Zastosowanie w medycynie regeneracyjnej komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej
Medycyna regeneracyjna- stosunkowo nowa dziedzina medycyny, zajmująca się zastępowaniem komórek starych i chorych przez komórki młode, albo też regeneracją organizmu za pomocą terapii genowej.
Metody te mają na celu zwalczenie nie tylko symptomów chorób, ale również ich przyczyn, najczęściej mających podłoże genetyczne tj. błędów w materiale genetycznym powstających w wyniku mutacji bądź też dziedziczenia
Krew pępowinowa, to krew, która pozostaje w pępowinie i łożysku po narodzinach dziecka. Do niedawna była traktowana jako "odpad" i utylizowana (razem z łożyskiem i pępowiną.) Dziś wiemy, że jest cennym źródłem komórek macierzystych. Obecnie pobiera się je (za zgodą matki po porodzie) w celu przechowywania i późniejszego wykorzystania w leczeniu(wydaje się, że największe ich źrodło znajduje się w Indiach ze względu na wysoka ilość urodzen). Krew pępowinowa zawiera nie tylko krwiotwórcze komórki macierzyste dające początek komórkom krwi, ale także komórki mezenchymy (tkankowe komórki macierzyste), które są multipotentne i dają początek komórkom innych tkanek w obrębie danego listka zarodkowego - np. komórkom tkanki nerwowej, komórkom tkanki kostnej, komórkom tkanki mięśniowej w tym komórkom mięśnia sercowego.
Naukowcy z Wietnamu rozpatrywali ich różnicujący potencjał w komórki wydzielające insulinę. A insulina jak wiadomo jest bardzo ważnym hormonem peptydowym produkowanym przez trzustkę odgrywającym zasadniczą rolę przede wszystkim w metabolizmie węglowodanów, która sprowadza się do obniżania poziomu cukru we krwi.
Jako cel badania postawiono sobie znalezienie alternatywnego sposobu leczenia cukrzycy z wykorzystaniem komórek macierzystych. Te pochodzące z krwi pępowinowej wydają się odpowiednie do zastosowania klinicznego przede wszystkim ze względu na fakt, iż posiadają znacznie niższy poziom immunogennych endotoksyn aniżeli dorosle komorki szpikowe. Nie budza tez kontrowersji etycznych
Przebieg:
Krew pępowinowa była pobierana z żyły pępowinowej. Pochodzące z niej jednojądrowe komórki zamrożono i przechowywano w ciekłym azocie.
Po rozmrożeniu i oszacowaniu żywotności zawiesinę komórek przeniesiono do naczyń hodowlanych z odpowiednim medium i płodową surowicą bydlęcą (FBS), a także antybiotykami. Hodowlę utrzymywano w 37st C , z 5% dopływem CO2.
Różnicowanie
Populacja komórek jednojądrowych została skłoniona do różnicowania w adipocyty (komórki tworzące tkankę tłuszczową) i osteoblasty (komórki kościotwórcze), w celu sprawdzenia ich zdolności proliferacyjnych.
Z kolei różnicowanie się komórek w endokrynne trzustki podzielono na 3 umowne etapy.
Wyniki:
Jak się okazuje komórki macierzyste krwi pępowinowej mają duży potencjał namnażania i podwajają swoją ilość w 48-72 godziny. Oprócz podobieństwa morfologicznego z komórkami wysp trzustkowych, posiadają zdolność przeprowadzania transkrypcji, translacji i co najważniejsze wydzielają insulinę. Komórki te zostały scharakteryzowane za pomocą cytometrii przepływowej, metody diagnostycznej umożliwiającej ocenę wielkości, intensywności zabarwienia i intensywności fluorescencji badanych komórek.
Aby stwierdzić czy doszło do zróżnicowania w komórki wydzielające insulinę, skupiska nowopowstałych komórek były identyfikowane na podstawie zawartości genów, dzięki metodzie analitycznej zwanej RT-PCR- reakcji łańcuchowej polimerazy DNA z analizą ilości powstającego produktu w czasie rzeczywistym. Monitorowanie przyrostu liczby kopii badanej sekwencji w czasie rzeczywistym możliwe było dzięki znakowaniu starterów, sond oligonukleotydowych lub produktów amplifikacji cząsteczkami zdolnymi do fluorescencji (fluorochromami). W tym badaniu użyto barwnika fluorescencyjnego SYBR
Po zróżnicowaniu, wszystkie skupiska komórek wykazywały obecność szeregu genów jak np. białka Nestyny, które jest typowe dla komórek wysp trzustkowych.
Zdjęcia pokazane na tym slajdzie ukazują morfologiczne zmiany zachodzące w różnicujących się komórkach krwi pępowinowej.
Rysunek A - przedstawia komórki po 9 dniach hodowli, można tu zaobserwować tworzenie się agregatów, Rysunek B- to hodowla 14-dniowaz wyraźnymi, bardziej skondensowanymi skupiskami komórek
Rysunek C - skupiska komórek zaobserwowanych po 21 dniach w normalnym świetle
D, E - te same skupiska komórek wybarwione przy pomocy barwnika fluorescencyjnego Hoechsta 3342 i FITC (izotiocyjanianu fluoresceiny)
Transplantacja
Przeprowadzono też próbę transplantacji nowo-wyhodowanych komórek na myszach. Podano im streptozotycynę,(STZ) która wywołała u tych zwierząt cukrzycę. Następnie przeszczepiono im komórki produkujące insulinę, które znajdowały się w roztworze PBSu..
Poziom cukru u myszy z komórkami wydzielającymi insulinę obniżył się po 3 dniach, zaś poziom cukru u myszy kontrolnej z wstrzykniętym tylko PBSem wzrastał. Doświadczenie pokazało, że nie było insuliny w komórkach myszy kontrolnej, ale była w grupie przeszczepionych komórek IPCs. W przedstawionym tu eksperymencie komórki produkujące insulinę utrzymywały wprawdzie cukier na względnie stałym poziome, ale nie obniżyły jego poziomu wystarczająco. Mogło to być spowodowane tym, że dawka przeszczepionych komórek była zbyt mała, wobec czego efekt leczenia cukrzycy nie był dobry. Wobec tego powinno się spróbować przeszczepić komórki w większej ich licznie.
Wnioski:
mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z krwi pępowinowej mogą różnicować się w funkcjonalne wyspopodobne komórki trzustkowe w warunkach poza organizmem (In vitro).
Należy pamiętać jednak o potencjalnych przeszkodach uniemożliwiających ich kliniczne zastosowanie. Jako, że komórki te nie pochodzą od pacjentów z cukrzycą, transplantowane im mogą zostać odrzucone. Takie ryzyko jest minimalizowane w przypadku przeszczepów autologicznych, gdzie po namnożeniu mezenchymalnych komórek macierzystych zostają one przeszczepiane z powrotem tym pacjentom. Wówczas ich wysoki potencjał proliferacji i uniknięcie odrzucenia umożliwią obiecującą terapię cukrzycy. (Cukrzycy typu 1, która polega na pierwotnym, niedostatecznym wydzielaniu insuliny, przy zachowaniu normalnej wrażliwości tkanek na ten hormon) ; 2 typu- zmniejszona wrażliwość tkanekna insuline tzn insulinoopornosc
a) chromatogram
Wynik chromatografii cieczowej, techniki służącej m. in. do identyfikacji substancji chemicznych, w tym przypadku insuliny. Pierwszy wykres odnosi się do myszy kontrolnej, drugi zaś do myszy której podano komórki produkujące insulinę. Niebieska linia oznacza standardową próbkę insuliny, zaś czerwona mysią surowicę. U myszy zdrowej insulina jest wykrywana po czasie ok. 29minut. W przypadku myszy kontrolnej, u której nie stwierdzono występowania insuliny linia oznaczająca surowicę przebiega idealnie poziomo, podczas gdy na 2 schemacie dotyczącym myszy z komórkami które insulinę wydzielają widzimy lekkie wahnięcie linii czerwonej co wskazuje na obecność insuliny w jej komórkach.
Nowsze badania pokazują duży potencjał mezenchymalnych komórek macierzystych z krwi pępowinowej do leczenia uszkodzonego śródbłonka rogówki, która to jest wypukłą zewnętrzną warstwą gałki ocznej znajdująca się w jej przedniej części.
Uszkodzenie rogówki może skutkować utratą wzroku wskutek urazu lub też jakiejś choroby, w związku z czym w takiej sytuacji wymagana jest transplantacja pełnej grubości rogówki albo keratoplastyka komórek śródbłonka.
Cały czas poszukuje się alternatywnych metod, aby przywrócić zdrowy śródbłonek rogówki, ponieważ na całym świecie istnieje coraz mniej potencjalnych jej źródeł (kiedyś pobierano ze zwłok.)
Celem badań było przetestowanie możliwości zmian fenotypu kom. macierzystych i określenie czy mogą zadomowić się w uszkodzonych komórkach śródbłonka rogówki za pomocą modelu ex vivo.
Metoda:
Przeprowadzono 2 zasadnicze części eksperymenu:
a) hodowlę tkankową
b) procedurę ex vivo (która była modelową formą łączenia komórek macierzystych z komórkami rogówki w celu rozrostu tkanek)
(Ex vivo - odmiana technik in vitro, różniąca się od nich tym, że materiał biologiczny jest pozyskiwany z żywego organizmu w celu jego modyfikacji in vitro i ponownego podania z powrotem do organizmu, z którego go pozyskano.)
DO badań użyto dwóch różnych populacji UCB MSC, oznaczonych: UCB1 i UCB4 uzyskanych z krwi pępowinowej. Hodowano je w temperaturze 37 ° C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 w pożywce. Wybrano też najbardziej odpowiednie medium, w którym następował najlepszy wzrost komórek.
Komórki hodowano w ciągu 3 tygodni, aby uzyskać wystarczającą ich ilość do eksperymentalnego zastosowania
Źródłem komórek HCECs były komórki wyhodowane z rogówki (HCECs)od ludzkich dawców. Utrzymywane w takich samych warunkach jak UCB. Komórki macierzyste dodano do komórek śródbłonka i hodowano.
Następnie dokonano identyfikacji komórek:
a) pod względem budowy morfologicznej
b) pod względem ekspresji danych genów
Rycina po lewej obrazuje morfologię komórek, którą obserwowano pod mikroskopem z kontrastem fazowym. Oba rodzaje komórek były podłużne (UCB 1 bardziej wydłużone) i tworzyły równoległe skupiska ściśle poukładanych komórek
W celu porównania ekspresji genów komórek UCB i HCECs (ludzkie komórki śródbłonka rogówki) wyizolowano z nich RNA. Podstawowych informacji dotyczących względnej ekspresji genów UCB MSC i HCEC uzyskano na podstawie analizy mikromacierzy. MSC były dołączone do uszkodzonego, ale nienaruszonego, śródbłonka rogówki.
Rycina po prawej pokazuje poziomy ekspresji genów UCB1 i UCB4 a także HCECs od dawców młodych i starszych. Względne poziomy ekspresji genów są przedstawione za pomocą skali kolorów, gdzie czerwony oznacza najniższy a zielony najwyższy poziom ekspresji.
Zgodnie z oczekiwaniami, wzorce ekspresji wykazały większe podobieństwo komórek UCB1 i UCB4 oraz w obrębie HCEC.
Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (Q-PCR) (cDNA zsyntetyzowano z całkowitego RNA używając specyficznych dla lokalizowanych regionów starterów) zweryfikował wyniki mikromacierzy dla określonego podzbioru genów.
Wyniki wskazują, że UCB MSC są w staniue zadomowić się w obszarach przyrannych śródbłonka rogówki zmienić fenotyp UCB MSC, w kierunku komórek HCEC podobnych. Potrzeba dalszych badań, aby określić szczególne warunki mikrośrodowiska które pozwoliłyby inżynierii tkankowej z UCB MSC zastąpić uszkodzone lub chore śródbłonka rogówki.
Wnioski:
- komórki macierzyste pochodzące z krwi pępowinowej stanowią ogromny potencjał do wykorzystania w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej
- Z roku na rok coraz więcej krwi pępowinowej jest gromadzonej, mrożonej i magazynowanej na całym świecie w oczekiwaniu na kliniczne użycie
- najczęściej krew pępowinowa może posłużyć, oprócz wspomnianych tu
komórek wysp trzustkowych czy komórek rogówki, do różnicowania kardiomiocytów, chrząstek czy osteoblasty, czyli komórki kościotwórcze