe plazmidy wykorzystują do replikacji (powielania się) enzymy komórkowe, większe plazmidy
posiadają często geny kodujące własne enzymy replikacyjne,



Istnieje wiele różnych plazmidów bakteryjnych,



Poszczególne gatunki bakterii mogą posiadać nawet kilka typów plazmidów, ale nie muszą
posiadać wszystkich.

5 typów plazmidów



Typu R – zawierają geny kodujące oporność np. na antybiotyki, bakteriocyny, metale ciężkie.
Mogą przenosić oporność na antybiotyki między gatunkami bakterii, co ma ogromne znaczenie
w pojawianiu się antybiotykoopornych szczepów bakterii patogennych.
Powszechne stosowanie antybiotyków w lecznictwie, doprowadziło do rozpowszechnienia się plazmidów R
wśród chorobotwórczych bakterii.



Typu F i umożliwiają przenoszenie genów między komórkami bakteryjnymi w procesie zwanym
koniugacją.
Mogą zawierać dodatkowe geny, przejęte z chromosomu, które są przenoszone do drugiej komórki podczas
koniugacji.



Kolicynowe – na których zlokalizowane są geny kodujące białka zabijające inne bakterie (bakterioncyny).



Degradacyjne – kodujące białka pozwalające metabolizować nietypowe związki chemiczne, np. toluen,
nikotynę.



Wirulencji – kodujące zdolność wywoływania chorób.

Plazmidy u LAB



Są powszechniejsze u laktokoków niż u pałeczek mlekowych,



Większość szczepów laktokoków zawiera po 4 - 7 różnych plazmidów,



Często spotykane u pałeczek mlekowych i pediokoków,



Czasami stwierdzane u Str. thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus i pałeczek
pochodzenia jelitowego.

Plazmidy u laktokoków
1. Mają szczególne znaczenie, gdyż warunkują cechy użyteczne dla bakterii - kodują istotne dla procesu

fermentacji mlekowej takie zdolności bakterii, jak:
- metabolizm cukrów, np. laktozy i galaktozy,
- aktywność proteinaz (aktywność proteolityczna),
- transport oligopeptydów,
- oporność na bakteriofagi i bakteriocyny,
- wytwarzanie egzopolisacharydów (EPS),
- wykorzystanie kwasu cytrynowego (fermentacja cytrynianów).

Zaburzenia w replikacji lub zmiana warunków środowiskowych (np. temperaturowych) bytowania komórek
bakteryjnych powodują, że bakterie gubią plazmidy,
Gubienie plazmidów przez komórki bakteryjne powoduje brak stabilności cech szczepów przemysłowych podczas
przeszczepiania i pasażowania (np. utratę zdolności fermentacji laktozy, cech proteolitycznych, oporności na fagi lub
bakteriocyny).

Problemy z plazmidami u LAB



Komórka bezplazmidowa DAJE w następnym pokoleniu już tylko komórki bezplazmidowe, a ta, która
zawiera jeszcze plazmidy MOŻE dać potomstwo bezplazmidowe.



LAB posiadają 2 typy plazmidów:
- teta - o masie ponad 10 tys. par zasad, w trakcie replikacji daje 2 identyczne, stabilne cząsteczki
plazmidów
- RCR (rolling-circle replicating) - o masie ok. 10 tys. par zasad, wysokokopiowe, ale niestabilne, przy
zaburzeniach w replikacji może dać komórki bezplazmidowe.



Małe plazmidy (< 5 kb) stwierdzane u Lactobacillus spp., podobnie jak wiele innych plazmidów bakterii
Gram-dodatnich, wykazują organizację modułową i są replikowane jak plazmidy RCR.

Wymiana informacji genetycznej między LAB
1. Koniugacja
2. Transdukcja
3. Transformacja

Koniugacja
1. Koniugacja wymaga bezpośredniego kontaktu komórek,
2. Zachodzi za pośrednictwem plazmidów, głównie typu F, przenoszenie jest kierowane przez geny

znajdujące się w plazmidach.

3. Przenoszonym materiałem genetycznym może być plazmid lub fragment chromosomu, który jest transferowany

dzięki plazmidowi.

4. Plazmid F może być autonomiczny lub zintegrowany z chromosomem bakterii (ten drugi przypadek ułatwia

przeniesienie genów do innej komórki bakteryjnej w procesie koniugacji).

Transdukcja
LAB mogą pozyskiwać nowe geny poprzez transdukcję, czyli przeniesienie materiału genetycznego z
wykorzystaniem bakteriofagów. Zazwyczaj przenoszony jest tylko mały fragment DNA. Nie wszystkie bakteriofagi
mają zdolność do transdukcji, nie każda bakterię można transdukować.

Transformacja



Metodą transformacji, czyli przekazania genów w formie rozpuszczalnego DNA, uwolnionego z komórek
bakteryjnych. Ten sposób przekazywania genów między bakteriami został wykryty jako pierwszy.



W warunkach in vitro transformacja polega na wymieszaniu czystych hodowli bakteryjnych z
wyizolowanym i oczyszczonym DNA, pobranym od innych bakterii. Te komórki, które pobrały DNA, są
następnie selekcjonowane i namnażane w hodowlach.



Metoda transformacji jest wykorzystywana w laboratoriach do mapowania (poznawania) i manipulowania
informacją genetyczną (modyfikacji genetycznych).



Sposoby transformacji:
- kompetencja (naturalna zdolność niektórych gatunków bakterii do pobierania DNA, np. Streptococcus),
- indukcja kompetencji różnymi zabiegami (u komórek niezdolnych do kompetencji naturalnej),
- protoplastyzacja komórek Gram-dodatnich,
- elektroporacja (zmiana przepuszczalności błon biologicznych pod wpływem pola elektrycznego i
transformacja plazmidowego DNA).

Po co nam wiedza o genach LAB?



Ułatwia lub umożliwia bardzo dokładną klasyfikację i identyfikację LAB (homologia genów, głównie
sekwencjonowanie i porównanie fragmentów restrykcyjnych 16S rDNA w reakcji PCR).



drzewo filogenetyczne oparte na 16S rRNA



Ale poznanie sekwencji genów to nie jest wszystko - trzeba jeszcze poznać białka, które są kodowane
i ich właściwości.



Pozwala na poznanie narzędzi (np. wektorów plazmidowych)do udoskonalania szczepów LAB
stosowanych przemysłowo.



Umożliwia otrzymanie nowych szczepów LAB o lepszych lub nowych właściwościach:
- zdolnościach fermentacyjnych lub wzrostowych (np. szybsza fermentacja, lepsze cechy sensoryczne
żywności fermentowanej, hamowanie rozwoju patogenów lub mikroflory psującej żywność),
- brak wytwarzania niepożądanych substancji ubocznych fermentacji, np. gorzkich peptydów,
- większej odporności na czynniki stresowe
lub bakteriofagi.



Umożliwia otrzymanie szczepów LAB o nowych właściwościach, np.:
- wytwarzania substancji antybiotycznych, utrwalających żywność, składników odżywczych (takich jak
witaminy, aminokwasy),
- rozkładania lub neutralizacji substancji szkodliwych, np. alergenów, mykotoksyn, metali ciężkich,
cholesterolu.



Możliwość wykorzystania LAB dla poprawy zdrowia ludzi (profilaktycznie i jako terapeutyki, bez skutków
ubocznych dla organizmu człowieka).



Możliwość regulacji szlaków metabolicznych LAB

Najnowsze efekty?



Regulacja metabolizmu aminokwasów i peptydów podczas wzrostu w mleku proteinazo-dodatnich (Prt+) i
-ujemnych (Prt-) szczepów Lactococcus lactis.



Badania nad zwalczaniem bakterii patogennych metodą alternatywną do antybiotyków, przy użyciu
plazmidów, zwaną strategią „Konia trojańskiego”.



Strategia „Konia trojańskiego” polega na zabiciu patogennej bakterii przez wprowadzenie zabójczego
plazmidu przy pomocy koniugacji z komórką nieszkodliwej bakterii.



Bakterie mlekowe być może pomogą walczyć z AIDS. Naukowcom z Brown Medical School w USA udało
się zmodyfikować bakterie mlekowe w ten sposób, że wytwarzają lek przeciwko HIV (białko nazwane
cynowiryną, które łączy się z wirusem HIV i zapobiega jego przyłączeniu do komórek błony śluzowej).



Zespół naukowców dokonał tego używając metody elektroporacji. Przez komórki bakterii, zawieszone
w roztworze ochronnym (PEG, glikol polietylenowy), przepuścili impulsy silnego prądu stałego.
Spowodowało to utworzenie małych porów w błonie komórkowej bakterii. Dzięki temu, zawieszone w
roztworze cząsteczki DNA mogły wniknąć do wnętrza komórek bakteryjnych i bakterie zaczęły
produkować białko, którego gen został do nich wprowadzony.