Metody chromatograficzne
Metody rozdziału mieszanin, w których rozdzielane składniki
ulegają podziałowi między dwie fazy:
Fazę nieruchomą (stacjonarną)
Fazę ruchomą (mobilną)
Faza stacjonarna
( ciecz, ciało stałe)
Faza ruchoma
(gaz ciecz, faza nadkrytyczna
Mechanizm rozdziału chromatograficznego
Mechanizm rozdziału chromatograficznego
(gaz lub ciecz)
FAZA RUCHOMA
FAZA RUCHOMA
FAZA STACJONARNA
FAZA STACJONARNA
Próbka
wychodząca
Próbka
wprowadzana
(ciało stałe lub film cieczy na ciele stałym (nośnik)
O d d z i a ł y w a n i a
O d d z i a ł y w a n i a
Klasyfikacja metod chromatograficznych
A.
Stan skupienia fazy ruchomej
:
Chromatografia gazowa
Chromatografia cieczowa
Chromatografia fluidalna
LSC liquid – solid chromat.
Ciało stałe
Ciecz
GSC gas – solid chromat.
Ciało stałe
Gaz
LLC liquid – liquid chromat.
Ciecz
Ciecz
GLC gas – liquid chromatography
Ciecz
Gaz
Typ chromatografii
Faza stacjonarna
Faza ruchoma
B.
Stan skupienia fazy stacjonarnej
:
•
Chromatografia adsorpcyjna –
powinowactwo adsorpcyjne składników
mieszaniny do powierzchni fazy stacjonarnej (adsorbent)
•
Chromatografia podziałowa –
podział składników mieszaniny między
dwie nie mieszające się fazy (faza stacjonarna : ciecz na nośniku; faza ruchoma:
ciecz, gaz, faza fluidalna)
•
Chromatografia powinowactwa –
równowagi reakcji chemicznej
tworzenia selektywnych kompleksów molekularnych
•
Chromatografia sitowa (filtracja molekularna (Ŝelowa) –
rozmiar
porów fazy stacjonarnej i wielkość cząsteczek rozdzielanych substancji decydują o
rozdziale
•
Chromatografia jonowymienna –
reakcja wymiany jonowej miedzy
jonami z roztworu a jonami związanymi z fazą stacjonarną (jonit). Jonity –
nierozpuszczalne substancje wielkocząsteczkowe posiadające ugrupowania jonowe
(MR
-
—Y
+
) + X
+
(MR
-
—X
+
) + Y
+
kationit
(MR
+
—Y
-
) + X
-
(MR
—
X
-
) + Y
-
anionit
C. Natura zjawisk odpowiedzialnych za rozdział
1.
Chromatogram – krzywa elucji
2.
Całkowity czas retencji - t
R
; Całkowita objętość retencji - V
R
.
V
R
= F
0
t
R
, gdzie F
0
jest objętościową prędkością fazy ruchomej
3.
Zerowy czas retencji - t
M
; zerowa objętość retencji - V
M
V
M
= F
0
t
M
,
4.
Zredukowany czas retencji– t’
R
; zredukowana objętość retencji- V’
R
t’
R
= t
R
- t
M
V’
R
= V
R
- V
M
5.
Względny czas retencji
r
i,w
= t’
R,i
/t’
R,w
6.
Współczynnik retencji, k
gdzie n
s
, n
m
to liczba moli substancji X w fazie stacjonarnej i ruchomej, c
s
, c
m
–
stęŜen0ie składnika X w obu fazach, V
s
, V
m
- objętość fazy stacjonarnej i
ruchomej
Chromatografia - pojęcia i definicje
1.
M
M
R
t
t
t
k
−
=
m
m
s
s
m
s
V
c
V
c
n
n
k
=
=
=
ruchomej
fazie
w
X
moli
liczba
ej
stacjonarn
fazie
w
X
moli
liczba
7. Współczynnik selektywności,
α
8. Zdolność rozdzielcza kolumny, R
gdzie t
R,A
i t
R,B
– czasy retencji składników A i B, w
A
, w
B
- szerokości pików
mierzone przy podstawie, N
B
– liczba półek teoretycznych w odniesieniu do
składnika B
9. Prędkość liniowa,
µ
x
,
µ
m
gdzie L – długość kolumny
A
B
M
A
R
M
B
R
k
k
t
t
t
t
=
−
−
=
,
,
α
Chromatografia - pojęcia i definicje
( )
2
/
1
,
,
1
1
4
1
2
B
B
B
B
A
A
R
B
R
s
N
k
k
w
w
t
t
R
+
−
=
−
=
α
α
M
m
R
X
t
L
t
L
/
oraz
/
=
=
µ
µ
Podstawowe równanie chromatografii podziałowej
gdzie K – współczynnik podziału Nernsta
Podstawowe równanie chromatografii adsorpcyjnej
gdzie A jest powierzchnią adsorbenta, K
A
– współczynnik adsorpcji
s
m
m
s
m
R
KV
V
V
V
K
V
+
=
+
=
)
1
(
V
A
K
V
A
m
R
+
=
V
)
1
(
m
s
m
R
V
V
K
L
t
+
=
µ
Wnioski:
wzrost wartości współczynnika podziału Nernsta (K) [K
A
] powoduje
wydłuŜenie czasu retencji
wzrost objętości fazy stacjonarnej (V
s
) powoduje wzrost czasu retencji
zwiększenie szybkości przepływu fazy ruchomej (
µ
m
) powoduje skrócenie
czasu retencji
czas retencji wzrasta wraz z długością kolumny (L)
Optymalizacja procesu chromatograficznego
Wygląd typowego chromatogramu
•
Na początku chromatogramu piki są ostre ale słabo rozdzielone
•
Istnieje przedział czasów retencji gdzie piki są ostre i dobrze rozdzielone
•
Przy długich czasach retencji piki są rozdzielone ale rozmyte
Sprawność kolumny decyduje o tym czy pik jest ostry czy rozmyty.
Natomiast o sprawności kolumny decyduje tzw.
wysokość równowaŜna półce teoretycznej – WRPT
(height equivalent to a theoretical plate – HETP)
Półka teoretyczna
–
objętość kolumny na której zostaje osiągnięty stan
równowagi między stęŜeniem substancji w fazie ruchomej i stacjonarnej.
Kolumna składa się z N hipotetycznych półek teoretycznych
L = NH
gdzie
L
– długość kolumny,
H
(WRPT) – wysokość równowaŜna półce
teoretycznej, N – liczba półek
.
Sprawność kolumn chromatograficznych
W oparciu o parametry piku moŜna wyznaczyć
liczbę półek teoretycznych
korzystając z dowolnego wzoru
:
N = (t
R
/
σσσσ
)
2
N = 5.54(t
R
/W
1/2
)
2
N = 16(t
R
/W
b
)
2
gdzie
σ
– odchylenie standardowe piku (szerokość na wysokości równej 0,882h),
W
1/2
– szerokość połówkowa piku, W
b
– szerokość piku na linii podstawy
Wprowadzając zredukowany czas retencji (t’
R
= t
R
– t
M
, obliczamy
tzw. efektywną liczbę półek teoretycznych (N
ef
):
N
ef
= 5.54[(t
R
– t
M
)/W
1/2
]
2
N
ef
= N[k/(1+k)]
2
Teoria kinetyczna – Równanie Van Deemtera
WRPT zaleŜy od następujących czynników:
•
Dyfuzji wirowej związanej z wypełnieniem kolumny, A
•
Dyfuzji podłuŜnej (ruch cząsteczek w fazie ruchomej), B
•
Oporu przenoszenia masy, C
H = A + B/u +Cu
Funkcja ta jest równaniem hiperboli
ilustrującej zaleŜność wysokości półki
od prędkości przepływu fazy ruchomej.
Funkcja posiada minimum wskazujące
na optymalną
szybkość
przepływu
gwarantującą
minimalną
wartość
WRPT
•
Dobór szybkości przepływu fazy ruchomej
Dobór długości i średnicy kolumny oraz wypełnienia
gwarantujący minimalne wartości parametrów A, B, C w
równaniu Van Deemtera
•
Dobór optymalnej temperatury rozdziału (hiperbola)
H = A’ + B’/T + C’T
Równanie Van Deemtera
H = A + B/u +Cu
Wnioski:
Sprawność
kolumny moŜna zwiększyć
obniŜając wysokość półki
teoretycznej (H) przez:
Wpływ Temperatury
Typy chromatografii gazowej:
•
Chromatografia w układzie gaz – ciało stałe;
adsorpcyjna chromatografia gazowa
- (GSC – gas –
solid Chromatography)
•
Chromatografia w układzie gaz –
ciecz ;
chromatografia gazowa podziałowa
(GLC – gas –
liquid chromatography)
Chromatografia gazowa
filtry
A
ir
H
y
d
ro
g
e
n
G
a
s
C
a
rr
ie
r
kolumna
Chromatograf gazowy
Data system
dozownik
Wlot gazu
detektor
Reduktory
gazowe
H
RESET
Aparatura GC
- części składowe
•
Zbiornik gazu nośnego (gas inlets)
•
Regulator przepływu gazu nośnego (pneumatic controls)
•
Dozownik (Injector)
•
Kolumna chromatograficzna (column)
•
Termostat dozownika, kolumny i detektora (thermostated oven)
•
Detektor i wzmacniacz (detector ande amplifier)
•
Integrator, rejestrator, PC (Data system)
Wymagania:
Chemicznie obojętny w stosunku do wypełnienia kolumny jak i do
składników analizy
•
Pomijalny wpływ na wynik rozdziału chromatograficznego
•
Kompatybilność z uŜywanym detektorem (np. duŜe
przewodnictwo cieplne w przypadku detektora
termokonduktometrycznego)
Przewodnictwa cieplne niektórych gazów
Gaz nośny
0.71
0.96
0.93
0.65
1.04
1.02
6.2
7.1
Przewodnictwo
cieplne
Ar
CO
NO
N
2
O
O
2
N
2
He
H
2
gaz
Urządzenie słuŜące do wprowadzania próbki w strumień gazu
nośnego; jest termostatowane - łatwe odparowanie próbki
•
Małą objętość – nie zakłócać równowagi ciśnienia w układzie
•
Powtarzalność (ilość i sposób wprowadzonej próbki)
Rodzaje dozowników
a)
dozowniki dla kolumn z wypełnieniem – strzykawki lub zawory dozujące z
pętlą - przekłucie membrany silikonowej
•
ciała stałe – roztwór w łatwo lotnym rozpuszczalniku dozuje się podobnie jak
ciecze lub wprowadzane bezpośrednio do dozownika (zatopiona kapilara
ulegająca zbiciu w komorze dozownika)
•
gazy – strzykawki o pojemności do 20 ml, lub zawory sześciodroŜne z
pętlą
b)
dozowniki do kolumn kapilarnych – dzielniki czyli splitery -
wprowadzenie niewielkiej ilości próbki na kolumnę (od 0,1 –10%)
Dozowniki
Dozownik GC
Typy Dozowników
SPME – solid phase microextraction (mikroekstrakcja do fazy stałej
Kolumny i wypełnienia chromatograficzne
Typy kolumn:
a)
kolumny z wypełnieniem
•
preparatywne (średnica wewnętrzna 2,5 – 5cm; długość 1 – 16
m)
•
analityczne (średnica wewnętrzna 2 – 6 mm; długość 0,5 – 3 m).
•
mikropakowane (śr. wew. 0,8 – 1,2 mm; dł. kilkanaście metrów
b)
kolumny o przekroju otwartym
–
kapilarne
– wykonane ze szkła
lub topionego kwarcu (średnica wewnętrzna 0,1 – 1 mm; długość 10
– 300 m).
Kolumny o przekroju otwartym
Ciekła faza
stacjonarna
Nośnik stały
pokryty ciekłą
fazą stacjonarną
Stała faza
stacjonarna
(adsorbent)
Kolumny kapilarne GC
• Kapilara wykonana ze stopionej krzemionki
• Zewnętrzna warstwa Poliamidu –mechaniczna wytrzymałość
• Ciekła faza stacjonarna pokrywa wnętrze kapilary
• 0.1 - 0.53 mm + ID, 5-100 metrów długości, film fazy
stacjonarnej 0.10 do 1.5
µ
m grubości
• Montowane (zwijane) na ramie ze sztywnego drutu
A)
adsorbenty w chromatografii gazowej gaz – ciało stałe (GSC)
•
adsorbenty węglowe (np. węgle aktywowane)– rozdział gazów
•
Ŝ
ele krzemionkowe – rozdział mieszanin gazów obojętnych
•
sita molekularne – (zeolity – glinokrzemiany) – szersze
zastosowanie
•
polimery porowate (np., kopolimer diwinylobenzenu i styrenu)
– powszechnie stosowane adsorbenty w GSC
Wypełnienia kolumn
Wypełnienia kolumn
Ciekłe fazy stacjonarne - Wymagania:
1.
zdolność rozpuszczania składników rozdzielanej mieszaniny
2.
chemicznie obojętny względem nośnika i substancji
rozdzielanych
3.
mała lotność i termiczna stabilność
4.
mała lepkość
5.
duŜa selektywność rozdziału (róŜne czasy retencji dla dwóch
składników o tej samej temperaturze wrzenia i innej budowie)
O wyborze fazy stacjonarnej decyduje głównie kryterium
polarności
Na niepolarnej fazie stacjonarnej substancje polarne
eluowane są szybciej niŜ niepolarne o tej samej temp.
wrzenia i odwrotnie
Trzy grupy faz stacjonarnych:
fazy niepolarne - długo-łańcuchowe alkany
np. Skwalan 2,6,10,14,18,22-heksametylotetrakozan
fazy średnio polarne – np. silikony (oleje, smary, Ŝywice)
Dimetylosilikony (OV-1,SE-30)
fazy polarne - np. glikole polietylenowe
HO—CH
2
—CH
2
—[O—CH
2
—CH
2
]
n
—O—CH
2
—CH
2
—OH
Handlowe nazwy: Carbowax 400, 1000, 4000
H
3
C
Si
H
3
C
H
3
C
O
Si
CH
3
CH
3
O
Si
CH
3
CH
3
CH
3
n
Fazy stacjonarne
do kolumn
kapilarnych
Polarność a klasa związku chemicznego
Detektory
Wymagania:
Dobra czułość i wykrywalność
Szeroki zakres liniowości sygnału
Stabilność wskazań i niski poziom szumów
Selektywność lub uniwersalność wskazań
Łatwość obsługi
Niski koszt
Rodzaje detektorów:
1) katarometr – detektor termokonduktometryczny (thermal
conductivity detector – TCD)
detektor uniwersalny, stęŜeniowy – bazuje na wraŜliwości
niektórych oporników na małe zmiany temperatury.
Gaz nośny – wodór, hel
detektor uniwersalny – bazuje na
zmianie przewodności elektrycznej
atmosfery płomienia (wodór –
powietrze) – w momencie spalania
związku organicznego pojawiają
się
karbojony.
Sygnał
jest
proporcjonalny do liczby atomów
węgla nie związanych z tlenem.
Czułość – 10
-12
g. Gaz nośny –
azot, hel.
1) Detektor płomieniowo – jonizacyjny
(flame ionisation detector – FID)
-
Flame
O
,
H
e
CHO
O
CH
2
2
+
→
+
+
Detektor
selektywny
na
chlorowce
np.
chloropestycydy,
halotony. Czułość – 10
-14
g/ml gazu
nośnego.
Zasada działania:
ź
ródło promieni
β(
63
Νι)
jonizuje
gaz nośny
β
+N
2
N
2
+
+ e
wychwyt elektronu przez halogen
X + e
X
-
X
-
+ N
2
+
= X + N
2
rekombinacja jonów (prąd spada)
Detektor wychwytu elektronu
(electron capture detector – ECD)
Chromatografia gazowa – spektrometria mas (
GC – MS
)
SprzęŜenie GC z MS przez tzw. separator
a)
dyfuzyjny (gaz nośny odpompowany przez rurkę ze spieku
b)
separator typu „jet” – lekkie cząsteczki gazu nośnego ulegają odparowaniu
przy rozpręŜeniu, cięŜsze cząstki substancji badanej trafiają do kapilary
wejściowej MS
c)
separator membranowy – przez organofilową membranę łatwiej dyfundują
cząsteczki substancji analizowanej
chromatograf gazowy – spektrofotometr IR (
GC –IR
). Stosowane
spektrofotometry z transformacją Fouriera – szybki zapis.
Chromatografia gazowa – spektrofotometr emisji atomowej (
GC – ICP
(inductively coupled plasma) lub GC – MIP(microwave couplede plasma)).
Szczególnie przydatny do rozdziału związków metaloorganicznych. Pozwala na
detekcję zarówno metali jak i C, h, D, O, N, F, Cl, Br, I, S, P. umoŜliwia
otrzymanie informacji o składzie pierwiastkowym substancji (piku).
SprzęŜenie chromatografii gazowej z technikami
spektroskopowymi
Parametry analityczne detektorów GC
Zastosowanie GC
/Analiza jakościowa
a)
na podstawie parametrów retencji – w takich samych
warunkach rozdziału substancja ma zawsze takie same
charakterystyki retencyjne.
b)
Identyfikacja substancji poprzez porównanie z wzorcem (test
na obecność lub nieobecność związku). Najkorzystniej stosować
zredukowany (względny) czas retencji – jest on nieczuły na szereg
warunków eksperymentalnych.
c)
Badanie nieznanej substancji względem wzorca heksanu na
trzech róŜnych fazach stacjonarnych w stałej temperaturze
M
s
R
M
a
R
s
a
t
t
t
t
r
−
−
=
,
,
,
Wstępna identyfikacja nieznanej substancji
Response
GC Retention Time on Carbowax-20 (min)
Mixture of known compounds
Hexane
Octane
Decane
1.6 min = RT
Response
Unknown compound may be Hexane
1.6 min = RT
Retention Time on Carbowax-20 (min)
Response
GC Retention Time on SE-30
Unknown compound
RT= 4 min on SE-30
Response
GC Retention Time on SE-30
Hexane
RT= 4.0 min on SE-30
Czasy retencji
M
s
R
M
a
R
s
a
t
t
t
t
r
−
−
=
,
,
,
Analiza ilościowa
Podstawa analizy ilościowej – wysokość piku (h) lub jego
powierzchnia (A): h = f (c),
A = f (c),
Dla pików symetrycznych A = hW
0,5
A = h[(W
0,15
+ W
0,85
)/2]
Lub korzystając z oprogramowania – integracja numeryczna z
korekcją lini bazowej
Metody analizy ilościowej
a) metoda kalibracji bezwzględnej – wzorca zewnętrznego
b) metoda wzorca wewnętrznego
c) metoda normalizacji wewnętrznej
Półilościowa analiza kwasów tłuszczowych
C
C
C
Detector Response
Retention Time
14
16
18
Peak Area (cm )
Sample Concentration (mg/ml)
2
4
6
8
10
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
2
T h e c o n te n t % o f C f a tt y a c id s =
C
C + C + C
1 0 0
∗
1 4
1 8
1 6
1 4
= th e c o n te n t % o f C fa tty a c id s
1 4
1 4
Przykłady rozdziałów GC
Przykłady rozdziałów GC
Wady Chromatografii Gazowej
Substancje lotne w temp ~250
o
C bez rozkładu
R C OH CH
3
OH H
2
SO
4
O
R C O CH
3
O
CH
2
O C R
CH O C R
CH
2
O C R
O
O
O
CH
3
OH
O
R C O CH
3
CH
3
ONa
Fatty Acids
Methylester
Reflux
+
3
Lotny
w Gas
Chromatography
Lotny
w Gas
Chromatography
+
+
Rozdział kwasów tłuszczowych po
derywatyzacji
Zalety GC
1.
Bardzo dobre rozdziały
2.
Krótki czas analizy
3.
Mała objętość próbki -
µ
l
4.
Dobry system detekcji
5.
Przydatna do analizy ilościowej