2011-03-10

1

Badania hemogenetyczne

w medycynie sądowej

Marek Sanak

Collegium Medicum UJ

Genetyka układu głównego ABO krwi człowieka



układ ABO odkryty przez Karla Landsteinera 1900



Cztery fenotypy determinowane przez trzy warianty genu

(allele): I

A

, I

B

, i.



Gen koduje enzym – glikozylotransferaze, na powierzchni

czerwonych krwinek syntezowane są antygeny grupowe: A, B

albo ich brak :O



Różnica między A i B polega na przyłęczeniu przez enzym -N-



Różnica między A i B polega na przyłęczeniu przez enzym  N

galaktozaminy albo galaktozy



antygen = cząsteczka, która może być rozpoznana przez układ

odporności i spowodować produkcje przeciwciał



przeciwciało = immunoglobulina rozpoznająca swoiście

antygen

1930: Karl Landsteiner (Rockefeller Institute)

Przeciwciała układów grupowych
krwi

1.

Naturalnie obecne:

- ABO
- Anti-Hi, P1, E

Powstające w wyniku uodpornienia

2.

W ciąży:

- Rhesus, Kell, Fy

a

+ Others

3.

Po przetoczeniach:

- Rh, Kell, Fy, JK

a

+ Others

2011-03-10

2

Przykład innych grup krwi

wskazane zamiany

aminokwasowe białka

krwinek czerwoncyh

W i

t M

1 (S

Wariant M – seryna 1 (Ser-

1) i glicyna 5 (Gly-5)

Wariant N – leucyna 1 (Leu-

1) i glutamina 5 (Glu-5)

Oznaczanie (typowanie) grup

krwi

schemat interpretacji wyników: + oznacza
zlepianie krwinek

PT 1

PT 2

PT 3

PT 4

Anti A

+

-

+

-

w

e

cia

ła

krwinki pacjentów

A

A

A

n

n

n

t

t

t

i

i

i

B

B

B

-

-

-

+

+

+

+

+

+

-

-

-

Anti AB

+

+

+

-

A

B

AB

O

testo

w

pr

zeciw

krwinki pacjenta vs

testowe przeciwciała

surowica pacjenta vs

testowe krwinki

2011-03-10

3

nowoczesna metoda typowania

grupa krwi

Grupa ?

p

RhD ?

Częstość głównych grup krwi w
Europie

•Grupa O

56%

•Grupa A

31%

•Grupa B

11%

•Grupa AB

2.5%

•Rh (D) dodatni

85%

•Rh (D) ujemny

15%

przy zastosowaniu 8 układów grupowych krwi – w
94% dochodzeń spornego ojcostwa nie można
wykluczyć pozwanego

Trudny początek badań DNA w

medycynie sądowej

lata 1986 - 1994 - dyskusja dotycząca

wartości dowodowej DNA w kontekście

genetyki populacyjnej: Bruce Budowle vs. Eric

Lander

Orenthal James Simpson

2011-03-10

4

Budowa kwasu

deoksyrybonukleonowego (DNA)

sekwencja DNA jest

dziedziczna

AB0
można

badać

sekwen-

sekwen

cjonując

gen

Układ grupowy Rh

2011-03-10

5

polimorfizm długości fragmentów

restrykcyjnych (RFLP)

sonda jednolokusowa – fragmenty

sonda wielolokusowa – fragmenty

restrykcyjne pochodzą z różnych

chromosomów

sonda jednolokusowa fragmenty

restrykcyjne pochodzą z

pojedynczego miejsca w genomie

Badanie profilu DNA

krew

ślad

biologiczny

krew

ślad

biologiczny

krew

ojciec dziecko matka

izolacja DNA

cięcie enzymem

l k

f

elektroforeza

transfer na

membranę

hybrydyzacja z

sondą

detekcja sondy

sygnatura

wielolokusowa

sygnatura

jednolokusowa

krew

ślad

biologiczny

krew

ślad

biologiczny

ojciec dziecko matka

wykorzystanie RFLP w medycynie

sądowej

a

podejrzani

ma

tk

a

dzi

ec

ko

poz

w

an

y 1

poz

w

an

y 2

identyfikacja –

sonda

wielolokusowa

dochodzenie ojcostwa

sondy

jednolokusowe

of

ia

ra

śla

d

sonda 1
M D P

sonda 1
M D P

Ilość DNA w śladach biologicznych

50 l krwi (plama)

5-10 g

50 l nasienia

7-15 g

wymaz z pochwy

0 1 – 3 ng

wymaz z pochwy

0,1 3 ng

cebulka włosa

30 ng

trzon włosa

0,1 ng

do badania metodą RFLP

10 – 20 g / 1 układ

do badania metodą PCR (STR) 1-3 ng / 3-10 układów

2011-03-10

6

Amplifikacja techniką polimerazowej

reakcji łańcuchowej (PCR)

polimorfizm krótkich powtórzeń

tandemowych (STR)

wykorzystanie STR do badania

profilu DNA

wzorzec alleli – „drabinka”

badany ślad DNA

pary

zasad

2011-03-10

7

Identyfikacja śladu – DNA izolowane z fragmentu włosa

Identyfikacja

śladów gwałtu
- DNA

wyizolowane z

barwionego

rozmazu

cytologicznego

Postępowanie z materiałem DNA

zabezpieczonym od podejrzanego

2 wymazy z błony

śluzowej j. ustnej

1 ekstrakcja DNA

pomiar ilości DNA

jeśli pasuje 13 z 14

STR

weryfikacja 2

zlecenie badania DNA

1 przechowywany w

temp. -80ºC

PCR – badanie 14

układów STR przez 2

niezależne osoby,

kontrolowane przez

3 osobę

ocena wyniku

baza danych

profili DNA

weryfikacja 2

próbki

ponowna ocena

świeżo pobranego

materiału DNA

raport o pozytywnej

identyfikacji

Forensic Science Service, Birmingham,

Wlk. Brytania

2011-03-10

8

Moc statystyczna badania DNA zależy od

liczby zbadanych układów

dochodzenie ojcostwa

moc wykluczenia

średnia szansa wykluczenia

TH01

0,62

0,52 (1:2)

kombinacja

identyfikacja śladu

prawdopodobieństwo
przypadkowego dopasowania moc dyskryminacji

6 STR

0,9925

0,9871 (1:80)

TH01

0,352

0,919 (1:12)

kombinacja
6 STR

0,9195

0,999998 (1:0,5 mln)

Moc statystyczna badania DNA

• przy badanych 15 układach STR średni iloraz

wiarygodności identyfikacji:
• ojca biologicznego – badane 3 osoby = > 10

• ojca biologicznego badane 3 osoby > 10

miliardów
• ojca biologicznego – matka nie badana = > 10

milionów
• identyfikacja śladu jednej osoby = > 100

miliardów
• identyfikcja ze śladu pozostawionego przez 2

osoby = > 10 milionów

Inne rodzaje badania DNA

• przy identyfikacji mężczyzny; np. ślady

biologiczne gwałtu, identyfikacja NN, jeśli

dostępni tylko krewni mężczyźni – badanie

układów STR na chromosomie Y
• przy identyfikacji, jeśli dostępny materiał

archiwalny, np. fragment szkieletu, włosa, oraz

materiał porównawczy – badanie DNA

mitochondrialnego
• prawdopodobieństwo identyfikacji, jeśli nie

stwierdza się wykluczenia, tylko na podstawie

częstości wystąpienia profilu w bazie zbadanych

osób

Źródła błędu w ocenie badania

DNA

• badanie nie pozwala na ustalenie kolejności

czasowej naniesienia śladu biologicznego
• w przypadku więcej niż 2 uczestników

zdarzenia pozostawiających ślad oszacowanie

ich liczby, profilu DNA i prawdopodobieństwa

identyfikacji jest mniej wiarygodne
• wiele przedmiotów codziennego użytku

akumuluje materiał DNA pochodzący z

naskórka, śliny i innych wydzielin

•identyfikacja profilu DNA osoby o nieznanym pochodzeniu

etnicznym:

częstość alleli układu STR różni się w populacjach, moc

dyskryminacji 1:100000 w jednej populacji może w innej

wynosić 1:1000

2011-03-10

9

Możliwe przyczyny braku

wiarygodności badania DNA

•ułomność naukowych zasad badania (

poznana

)

•niepowtarzalność procesu badania (

wystandaryzowana

)

•błędy techniczne wykonania testu (

możliwe do wyeliminowania

)

•błędna interpretacja wyniku (

częsty zarzut

)

•błąd negatywny (

błędne wykluczenie podejrzanego

)

•błąd pozytywny (

błędny brak wykluczenia podejrzanego

)

nieświadomy błąd przeciwko podejrzanemu, np.

zaprzestanie dalszego badania po uzyskaniu wyniku

„pasującego”

Zebrane zalecenia dotyczące

badania DNA

•zabezpieczenie 2 próbek, z których jedna jest archiwizowana
•dokumentacja przekazania próbek zgodnie z zasadami

ogólnego postępowania dowodowego
•rozdział przygotowania próbek (np. identyfikacji śladów) od

samego badania DNA

samego badania DNA
•zabezpieczenie dostępu do laboratorium
•zachowanie reguł laboratoryjnych: szkolenia, kontrola

wewnętrzna i zewnętrzna, standaryzacja metod (np. CODIS)
•posiadanie własnej genetycznej bazy danych
•centralizacja badań lub rozdzielenie technicznego procesu

badania od jego opiniowania
•wynik w postaci wykluczenia albo prawdopodobieństwa

przypadkowej identyfikacji

Informacje pomocne w

opracowaniu ekspertyzy DNA

• stopień pokrewieństwa między osobami badanymi (powoduje

zmniejszenie wartości prawdopodobieństwa identyfikacji)
• etniczne pochodzenie osób badanych – jeśli nie są narodowości

polskiej zmienia się częstości alleli i wyliczenia

polskiej zmienia się częstości alleli i wyliczenia

prawdopodobieństwa
• dostępność materiału porównawczego do badania DNA od osób

będących jego potencjalnym źródłem – można identyfikować kto

był współuczestnikem w pozostawieniu śladu
• oszacowanie liczby osób, które mogły brać udział w

pozostawieniu śladu