739
Streszczenie
Wstęp: wykorzystywanie potencjału autoregeneracji
w celu odtwarzania i zastępowania tkanek z zasto-
sowaniem własnych komórek pacjenta stanowi ele-
ment nowego podejścia do leczenia – medycyny re-
generacyjnej. Tego typu postępowanie terapeutyczne
jest już stosowane w chirurgii szczękowo-twarzowej
oraz chirurgii stomatologicznej. Medycyna i biolo-
gia regeneracyjna stwarzają interesujące perspek-
tywy także w stomatologii: możliwość uzyskania
funkcjonalnych żywych zębów metodami in vitro,
potencjalnej alternatywy do współczesnych metod
uzupełniania braków uzębienia.
Cel pracy: niniejszy artykuł przedstawia główne
założenia, podstawy doświadczalne oraz kierunki
badań w dziedzinie biologicznego uzyskiwania zęba
zastępczego.
Podsumowanie: prace nad uzyskaniem biologiczne-
go zęba zastępczego prowadzone są w wielu ośrod-
kach i można w nich wyróżnić dwa główne nurty:
wywodzący się z inżynierii tkankowej oraz opierają-
cy się na biologii rozwoju i embriologii. Podstawo-
wą różnicę między obu podejściami można opisać
następująco: w podejściu inżynieryjnym dąży się do
skonstruowania zęba z wykorzystaniem rusztowań
z materiałów biozastępczych, zaś w podejściu bio-
logicznym/embrionalnym do stworzenia warunków
uruchamiających naturalne mechanizmy rozwoju
zęba. Perspektywa zastosowań klinicznych jest jesz-
cze odległa i wymagać będzie pogłębienia wiedzy na
temat wielu mechanizmów biologii zęba.
Medycyna regeneracyjna w stomatologii
– „ząb z próbówki” – stan zaawansowania badań
nad uzyskaniem żywych zębów zastępczych
Regenerative medicine in dentistry – “a test-tube tooth”
– current state of research on vital substitute teeth (bioteeth)
Ewa Olender
1
,
Artur Kamiński
1, 2
,
Izabela Uhrynowska-Tyszkiewicz
1
,
Hubert Wanyura
2
1
Z Zakładu Transplantologii i Centralnego Banku Tkanek WUM,
Kierownik: dr hab. med. A. Kamiński
2
Z Kliniki Chirurgii Czaszkowo-Szczękowo-Twarzowej WUM, Kierownik: prof. dr hab. med. H. Wanyura
Summary
Introduction: Reconstruction and regeneration of
tissues through the use of patient’s own cells and
the induction of the autoregenerative potential
are elements of a new approach towards medical
treatment – the regenerative medicine. This kind of
treatment is already practised in maxillofacial and
oral surgery. Regenerative medicine and biology
also create interesting prospects for dentistry: to
create functional vital substitute teeth by means
of in-vitro technique. It is a potential alternative
to contemporary methods of missing tooth
replacement.
Aim of the study: To present the assumptions,
research foundations and trends in the field of
biotooth development.
Conclusions: Research concerning biotooth is being
carried out in many centres. Two main trends can be
distinguished: the first one originating in tissue en-
gineering and the second one based on developmen-
tal biology and embryology. The basic difference
between these two approaches can be described as
follows: the engineering-related approach aims at
constructing a tooth with the use of biosubstitute
material scaffolds, while embryology/developmen-
tal biology-related approach aims at creating con-
ditions capable of triggering natural mechanisms
of tooth development. Clinical application is not to
be expected soon and will require broadening of the
knowledge of many mechanisms involved in tooth
biology.
KEYWORDS:
regenerative medicine, cell culture, biotooth
HASŁA INDEKSOWE:
medycyna regeneracyjna, hodowle komórkowe,
biologiczny ząb zastępczy
Czas. Stomatol., 2010, 63, 12, 739-748
© 2010 Polish Dental Society
http://www.czas.stomat.net
740
E. Olender i in.
Czas. Stomatol.,
Wprowadzenie
Substytucja utraconych zębów ma długą hi-
storię – już starożytni Etruskowie, Egipcjanie,
Rzymianie oraz Majowie praktykowali róż-
ne jej formy z zastosowaniem takich materia-
łów jak: muszle, żelazo, kości zwierzęce [24].
Teoretycznie najlepszym substytutem byłyby
zęby naturalne – uzyskane z własnego ma-
teriału biologicznego pacjenta, bezpośrednio
w jego docelowej lokalizacji. Powyższa kon-
cepcja, choć wydawała się przez wiele lat nie-
możliwa do zrealizowania, nie była jednak
pozbawiona racjonalnych przesłanek: natural-
ne rozwiązania spotykane w świecie zwierząt
świadczą o istnieniu wielu wariantów wymia-
ny i odnowy uzębienia oraz o ogromnym po-
tencjale regeneracyjnym organizmu, w tym o
możliwości odtwarzania nie tylko zębów, ale
także żuchwy wraz z uzębieniem. Argument
podnoszący różnice mechanizmów biologicz-
nych i związane z nimi nieprzekraczalne ba-
riery traci swoją aktualność wobec faktu, że w
warunkach eksperymentalnych udało się wy-
indukować powstanie zębów u ptaków, groma-
dy zwierząt, która w warunkach naturalnych
uzębienia nie ma.
Znaczny postęp, jaki dokonał się w poznaniu
procesu rozwoju zęba, embriologii, biologii
komórek macierzystych, a także w technikach
hodowli komórkowej i iżynierii tkankowej,
pozwala postrzegać odtwarzanie czynnościo-
wych żywych zębów – zębów z hodowli – jako
realną przyszłą alternatywę do współczesnych
metod uzupełniania braków uzębienia [22, 23].
Wykorzystywanie autoregeneracji z zastoso-
waniem własnych tkanek i komórek pacjenta
ma już obecnie miejsce np. w chirurgii szczę-
kowo-twarzowej oraz chirurgii stomatologicz-
nej i stanowi element nowego podejścia do le-
czenia – medycyny regeneracyjnej. Prace nad
uzyskaniem biologicznego zęba zastępczego
prowadzone są w wielu ośrodkach badaw-
czych, także niepublicznych. Autorytety jak
profesor Paul Sharp z King’s College London
wyrażają optymistyczne opinie na temat rysu-
jących się perspektyw.
Cel pracy
Celem pracy było opisanie głównych zało-
żeń, podstaw doświadczeń oraz kierunków ba-
dań w dziedzinie uzyskiwania biologicznego
zęba zastępczego.
Metodyka prób uzyskiwania biologiczne-
go zęba zastępczego
Wytwarzanie żywych zębów zastępczych
będzie w mniejszym lub większym stopniu
opierać się na naturalnych mechanizmach bio-
logicznych rozwoju zęba. Zależność ta jest bar-
dzo wyraźna zwłaszcza w przypadku podejścia
biologicznego, które zakłada reprodukcję pro-
cesu embrionalnego. Jednak również trady-
cyjna inżynieria tkankowa, w której podsta-
wę stanowi wykorzystanie materiałów bioza-
stępczych, obok zastosowania odpowiedniej,
biokompatybilnej matrycy, musi, uwzględniać
naturę rozwoju zęba i dokonać wyboru wła-
ściwego składnika biologicznego – komórek
– oraz uzyskać kontrolę nad ich namnażaniem
i różnicowaniem.
Prowadzi się obecnie badania nad wykorzy-
staniem do tego celu: komórek macierzystych
miazgi zęba (ang. Dental Pulp Stem Cells –
DPSC), komórek macierzystych pozyskanych
z zębów mlecznych (ang. Stem cells from
Human Exfoliated Deciduous teeth – SHED),
komórek macierzystych woreczka zębowego
(ang. Dental Follicle Stem Cells – DFSC),
komórek macierzystych wierzchołkowej czę-
ści brodawki zębowej (ang. Stem Cells of the
Apical part of the Papilla – SCAP), komórek
macierzystych więzadła przyzębnego (ang.
741
2010, 63, 12
Ząb z próbówki
Periodontal Ligament Stem Cells – PDLSC)
oraz komórek macierzystych szpiku kostne-
go (ang. Bone Marrow Mesenchymal Stem
Cells – BMSC) [12, 23]. Sterowanie pro-
cesem wzrostu będzie skuteczniejsze dzięki
znajomości i zastosowaniu czynników oddzia-
łujących w procesie naturalnym: związków
z grupy zwanej czynnikami wzrostu oraz z
grupy czynników transkrypcyjnych (uaktyw-
niających transkrypcję genów, czyli stymu-
lujących w efekcie syntezę różnych białek).
Podstawowe znaczenie mają: białka morfo-
genetyczne kości (ang. Bone Morphogenetic
Proteins – BMP), czynnik wzrostu fibrobla-
stów (ang. Fibroblast Growing Factor – FGF),
białko genu sonic hedgehog – SHH, białka
szlaku sygnalizacyjnego Wnt oraz produkty
genów Pax9, Msx1, -2, Barx1, Pitx2, Lhx-6,
7, Lef, Runx2 [22, 36].
Podstawy doświadczalne
Wstępne doświadczenia dotyczące możli-
wości hodowli zęba polegały na obserwacji
wzrostu zawiązków zębów przeszczepianych
we wczesnych stadiach rozwoju. W doświad-
czeniach tych uzyskiwano w pełni uformowa-
ne korony i częściowo wykształcone korzenie.
Pierwsze doniesienia na ten temat zostały opu-
blikowane przez S. Glasstone już w 1936 r. [5].
W latch późniejszych podobne próby były po-
dejmowane przez Slavkina [27] oraz Kollara
[11] i Kocha [10]. Pomysł modyfikowania na-
turalnych zawiązków zęba powstał we wcze-
snych latach 50-ych XX wieku, kiedy to S.
Glasstone wykazała, że obie połówki podzie-
lonego na wczesnym etapie rozwoju zawiąz-
ka zęba podejmują dalszy rozwój i ostatecz-
nie przekształcają się w zęby o prawidłowej
wielkości. Doświadczenie to zademonstrowa-
ło plastyczność i zdolność do samoodnowy
zarodkowych zawiązków zęba, a tym samym
możliwość manipulowania zawiązkami bez
szkody dla ich czynności [6].
Innym zjawiskiem, które legło u podstaw
koncepcji tworzenia biologicznych substytu-
tów zęba, jest naturalna zdolność komórek
wyizolowanych z tkanek do spontanicznej re-
agregacji i tworzenia tkankopodobnych struk-
tur obserwowana początkowo na komórkach
organizmów nizszych. W latach 60-ych XX
w. wykazano, że również komórki zarodko-
we kręgowców spontanicznie reagregują i są
w stanie odtworzyć prawidłowy topograficz-
nie układ charakterystyczny dla danego narzą-
du [33]. Przykładem zdolności do reagregacji,
który bezpośrednio przemawiał za możliwo-
ścią realizacji hodowli zęba z zawiązków, było
odtworzenie układu epitelialno-mezenchymal-
nego z rozdrobnionych tkanek zawiązka wsz-
czepionego w błonę kosmówkowo-owodnio-
wą zarodka kurzego, a następnie uzyskanie
z tak odtworzonej struktury po wszczepieniu
zwierzęciu-biorcy zawiązka zęba [15].
Kolejnym ważnym etapem formułowania
podstaw doświadczalnych i teoretycznych ho-
dowli zęba było prowadzenie tzw. ekspery-
mentów rekombinacyjnych, które polegały na
odpreparowywaniu składnika epitelialnego
bądź mezenchymalnego zawiązka i zastępo-
wania go inną tkanką, a następnie obserwowa-
niu wpływu takiej modyfikacji na rozwój zęba.
[35]. Doświadczenia te wykazały kluczową
rolę nabłonka jamy ustnej w indukcji rozwoju
zęba oraz uzależnienie dalszego rozwoju zęba
od wzajemnych oddziaływań między nabłon-
kiem jamy ustnej a mezenchymą. Kamieniem
milowym w rozwoju medycyny było przed-
stawienie pod koniec lat osiemdziesiątych XX
wieku przez transplantologa J. Vacantiego i
chemika R. Langera koncepcji odtwarzania
narządów w warunkach in vitro poprzez ho-
dowlę komórek tych narządów na biodegrado-
walnych rusztowaniach [2]. Sukcesy w rekon-
struowaniu fragmentów wątroby doprowadzi-
742
E. Olender i in.
Czas. Stomatol.,
ły do upowszechnienia tej metody i podjęcia
prób odtwarzania innych narządów, np.: mię-
śnia sercowego, jelita, tchawicy, a także zęba
(żywy ząb jest narządem, składa się bowiem
z tkanek różnych typów, które spełniają okre-
ślone czynności).
Główne założenia i kierunki badań współ-
czesnych
Zasadniczym celem jest wypracowanie spo-
sobu wytwarzania/indukowania powstawania
żywego zęba, który mógłby zastąpić ząb na-
turalny utracony przez pacjenta. Przewaga
zęba żywego nad substytutem zęba polega na
jego możliwościach adaptacyjnych i trwałości.
„Żywy” oznacza obecność składnika komór-
kowego. Obecnie wyróżnić można dwa głów-
ne nurty w poszukiwaniu sposobu realizacji
powyższego celu: nurt wywodzący się z in-
żynierii tkankowej oraz nurt opierający się na
biologii rozwoju i embriologii [19, 26].
Inżynieria tkankowa w celu odtwarzania tka-
nek z definicji wykorzystuje komórki, czynni-
ki wzrostu oraz, co jest charakterystyczne dla
tego nurtu, rozmaite materiały, z których wy-
konuje się rusztowania nadające kształt przy-
szłemu zębowi i na które wysiewa się w wa-
runkach in vitro komórki. W podejściu opie-
rającym się na biologii rozwoju nie stosuje
się rusztowań dla komórek, nacisk położony
jest na próbę odtworzania procesów embrio-
nalnych (głównie oddziaływań epitelialno-me-
zenchymalnych). Podstawową różnicę między
obu podejściami można opisać nastepująco:
w podejściu inżynieryjnym dąży się do skon-
struowania zęba, w podejściu biologicznym/
embrionalnym do stworzenia warunków uru-
chamiających naturalne mechanizmy rozwo-
ju zęba.
Teoretycznie istnieją cztery drogi uzyskania
biologicznego zęba zastępczego: 1) skonstru-
owanie zęba z użyciem rusztowań i komórek
od razu w całości i w postaci dojrzałej, 2) skon-
struowanie zęba z użyciem rusztowań, komó-
rek i czynników wzrostu w postaci niedojrza-
łej – dalszy rozwój następowałby w warun-
kach hodowli lub już w organizmie biorcy, 3)
indukowanie powstawania zęba z odpowied-
nio dobranych komórek poprzez odtworzenie
naturalnych warunków powstawania zawiązka
zęba, w warunkach poza organizmem lub w
organizmie biorcy, 4) indukcja powstania trze-
ciej i kolejnych generacji zębów w szczęce/żu-
chwie pacjenta poprzez manipulacje genetycz-
ne lub zastosowanie odpowiednich czynników
stymulujących (czynników wzrostu itp.) [19,
26]. Obecnie realizowane są próby głównie na
drodze drugiej i trzeciej.
Konstruowanie zastępczego żywego zęba
wyłącznie w warunkach in vitro oraz indukcja
trzeciej generacji zębów in vivo – dwie skraj-
ne koncepcje uzyskania żywych zębów zastęp-
czych – pozostają na razie w sferze rozważań
i badań wstępnych.
W praktyce prowadzi się intensywne prace
nad „trzecią drogą”, która łączy w sobie me-
todykę inżynierii tkankowej oraz wykorzysta-
nie mechanizmów biologii rozwoju. Ogólnie
rzecz biorąc, celem jest wytworzenie w wa-
runkach laboratoryjnych konstruktów o funk-
cji zawiązka zęba, który po wszczepieniu daw-
cy kontynuowałby rozwój, aż do uformowa-
nia dojrzałego, wyrzniętego zęba. Próby idą
w dwóch zasadniczych kierunkach: tworzenia
konglomeratu komórek zdolnych do różnico-
wania w komórki zęba i tworzenia jego tkanek
z zastosowaniem rusztowania-podpory dla ko-
mórek [19, 26].
Podejście inżynieryjne – z zastosowaniem
rusztowań
Ze względu na niewielki rozmiar ząb wy-
daje się być idealnym narządem-kandydatem
do odtworzenia w warunkach laboratoryjnych.
743
2010, 63, 12
Ząb z próbówki
Pierwsze podejście, zbliżone do tradycyjnej in-
żynierii tkankowej, zakłada możliwość skon-
struowania zęba, o strukturze trójwymiarowej
uformowanej poprzez zastosowane rusztowa-
nia o odpowiednim kształcie. Na rusztowa-
nie wysiewane są odpowiednio dobrane ko-
mórki, które mnożąc się zasiedlają stopniowo
całe rusztowanie. Zazwyczaj materiał, z któ-
rego wykonane są rusztowania, jest biodegra-
dowalny, a więc z czasem zanika, a jego miej-
sce zajmuje macierz wytworzona przez ko-
mórki. Macierz utrzymuje wyznaczony przez
rusztowanie pierwotny kształt całej struktu-
ry. Ponieważ komórki i tkanki cechuje zdol-
ność do reagregacji, przyjmuje się również, że
zmieszanie odpowiednich typów komórek w
odpowiednich proporcjach i umieszczenie ich
na matrycy odwzorowujacej naturalne, trójwy-
miarowe środowisko powinno doprowadzić do
odbudowy tkanki czy narządu, z której dane
komórki pochodzą [2]. Podejście to budziło
duże nadzieje ze względu na zakładaną moż-
liwość łatwego modelowania kształtu hodo-
wanych zębów.
W praktyce, w warunkach eksperymental-
nych istotnie dokonano postępu w zakresie
kontroli kształtu żywego dzięki zastosowaniu
odpowiednio uformowanych rusztowań z gą-
bek kolagenowych i sekwencyjnemu wysie-
waniu komórek mezenchymy zębotwórczej w
bezpośrednim kontakcie z nabłonkiem zębo-
twórczym. Jednak efekty nie są w pełni zada-
walające [7]. Robey [25] zaproponował mody-
fikację metody, według której każdą ze skła-
dowych zęba należy odtwarzać indywidualnie:
koronę z materiału syntetycznego o właści-
wościach szkliwa, wypełnioną biomateriałem
HA/TCP (hydroksyapatyt/fosforan wapnia) z
zawieszonymi w nim komórkami macierzy-
stymi, zaś korzeń z wykorzystaniem komórek
macierzystych więzadła przyzębnego PDLSC.
Konstrukt taki byłby wszczepiany np. do mię-
śnia, jako naturalnego „inkubatora”. Stamtąd,
w odpowiednim momencie byłby przeszcze-
piany do jamy ustnej. Autorzy koncepcji nie
opisują jednak szczegółowo sposobu odtwo-
rzenia zębiny korony i korzenia. Opisana me-
toda wykorzystywałaby nieresorbowalny ma-
teriał syntetyczny – nie byłby to więc w całości
ząb biologiczny. Byłby to zatem żywy implant.
Zaletą metody jest pełna kontrola nad kształ-
towaniem korony oraz możliwość zautoma-
tyzowania procesu wytwarzania zębów i tym
samym prowadzenia procesu na dużą skalę.
Wadą metody jest niemożność ominięcia eta-
pu inkubacji w tkankach biorcy.
Zespół P.C.Yelick zaproponował odmienną
metodę i wykonał jej eksperymentalną we-
ryfikację [3]. Z trzecich niewyrzniętych zę-
bów trzonowych świń (sześciomiesięcznych)
i szczurów (czterodniowych) pozyskiwa-
no tkanki zawiązka zęba w późnym stadium
pączka. Tkanki trawiono enzymatycznie w
celu uwolnienia komórek. Komórki następ-
nie namnażano i wysiewano na biodegrado-
walne rusztowania polimerowe (z poliglikolu,
polimleczanu, polimleczano-co-glikolu) ufor-
mowane na kształt zębów siecznych i trzono-
wych. Rusztowania dla komórek świńskich
miały wymiary 1 x 0,5 x 0,5 cm, dla szczu-
rzych 1 x 5 x 5 mm. Tak przygotowane kon-
strukty wszczepiano chirurgicznie szczurom
w tkankę sieci i pozostawiano na 12-30 tygo-
dni. Po tym czasie wszczepy eksplantowano i
poddawano analizie histologicznej. Analiza ta
potwierdziła obecność drobnych struktur zę-
bopodobnych o wymiarach od 1 do 2 mm, wy-
kazujących cechy kształtu koron zębów trzo-
nowych. Jednak we wszystkich przypadkach
kształt ten nie odwzorowywał kształtu użytego
rusztowania. Uzyskane twory były też znacz-
nie mniejsze, aniżeli wszczepione rusztowa-
nia. W powstałych strukturach obecne były
ameloblasty i odontoblasty. Nie stwierdzono
744
E. Olender i in.
Czas. Stomatol.,
wykształcenia się korzenia, ani tkanki kost-
nej, której tworzenie towarzyszy powstawaniu
zęba w warunkach naturalnych.
Wyniki powyższego doświadczenia inter-
pretuje się raczej jako dowód na reorganizo-
wanie się użytych elementów epitelialnych i
mezenchymalnych, nie zaś na formowanie sie
tkanek de novo. Porównywalne wyniki uzy-
skano w doświadczeniu z komórkami wyizo-
lowanymi z pączka zęba trzonowego cztero-
dniowego szczura. W odróżnieniu od poprzed-
niego doświadczenia, komórki przed wysia-
niem były utrzymywane w hodowli in vitro
przez 6 dni. Po tym czasie zostaly wysiane na
rusztowanie i wraz z nim wszczepione szczu-
rom-biorcom. Implanty pozostawiono na 12
tygodni. W efekcie doświadczenia otrzymano
drobne skupiska chaotycznie zorganizowanej
tkanki zębopodobnej, która nie osiągnęła roz-
miarów rusztowania [3].
W 2008 r. zespół P.C. Yelick wykonał do-
świadczenia z zastosowaniem rusztowania ob-
sianego w jednej części komórkami pocho-
dzącymi z zawiązka zęba w stadium pączka,
w drugiej mezenchymalnymi komórkami ma-
cierzystymi szpiku kostnego. Konstrukty wsz-
czepiano do żuchwy zwierzęcia-dawcy komó-
rek. Efekty oceniano po 12 i 20 tygodniach.
Stwierdzono obecność małych zębopodob-
nych tworów składających się z zębiny, szkli-
wa, miazgi, cementu, ozębnej, otoczonych zre-
generowaną tkanką kostną. Nie zaobserwowa-
no struktur korzenia [4].
Niepowodzenie w uzyskaniu jakichkolwiek
struktur korzeniopodobnych przełamał zespół
Sonoyamy w 2006 r. Na rusztowania z HA/
TCP ukształtowane na kształt korzenia wysie-
wano komórki macierzyste wywodzące się z
brodawki wierzchołkowej (SCAP) i więzadła
przyzębnego (PDLSC) świń [23], a następnie
umieszczano rusztowania w zębodole poeks-
trakcyjnym. Analiza tomograficzna i histolo-
giczna wykonana po 4 tygodniach i 6 miesią-
cach wykazała częściową regenerację korze-
nia (odtworzona została zębina) oraz ozębnej
[29].
Nie w pełni satysfakcjonujące efekty me-
tod inżynierii tkankowej tłumaczy się ne-
gatywnym wpływem samego rusztowania.
Rusztowanie stanowi barierę dla odontogen-
nych oddziaływań epitelialno-mezenchymal-
nych oraz dla przepływu informacji pozycyj-
nej (gradientu morfogenów) w kształtujacym
się zębie. Poza tym kwaśne produkty degrada-
cji tworzywa użytego do budowy rusztowania
wpływają niekorzystnie na mikrośrodowisko
tworzącego się zęba [8].
Podejście biologiczne
Drugie podejście, bez użycia rusztowania,
realizuje strategię w większym stopniu opar-
tą na naśladowaniu naturalnych procesów po-
wstawania zębów, obserwowanych w rozwoju
zarodkowym. Metoda ta wymaga pełniejszego
zrozumienia mechanizmów kontroli wczesnych
etapów wykształcania się zęba. Wiodącym
ośrodkiem, który podjął ten kierunek badań,
jest Katedra Rozwoju Twarzoczaszki w King’s
College w Londynie. Grupa badawcza skupia
sie wokół założyciela i kierownika Katedry –
profesora P. T. Sharpe’a. Zespół ten prowadzi
doświadczenia głównie na komórkach mysich,
zarodkowych, jak i osobników dorosłych. Osią
koncepcji jest wykorzystanie naturalnego po-
tencjału oddziaływań epitelialno-mezenchy-
malnych, zwłaszcza zdolności komórek na-
błonka jamy ustnej do indukcji rozwoju zęba
[17, 19]. Ich doświadczenia polegały na wy-
tworzeniu konglomeratu komórek mezenchy-
malnych nie pochodzących z zawiązka zęba,
które pokrywano warstwą komórek embrio-
nalnych komórek nabłonka jamy gębowej (ko-
mórki mezenchymalne należały do jednego
z trzech pierwotnie nieodontogennych typów
745
2010, 63, 12
Ząb z próbówki
komórek: mezenchymalnych zarodkowych
komórek macierzystych, nerwowych komó-
rek macierzystych, komórek szpiku osobni-
ka dorosłego), utrzymaniu konglomeratu w
warunkach hodowli przez 2-3 dni, a następ-
nie wszczepieniu go podtorebkowo do ner-
ki myszy i oceny jego struktury po 10 – 14
dniach. Po tym czasie stwierdzono wyraźne
formowanie struktur korony zęba i tkanki kost-
nej w każdym przypadku, niezależnie od ro-
dzaju zastosowanych komórek mezenchymal-
nych. Doniosłość tych wyników tkwi w fakcie,
że okazało się możliwym zastosowanie jako
komponentu mezenchymalnego komórek in-
nych niż zarodkowych, czy wywodzących się
z niewyrzniętych zębów [21].
W 2007 roku grupa badaczy skupiona wo-
kół T. Tsuji z Tokyo University zaproponowała
metodę także bez użycia rusztowania, w której
konglomerat komórek zatapiany był w kropli
żelu kolagenowego, a następnie inkubowany
in vitro bądź wszczepiany podtorebkowo do
nerki. W doświadczeniach z użyciem komó-
rek epitelialnych i mezenchymalnych wyizo-
lowanych z mysiego zawiązka siekacza uzy-
skano każdorazowo zawiązki zęba (zarówno
w wariancie in vitro, jak i in vivo). Zawiązki
te wszczepiano dorosłej myszy do zębodołu
po ekstrakcji siekacza. Obserwowano normal-
ny rozwój korony siekacza z obecnością szkli-
wa, miazgi, naczyń krwionośnych i nerwów, a
także początki wytwarzania struktur korzenia.
Nie wiadomo jednak, czy wytworzony ząb jest
w stanie się wyrznąć [20]. Poza badaniami do-
tyczącymi uzyskania samego zęba prowadzi
się także prace nad możliwością pełnego zasy-
milowania zęba zastępczego ze środowiskiem
jamy ustnej, w tym jego ukrwieniem i uner-
wieniem [14, 18].
Odniesienia do biologii kręgowców
Uzyskiwanie żywego zęba drogą hodowli
komórkowej będzie polegać, przynajmniej w
części, na wykorzystaniu i naśladowaniu pro-
cesów naturalnych. Poznanie mechanizmów
sterujących tymi procesami jest kluczowym
zadaniem. Zrozumienie podstaw odmiennej
biologii zęba u gatunków bardziej odległych
taksonomicznie i genetycznie od człowieka
może mieć także duże znaczenie.
Zęby są strukturami charakterystycznymi
dla kręgowców. Występują u ryb, płazów, ga-
dów i ssaków. Prawdopodobnie wykształciły
się jako przydatki skórne (podobnie jak wło-
sy czy gruczoły potowe), które wtórnie zaję-
ły obszar jamy gębowej i uzyskały połączenie
z kością [13]. U wielu ryb spodoustych bło-
na śluzowa jamy gębowej wysłana jest łuska-
mi plakoidalnymi, tworami o funkcji zębów,
podobnymi do tych, które pokrywają skórę.
Identyczność budowy wewnętrznej zębów i
łusek plakoidalnych oraz istnienie tworów po-
średnich świadczy o ich pełnej homologii [30].
Stanowi to przesłankę, by poszukiwać braku-
jącego komponentu epitelialnego niezbędne-
go do rozwoju zęba w nabłonku skóry. U ryb,
płazów i gadów okres życia zęba jest ograni-
czony. Po pewnym czasie ząb wypada, a na
jego miejsce wyrzyna się ząb należący do na-
stępnej generacji. Wymiana taka może trwać
całe życie. U rekinów, u których wymiana
zębów następuje szybko, można dostrzec na
przekroju szczęki lub żuchwy kolejne zęby w
różnym stopniu rozwoju. Wymiany następują
niezależnie od stanu zębów w danym momen-
cie używanych – rolą wymiany zębów nie jest
zastępowanie konkretnych zniszczonych zę-
bów. Sytuacja u ssaków, a więc i ludzi, w któ-
rej wymiana zębów następuje najwyżej jeden
raz i nie obejmuje nigdy wszystkich zębów
(difiodontyzm) nie jest zatem uniwersalnym
rozwiązaniem biologicznym [30].
Być może zjawisko występowania trze-
ciej generacji zębów u człowieka w przypad-
746
E. Olender i in.
Czas. Stomatol.,
ku mutacji genu Runx2 jest dowodem na to,
że polifiodontyzm może zostać przywrócony
przy zmienionej ekspresji niektórych genów.
Przykładem możliwości uruchomienia „uśpio-
nych” mechanizmów odontogenezy jest wy-
wołanie rozwoju zęba w jamie gębowej kur-
cząt. Mimo, że ptaki utraciły uzębienie 80 mi-
lionów lat temu, prawdopodobnie jako przy-
stosowanie do lotu, nadal jednak mają geny
umożliwiające odpowiednie interakcje mię-
dzytkankowe i wykształcenie zębów. W wa-
runkach eksperymentalnych, po przeszczepie-
niu do embrionu kurczęcia mysich komórek
grzebienia nerwowego (prekursorów składni-
ka epitelialnego zawiązka zęba) składnik me-
zenchymatyczny, wywodzący się z kurczęcia,
odpowiada na stymulację przez mysi składnik
epitelialny skutkując wykształceniem struktur
zębopodobnych [16].
W przeciwieństwie do człowieka, u wielu
kręgowców zębotwórczy składnik epitelialny
jest dostępny także po wykształceniu się dojrza-
łych zębów. I tak, siekacz gryzoni cechuje stały
wzrost. Jest to możliwe dzięki podziałom ko-
mórek epitelialnych w strukturze zwanej pętlą
wierzchołkową (ang. cervical loop). Znajdują
się w niej komórki macierzyste, które, dzieląc
się asymetrycznie, odtwarzają komórkę macie-
rzystą i komórkę ukierunkowaną na różnicowa-
nie do ameloblastów. Ta ostatnia przemieszcza
się ku brzegowi siecznemu zęba, gdzie prze-
kształca się w czynną komórkę szkliwotwór-
czą [31]. Jak wspomniano wyżej, bierze się pod
uwagę tworzenie konstruktów-chimer, które za-
wierać będą obok komórek ludzkich, odpowia-
dających składnikowi mezenchymatycznemu,
komórki pętli wierzchołkowej siekaczy gryzo-
ni. Obecność stale odnawiającego się składnika
epitelialnego, zawierającego epitelialne komór-
ki macierzyste, umożliwia również wielokrotną
wymian zębów u ryb – wykazano to m.in. na
przykładzie zębów gatunku Danio pręgowa-
ne (ang. Zebrafish). Stwierdzono znaczne po-
dobieństwa między rozwojem zęba następcze-
go a odnową krypt jelitowych i morfogenezą
mieszka włosowego. Interesujące jest również,
że wzorzec ekspresji genów dla zębów pierw-
szej generacji jest inny, aniżeli dla kolejnych
generacji [9].
Kwestie do rozwiązania. Perspektywy
Bioinżynieria zębów w porównaniu do bio-
inżynierii innych narządów uczyniła bardzo
duży postęp w stosunkowo krótkim czasie.
Wykazano bezsprzecznie, że: po pierwsze,
można wytworzyć struktury korony zęba sto-
sując komórki zawiązka zęba i rusztowania,
po drugie, można odtworzyć koronę zęba bez
użycia rusztowania, wykorzystując embrional-
ny nabłonek jamy ustnej i macierzyste komór-
ki mezenchymatyczne szpiku, po trzecie, me-
zenchymatyczne komórki macierzyste szpi-
ku mogą różnicować się w kierunku komórek
odontogennych, po czwarte, komórki ze zdy-
socjowanych tkanek zawiązka zęba zawieszo-
ne w kolagenie mogą rozwinąć się w prawidło-
wy zawiązek zęba, ukształtować prawidłową
koronę i korzeń po wszczepieniu ortotopowym
u dorosłego biorcy [28, 35].
Wykonane doświadczenia pozwoliły także
zidentyfikować ograniczenia, z którymi na-
uka i biotechnologia muszą się zmierzyć: za-
wodność metod tradycyjnej inżynierii tkanko-
wej, brak zadawalającego substytutu embrio-
nalnych komórek epitelialnych, niezbędnych
do rozwoju zęba, fragmentaryczna znajomość
mechanizmów molekularnych towarzyszących
wykształcaniu sie zęba, odrzucanie przeszcze-
pu (jeśli z różnych względów stosowany w ho-
dowlii materiał komórkowy będzie allo– bądź
ksenogeniczny), trudności w kontrolowaniu
kształtu, wielkości i koloru wytwarzanych zę-
bów. Poza tym, do rozwiązania pozostają kwe-
stie: asymilacji zęba uzyskanego in vitro ze
747
2010, 63, 12
Ząb z próbówki
środowiskiem, skrócenia czasu rozwoju zęba
do postaci dojrzałej (miesiące zamiast lat), in-
dukcji wyrzynania się zęba zastępczego, uzy-
skiwania komórek zdolnych do różnicowania
i efektywnego namnażania od pacjentów w
starszym wieku [28, 35].
Podsumowanie
W świetle powyższego, prognozy przewi-
dujące wypracowanie skutecznej metodolo-
gii uzyskiwania biologicznych zębów zastęp-
czych w ciągu najbliższych lat mogą okazać
się nadmiernie optymistyczne.
Piśmiennictwo
1. Chai Y, Slavkin HC: Prospects for tooth re-
generation in the 21st century: a perspective.
Microsc Res Tech 2003, 60 (5): 469-79.
2. Cima L G, Vacanti J P, Vacanti C, Inqber D,
Mooney D, Langer R: Tissue engineering by
cell transplantation using degradable poly-
mer substrates. J Biomech Eng 1991, 113 (2):
143-151.
3. Duailibi M T, Duailibi S E, Young C S, Barlett
J D, Vacanti I P, Yelick P C: Bioengineered
teeth from cultured rat tooth bud cells. J Dent
Res 2004, 83: 523-528.
4. Duailibi S E, Duailibi M T, Zhang W, Asrican
R, Vacant I P, Yelick P: Bioengineered dental
tissues grown in the rat jaw. J Dent Res 2008,
87: 745-750.
5. Glasstone-Hughes S: The development of
tooth germs in vitro. J Anat 1936, 70: 260-
-266.
6. Glasstone-Hughes S: The development of
halved tooth germs; a study in experimental
morphology. J Anat 1952, 86: 12-25.
7. Honda MJ, Tsuchiya S, Sumita Y, Sagara H,
Ueda M:The sequential seeding of epithelial
and mesenchymal cells for tissueengineered
tooth regeneration. Biomaterials 2007, 28:
680-689.
8. Hu B, Nadiri A, Kuchler-Bopp S, Perrin-
Schmitt F, Peters H, Lesot H: Dental epithe-
lial histomorphogenesis in vitro. J Dent Res
2005, 84: 521-525.
9. Huysseune A: Formation of a succession-
al dental lamina in the zebrafish (Danio re-
rio): support for a local control of replace-
ment tooth initiation. Int J Dev Biol 2006, 50
(7):637-643.
10. Koch W E: Tissue interaction during in vitro
odontogenesis. W: Slavkin H C, Bavetta L A
red. Developmental Aspects of Oral Biology.
Academic Press Inc. New York 1972, 126-
-149.
11. Kollar E J, Baird G: The influence of the den-
tal papilla on the development of tooth shape
in embryonic mouse germs. J Embryo Exp
Morph 1969, 21: 131-148.
12. Li ZY, Chen L, Liu L, Lin YF, Li SW, Tian WD:
Odontogenic potential of bone marrow me-
senchymal stem cells. J Oral Maxillofac Surg
2007, 65 (3): 494-500.
13. Lin Y, Yelick P: Dental tissue engineering.
W: Atala A, Lanza R editors: Principles in
Regenerative Medicin. Elsevier 2008.
14. Luukko K, Moe K, Sijaona A, Furmanek T,
Hals Kvinnsland I, Midtbø M, Kettunen P:
Secondary induction and the development of
tooth nerve supply. Ann Anat 2008, 190 (2):
178-187.
15. Main JH: Retention of potential to differen-
tiate in long-term cultures of tooth germs.
Science 1966, 152: 778–780.
16. Mitsiadis TA, Caton J, Cobourne M: Waking-
up the sleeping beauty: recovery of the ances-
tral bird odontogenic program. J Exp Zool B
Mol Dev Evol 2006, 306 (3): 227-233.
17. Modino SA, Sharpe PT: Tissue engineering
of teeth using adult stem cells. Arch Oral Biol
2005, 50 (2): 255-258.
18. Nait Lechguer A, Küchler-Bopp S, Hu B,
Haïkel Y, Lesot H:Vascularization of engi-
neered teeth. J Dent Res 2008, 87 (12):1138-
-1143.
19. Nakahara T, Yoshiaki I: Tooth regeneration:
748
E. Olender i in.
Czas. Stomatol.,
Implications for the use of bioengineered or-
gans in first-wave organ replacement. Human
Cell 2007, 20: 63-70.
20. Nakao K, Morita R, Saji Y, Ishida K, Tomita Y,
Ogawa M, Saitoh M, Tomooka Y, Tsuji T: The
development of a bioengineered organ germ
method. Nat Methods 2007, 4 (3):227-30.
21. Ohazama A, Modino S A, Miletich I, Sharpe P
T: Stem-cell-based tissue engineering of mu-
rine teeth. J Dent Res 2004, 83 (7): 518-522.
22. Olender E, Kamiński A, Ubrynowska-
Tyszkiewicz I, Wanyura H: Aspekty histolo-
giczne i molekularne mechanizmy kontro-
li naturalnego rozwoju zęba. Czas Stomatol
2010, 63, 9: 543-550.
23. Olender E, Kamiński A, Ubrynowska-
Tyszkiewicz I, Wanyura H: Komórki macie-
rzyste tkanek zęba i możliwości odtwarzania
struktur zęba – przegląd pismiennictwa. Czas
Stomatol 2010, 63, 11: 682-692.
24. Ring ME: A thousand years of dental im-
plants: a definitive history. Comp Cont Edu
Dent 1995, 16: 1060-1069.
25. Robey PG: Post-natal stem cells for dental and
craniofacial repair. Oral Biosci Med 2005, 2:
83-90.
26. Sartaj R, Sharpe P: Biological tooth replace-
ment. J Anat 2006, 209: 503-509.
27. Slavkin H C, Beierle J, Bvetta L A:
Odontogenesis: cel-cell interaction in vitro.
Nature 1968, 217: 269-217.
28. Snead M L: Whole-tooth regeneration: it takes
a village of scientists, clinicians, and patients.
J Dent Educ 2008, 72 (8): 903-911.
29. Sonoyama W, Liu Y, Fang D, Yamaza T, Seo
BM, Zhang C, Liu H, Gronthos S, Wang CY:
Mesenchymal stem cell-mediated functional
tooth regeneration in swine. PLoS One 2006,
20, 1: e79.
30. Szarski W: Anatomia porównawcza kręgow-
ców. Państwowe Wydawnictwo Naukowe,
Warszawa 1987, 514-529.
31. Tummers M, Thesleff I: Root or crown: a de-
velopmental choice orchestrated by the dif-
ferential regulation of the epithelial stem
cell niche in the tooth of two rodent species.
Development 2003, 130 (6): 1049-1057.
32. Wang S, Shi S: Mesenchymal stem cell-me-
diated functional tooth regeneration in swine.
PLoS 2006, 20, 1:e79.
33. Weiss P, Taylor AC: Reconstitution of com-
plete organs from single-cell suspensions
of chick embryos in advanced stages of dif-
ferentiation. Proc Natl Acad Sci USA 1960,
46:1177-1185.
34. Yen A, Sharpe P: Stem cells and tooth tissue
engineering. Cell Tissue Res 2008 331: 359-
-372.
35. Yu J, Shi J, Jin Y: Current approaches and
challenges in making a bio-tooth. Tissue Eng
Part B Rev 2008, 14 (3): 307-319.
36. Zhang Y, Chen Z, Song Y, Liu C, Chen Y:
Making a tooth: growth factors, transcription
factors, and stem cells. Cell Research 2005,
15 (5): 301-316.
Adress: 02-004 Warszawa, ul. Chałubińskiego 5
Tel./Fax: 22 6217543
e-mail: ewa.olender@wum.edu.pl
Paper received 5 July 2010
Accepted 11 January 2011