Metody chromatograficzne

Metody rozdziału mieszanin, w których rozdzielane składniki
ulegają podziałowi między dwie fazy:

Fazę nieruchomą (stacjonarną)

Fazę ruchomą (mobilną)

Faza stacjonarna

( ciecz, ciało stałe)

Faza ruchoma

(gaz ciecz, faza nadkrytyczna

Mechanizm rozdziału chromatograficznego

Mechanizm rozdziału chromatograficznego

(gaz lub ciecz)

FAZA RUCHOMA

FAZA RUCHOMA

FAZA STACJONARNA

FAZA STACJONARNA

Próbka

wychodząca

Próbka

wprowadzana

(ciało stałe lub film cieczy na ciele stałym (nośnik)

O d d z i a ł y w a n i a

O d d z i a ł y w a n i a

Klasyfikacja metod chromatograficznych

A.

Stan skupienia fazy ruchomej

:

Chromatografia gazowa

Chromatografia cieczowa

Chromatografia fluidalna

LSC liquid – solid chromat.

Ciało stałe

Ciecz

GSC gas – solid chromat.

Ciało stałe

Gaz

LLC liquid – liquid chromat.

Ciecz

Ciecz

GLC gas – liquid chromatography

Ciecz

Gaz

Typ chromatografii

Faza stacjonarna

Faza ruchoma

B.

Stan skupienia fazy stacjonarnej

:

•

Chromatografia adsorpcyjna –

powinowactwo adsorpcyjne składników

mieszaniny do powierzchni fazy stacjonarnej (adsorbent)

•

Chromatografia podziałowa –

podział składników mieszaniny między

dwie nie mieszające się fazy (faza stacjonarna : ciecz na nośniku; faza ruchoma:
ciecz, gaz, faza fluidalna)

•

Chromatografia powinowactwa –

równowagi reakcji chemicznej

tworzenia selektywnych kompleksów molekularnych

•

Chromatografia sitowa (filtracja molekularna (żelowa) –

rozmiar

porów fazy stacjonarnej i wielkość cząsteczek rozdzielanych substancji decydują o
rozdziale

•

Chromatografia jonowymienna –

reakcja wymiany jonowej miedzy

jonami z roztworu a jonami związanymi z fazą stacjonarną (jonit). Jonity –
nierozpuszczalne substancje wielkocząsteczkowe posiadające ugrupowania jonowe

(MR

-

—Y

+

) + X

+

 (MR

-

—X

+

) + Y

+

kationit

(MR

+

—Y

-

) + X

-

 (MR

—

X

-

) + Y

-

anionit

C. Natura zjawisk odpowiedzialnych za rozdział

1.

Chromatogram – krzywa elucji

2.

Całkowity czas retencji - t

R

; Całkowita objętość retencji - V

R

.

V

R

= F

0

t

R

, gdzie F

0

jest objętościową prędkością fazy ruchomej

3.

Zerowy czas retencji - t

M

; zerowa objętość retencji - V

M

V

M

= F

0

t

M

,

4.

Zredukowany czas retencji– t’

R

; zredukowana objętość retencji- V’

R

t’

R

= t

R

- t

M

V’

R

= V

R

- V

M

5.

Względny czas retencji

r

i,w

= t’

R,i

/t’

R,w

6.

Współczynnik retencji, k

gdzie n

s

, n

m

to liczba moli substancji X w fazie stacjonarnej i ruchomej, c

s

, c

m

–

stężen0ie składnika X w obu fazach, V

s

, V

m

- objętość fazy stacjonarnej i

ruchomej

Chromatografia - pojęcia i definicje

1.

M

M

R

t

t

t

k

−

=

m

m

s

s

m

s

V

c

V

c

n

n

k

=

=

=

ruchomej

fazie

w

X

moli

liczba

ej

stacjonarn

fazie

w

X

moli

liczba

7. Współczynnik selektywności,

α

8. Zdolność rozdzielcza kolumny, R

gdzie t

R,A

i t

R,B

– czasy retencji składników A i B, w

A

, w

B

- szerokości pików

mierzone przy podstawie, N

B

– liczba półek teoretycznych w odniesieniu do

składnika B

9. Prędkość liniowa,

µ

x

,

µ

m

gdzie L – długość kolumny

A

B

M

A

R

M

B

R

k

k

t

t

t

t

=

−

−

=

,

,

α

Chromatografia - pojęcia i definicje

( )

2

/

1

,

,

1

1

4

1

2

B

B

B

B

A

A

R

B

R

s

N

k

k

w

w

t

t

R













+













−

=

−

=

α

α

M

m

R

X

t

L

t

L

/

oraz

/

=

=

µ

µ

Podstawowe równanie chromatografii podziałowej

gdzie K – współczynnik podziału Nernsta

Podstawowe równanie chromatografii adsorpcyjnej

gdzie A jest powierzchnią adsorbenta, K

A

– współczynnik adsorpcji

s

m

m

s

m

R

KV

V

V

V

K

V

+

=

+

=

)

1

(

V

A

K

V

A

m

R

+

=

V

)

1

(

m

s

m

R

V

V

K

L

t

+

=

µ

Wnioski:



wzrost wartości współczynnika podziału Nernsta (K) [K

A

] powoduje

wydłużenie czasu retencji



wzrost objętości fazy stacjonarnej (V

s

) powoduje wzrost czasu retencji



zwiększenie szybkości przepływu fazy ruchomej (

µ

m

) powoduje skrócenie

czasu retencji



czas retencji wzrasta wraz z długością kolumny (L)

Optymalizacja procesu chromatograficznego

Wygląd typowego chromatogramu

•

Na początku chromatogramu piki są ostre ale słabo rozdzielone

•

Istnieje przedział czasów retencji gdzie piki są ostre i dobrze rozdzielone

•

Przy długich czasach retencji piki są rozdzielone ale rozmyte

Sprawność kolumny decyduje o tym czy pik jest ostry czy rozmyty.
Natomiast o sprawności kolumny decyduje tzw.

wysokość równoważna półce teoretycznej – WRPT

(height equivalent to a theoretical plate – HETP)

Półka teoretyczna

–

objętość kolumny na której zostaje osiągnięty stan

równowagi między stężeniem substancji w fazie ruchomej i stacjonarnej.

Kolumna składa się z N hipotetycznych półek teoretycznych

L = NH

gdzie

L

– długość kolumny,

H

(WRPT) – wysokość równoważna półce

teoretycznej, N – liczba półek

.

Sprawność kolumn chromatograficznych

W oparciu o parametry piku można wyznaczyć

liczbę półek teoretycznych

korzystając z dowolnego wzoru

:

N = (t

R

/

σσσσ

)

2

N = 5.54(t

R

/W

1/2

)

2

N = 16(t

R

/W

b

)

2

gdzie

σ

– odchylenie standardowe piku (szerokość na wysokości równej 0,882h),

W

1/2

– szerokość połówkowa piku, W

b

– szerokość piku na linii podstawy

Wprowadzając zredukowany czas retencji (t’

R

= t

R

– t

M

, obliczamy

tzw. efektywną liczbę półek teoretycznych (N

ef

):

N

ef

= 5.54[(t

R

– t

M

)/W

1/2

]

2

N

ef

= N[k/(1+k)]

2

Teoria kinetyczna – Równanie Van Deemtera

WRPT zależy od następujących czynników:

•

Dyfuzji wirowej związanej z wypełnieniem kolumny, A

•

Dyfuzji podłużnej (ruch cząsteczek w fazie ruchomej), B

•

Oporu przenoszenia masy, C

H = A + B/u +Cu

Funkcja ta jest równaniem hiperboli
ilustrującej zależność wysokości półki
od prędkości przepływu fazy ruchomej.
Funkcja posiada minimum wskazujące
na optymalną

szybkość

przepływu

gwarantującą

minimalną

wartość

WRPT

•

Dobór szybkości przepływu fazy ruchomej

Dobór długości i średnicy kolumny oraz wypełnienia
gwarantujący minimalne wartości parametrów A, B, C w
równaniu Van Deemtera

•

Dobór optymalnej temperatury rozdziału (hiperbola)

H = A’ + B’/T + C’T

Równanie Van Deemtera

H = A + B/u +Cu

Wnioski:

Sprawność

kolumny można zwiększyć
obniżając wysokość półki
teoretycznej (H) przez:

Wpływ Temperatury

Typy chromatografii gazowej:

•

Chromatografia w układzie gaz – ciało stałe;

adsorpcyjna chromatografia gazowa

- (GSC – gas –

solid Chromatography)

•

Chromatografia w układzie gaz –

ciecz ;

chromatografia gazowa podziałowa

(GLC – gas –

liquid chromatography)

Chromatografia gazowa

filtry

A

ir

H

y

d

ro

g

e

n

G

a

s

C

a

rr

ie

r

kolumna

Chromatograf gazowy

Data system

dozownik

Wlot gazu

detektor

Reduktory

gazowe

H

RESET

Aparatura GC

- części składowe

•

Zbiornik gazu nośnego (gas inlets)

•

Regulator przepływu gazu nośnego (pneumatic controls)

•

Dozownik (Injector)

•

Kolumna chromatograficzna (column)

•

Termostat dozownika, kolumny i detektora (thermostated oven)

•

Detektor i wzmacniacz (detector ande amplifier)

•

Integrator, rejestrator, PC (Data system)

Wymagania:

Chemicznie obojętny w stosunku do wypełnienia kolumny jak i do
składników analizy

•

Pomijalny wpływ na wynik rozdziału chromatograficznego

•

Kompatybilność z używanym detektorem (np. duże

przewodnictwo cieplne w przypadku detektora
termokonduktometrycznego)

Przewodnictwa cieplne niektórych gazów

Gaz nośny

0.71

0.96

0.93

0.65

1.04

1.02

6.2

7.1

Przewodnictwo
cieplne

Ar

CO

NO

N

2

O

O

2

N

2

He

H

2

gaz

Urządzenie służące do wprowadzania próbki w strumień gazu
nośnego; jest termostatowane - łatwe odparowanie próbki

•

Małą objętość – nie zakłócać równowagi ciśnienia w układzie

•

Powtarzalność (ilość i sposób wprowadzonej próbki)

Rodzaje dozowników

a)

dozowniki dla kolumn z wypełnieniem – strzykawki lub zawory dozujące z

pętlą - przekłucie membrany silikonowej

•

ciała stałe – roztwór w łatwo lotnym rozpuszczalniku dozuje się podobnie jak

ciecze lub wprowadzane bezpośrednio do dozownika (zatopiona kapilara
ulegająca zbiciu w komorze dozownika)

•

gazy – strzykawki o pojemności do 20 ml, lub zawory sześciodrożne z

pętlą

b)

dozowniki do kolumn kapilarnych – dzielniki czyli splitery -

wprowadzenie niewielkiej ilości próbki na kolumnę (od 0,1 –10%)

Dozowniki

Dozownik GC

Typy Dozowników

SPME – solid phase microextraction (mikroekstrakcja do fazy stałej

Kolumny i wypełnienia chromatograficzne

Typy kolumn:

a)

kolumny z wypełnieniem

•

preparatywne (średnica wewnętrzna 2,5 – 5cm; długość 1 – 16

m)

•

analityczne (średnica wewnętrzna 2 – 6 mm; długość 0,5 – 3 m).

•

mikropakowane (śr. wew. 0,8 – 1,2 mm; dł. kilkanaście metrów

b)

kolumny o przekroju otwartym

–

kapilarne

– wykonane ze szkła

lub topionego kwarcu (średnica wewnętrzna 0,1 – 1 mm; długość 10
– 300 m).

Kolumny o przekroju otwartym

Ciekła faza
stacjonarna

Nośnik stały
pokryty ciekłą
fazą stacjonarną

Stała faza
stacjonarna
(adsorbent)

Kolumny kapilarne GC

• Kapilara wykonana ze stopionej krzemionki

• Zewnętrzna warstwa Poliamidu –mechaniczna wytrzymałość

• Ciekła faza stacjonarna pokrywa wnętrze kapilary

• 0.1 - 0.53 mm + ID, 5-100 metrów długości, film fazy
stacjonarnej 0.10 do 1.5

µ

m grubości

• Montowane (zwijane) na ramie ze sztywnego drutu

A)

adsorbenty w chromatografii gazowej gaz – ciało stałe (GSC)

•

adsorbenty węglowe (np. węgle aktywowane)– rozdział gazów

•

ż

ele krzemionkowe – rozdział mieszanin gazów obojętnych

•

sita molekularne – (zeolity – glinokrzemiany) – szersze

zastosowanie

•

polimery porowate (np., kopolimer diwinylobenzenu i styrenu)

– powszechnie stosowane adsorbenty w GSC

Wypełnienia kolumn

Wypełnienia kolumn

Ciekłe fazy stacjonarne - Wymagania:

1.

zdolność rozpuszczania składników rozdzielanej mieszaniny

2.

chemicznie obojętny względem nośnika i substancji

rozdzielanych

3.

mała lotność i termiczna stabilność

4.

mała lepkość

5.

duża selektywność rozdziału (różne czasy retencji dla dwóch

składników o tej samej temperaturze wrzenia i innej budowie)

O wyborze fazy stacjonarnej decyduje głównie kryterium
polarności

Na niepolarnej fazie stacjonarnej substancje polarne
eluowane są szybciej niż niepolarne o tej samej temp.
wrzenia i odwrotnie

Trzy grupy faz stacjonarnych:



fazy niepolarne - długo-łańcuchowe alkany

np. Skwalan 2,6,10,14,18,22-heksametylotetrakozan



fazy średnio polarne – np. silikony (oleje, smary, żywice)

Dimetylosilikony (OV-1,SE-30)



fazy polarne - np. glikole polietylenowe

HO—CH

2

—CH

2

—[O—CH

2

—CH

2

]

n

—O—CH

2

—CH

2

—OH

Handlowe nazwy: Carbowax 400, 1000, 4000

H

3

C

Si

H

3

C

H

3

C

O

Si

CH

3

CH

3

O

Si

CH

3

CH

3

CH

3

n

Fazy stacjonarne

do kolumn

kapilarnych

Polarność a klasa związku chemicznego

Detektory

Wymagania:

Dobra czułość i wykrywalność

Szeroki zakres liniowości sygnału

Stabilność wskazań i niski poziom szumów

Selektywność lub uniwersalność wskazań

Łatwość obsługi

Niski koszt

Rodzaje detektorów:

1) katarometr – detektor termokonduktometryczny (thermal
conductivity detector – TCD)

detektor uniwersalny, stężeniowy – bazuje na wrażliwości
niektórych oporników na małe zmiany temperatury.

Gaz nośny – wodór, hel

detektor uniwersalny – bazuje na
zmianie przewodności elektrycznej
atmosfery płomienia (wodór –
powietrze) – w momencie spalania
związku organicznego pojawiają
się

karbojony.

Sygnał

jest

proporcjonalny do liczby atomów
węgla nie związanych z tlenem.
Czułość – 10

-12

g. Gaz nośny –

azot, hel.

1) Detektor płomieniowo – jonizacyjny

(flame ionisation detector – FID)

-

Flame

O

,

H

e

CHO

O

CH

2

2

+

→

+

+

Detektor

selektywny

na

chlorowce

np.

chloropestycydy,

halotony. Czułość – 10

-14

g/ml gazu

nośnego.

Zasada działania:

ź

ródło promieni

β(

63

Νι)

jonizuje

gaz nośny

β

+N

2

 N

2

+

+ e

wychwyt elektronu przez halogen

X + e

 X

-

X

-

+ N

2

+

= X + N

2

rekombinacja jonów (prąd spada)

Detektor wychwytu elektronu

(electron capture detector – ECD)

Chromatografia gazowa – spektrometria mas (

GC – MS

)

Sprzężenie GC z MS przez tzw. separator

a)

dyfuzyjny (gaz nośny odpompowany przez rurkę ze spieku

b)

separator typu „jet” – lekkie cząsteczki gazu nośnego ulegają odparowaniu

przy rozprężeniu, cięższe cząstki substancji badanej trafiają do kapilary
wejściowej MS

c)

separator membranowy – przez organofilową membranę łatwiej dyfundują

cząsteczki substancji analizowanej

chromatograf gazowy – spektrofotometr IR (

GC –IR

). Stosowane

spektrofotometry z transformacją Fouriera – szybki zapis.

Chromatografia gazowa – spektrofotometr emisji atomowej (

GC – ICP

(inductively coupled plasma) lub GC – MIP(microwave couplede plasma)).
Szczególnie przydatny do rozdziału związków metaloorganicznych. Pozwala na
detekcję zarówno metali jak i C, h, D, O, N, F, Cl, Br, I, S, P. umożliwia
otrzymanie informacji o składzie pierwiastkowym substancji (piku).

Sprzężenie chromatografii gazowej z technikami

spektroskopowymi

Parametry analityczne detektorów GC

Zastosowanie GC

/Analiza jakościowa

a)

na podstawie parametrów retencji – w takich samych

warunkach rozdziału substancja ma zawsze takie same
charakterystyki retencyjne.

b)

Identyfikacja substancji poprzez porównanie z wzorcem (test

na obecność lub nieobecność związku). Najkorzystniej stosować
zredukowany (względny) czas retencji – jest on nieczuły na szereg
warunków eksperymentalnych.

c)

Badanie nieznanej substancji względem wzorca heksanu na

trzech różnych fazach stacjonarnych w stałej temperaturze

M

s

R

M

a

R

s

a

t

t

t

t

r

−

−

=

,

,

,

Wstępna identyfikacja nieznanej substancji

Response

GC Retention Time on Carbowax-20 (min)

Mixture of known compounds

Hexane

Octane

Decane

1.6 min = RT

Response

Unknown compound may be Hexane

1.6 min = RT

Retention Time on Carbowax-20 (min)

Response

GC Retention Time on SE-30

Unknown compound

RT= 4 min on SE-30

Response

GC Retention Time on SE-30

Hexane

RT= 4.0 min on SE-30

Czasy retencji

M

s

R

M

a

R

s

a

t

t

t

t

r

−

−

=

,

,

,

Analiza ilościowa

Podstawa analizy ilościowej – wysokość piku (h) lub jego
powierzchnia (A): h = f (c),

A = f (c),

Dla pików symetrycznych A = hW

0,5

A = h[(W

0,15

+ W

0,85

)/2]

Lub korzystając z oprogramowania – integracja numeryczna z
korekcją lini bazowej

Metody analizy ilościowej

a) metoda kalibracji bezwzględnej – wzorca zewnętrznego

b) metoda wzorca wewnętrznego

c) metoda normalizacji wewnętrznej

Półilościowa analiza kwasów tłuszczowych

C

C

C

Detector Response

Retention Time

14

16

18

Peak Area (cm )

Sample Concentration (mg/ml)

2

4

6

8

10

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

2

T h e c o n te n t % o f C f a tt y a c id s =

C

C + C + C

1 0 0

∗

1 4

1 8

1 6

1 4

= th e c o n te n t % o f C fa tty a c id s

1 4

1 4

Przykłady rozdziałów GC

Przykłady rozdziałów GC

Wady Chromatografii Gazowej

Substancje lotne w temp ~250

o

C bez rozkładu

R C OH CH

3

OH H

2

SO

4

O

R C O CH

3

O

CH

2

O C R

CH O C R

CH

2

O C R

O

O

O

CH

3

OH

O

R C O CH

3

CH

3

ONa

Fatty Acids

Methylester

Reflux

+

3

Lotny

w Gas

Chromatography

Lotny

w Gas

Chromatography

+

+

Rozdział kwasów tłuszczowych po

derywatyzacji

Zalety GC

1.

Bardzo dobre rozdziały

2.

Krótki czas analizy

3.

Mała objętość próbki -

µ

l

4.

Dobry system detekcji

5.

Przydatna do analizy ilościowej