1 

 

BIOCHEMIA 

materiały dydaktyczne dla studentów WNoZ 

Mirosława Kaszkowiak, Krzysztof Kaszkowiak 

 

                

Spis treści 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

REGULAMIN......................................................................................... 

2 

ZASADY BEZPIECZEŃSTWA I HIGIENY PRACY ………………….. 

3 

1.WĘGLOWODANY............................................................................. 

4 

1.1 JEDNO- i DWUCUKRY ................................................................... 

4 

1.2 WIELOCUKRY................................................................................. 

10 

2. TŁUSZCZE  ...................................................................................... 

13 

2.1. TŁUSZCZE PROSTE....................................................................... 

13 

2.2 TŁUSZCZE ZŁOŻONE .................................................................... 

15 

3. AMINOKWASY i BIAŁKA  ............................................................ 

17 

3.1. AMINOKWASY   ............................................................................ 

18 

3.2. BIAŁKA .......................................................................................... 

21 

4. KWASY NUKLEINOWE................................................................. 

25 

5. ENZYMY........................................................................................... 

27 

6. ANALIZA PŁYNÓW USTROJOWYCH......................................... 

31 

6.1. KREW.............................................................................................. 

31 

6.2. MOCZ.............................................................................................. 

34 

Piśmiennictwo uzupełniające  

 

1.  Kłyszejko-Stefanowicz L.(red), Ćwiczenia z biochemii. PWN, 

Warszawa 2003. 

2.  Ostrowski W., Gumińska M., Krawczyk A. Ćwiczenia z chemii 

ogólnej i  fizjologicznej. PZWL, Warszawa 1986. 

3.  Pasternak K., Biochemia. Wydawnictwo CZELEJ, Lublin 2005. 
4.  Stryer L., Biochemia. PWN, Warszawa 1999. 

 
 
 
 
 
 
 

 

 

2 

 

REGULAMIN 

obowiązujący studentów odrabiających ćwiczenia 

w Katedrze Biologii i Ochrony Środowiska 

 

1. 

Ćwiczenia  należą  do  zajęć  kontrolowanych  i  nawet  usprawiedliwiona  nieobecność  nie  zwalnia  studenta  z 
obowiązku  odrobienia  opuszczonego  ćwiczenia.  Student,  który  nie  zaliczył  ćwiczenia  winien  je  odrobić  w 
innym terminie po uprzednim uzgodnieniu z asystentem.  

2. 

Studenci  wykonują  ćwiczenia  w  wyznaczonych  pracowniach  w  czasie  wyznaczonym  rozkładem  zajęć  przez 
Dziekanat Wydziału Nauk o Zdrowiu. W pracowni mogą przebywać tylko studenci wykonujący ćwiczenia. 

3. 

Studenci są zobowiązani do aktywnego uczestnictwa w zajęciach. 

4. 

Asystent może nie wpuścić na zajęcia osoby spóźnionej ponad 15 min. 

5. 

Samowolne opuszczenie zajęć w trakcie ich trwania jest jednoznaczne z  brakiem ich zaliczenia. 

6. 

Spożywanie  posiłków,  żucie  gumy, korzystanie z telefonów komórkowych i wszelkie zachowania zakłócające 
prowadzenie  zajęć  na  sali  ćwiczeń  skutkują  usunięciem  z    zajęć  i  brakiem  ich  zaliczenia.  Nagrywanie, 
fotografowanie i filmowanie w czasie zajęć jest możliwe tylko po uzyskaniu zgody prowadzącego. 

7. 

Student  przystępując  do  realizacji  ćwiczenia  winien  być  do  niego  przygotowany  teoretycznie  oraz  posiadać 
znajomość podejmowanych czynności praktycznych. Student będzie mógł rozpocząć ćwiczenie po sprawdzeniu 
wiadomości  przez  asystenta.  Zakres  materiału,  jaki  obowiązuje  na  określone  ćwiczenie  wywieszony  jest  w 
gablocie Katedry Biologii i Ochrony Środowiska. 

8. 

Każdy  student  zobowiązany jest do  prowadzenia   na bieżąco dokumentacji  ćwiczeń. Uzyskane wyniki należy 
przedstawić osobie prowadzącej,  

9. 

Zaliczenie  ćwiczenia  uzyskuje  student,  który  wykazał  się  znajomością  materiału  teoretycznego,  wykonaniem 
ćwiczenia oraz poprawną interpretacją uzyskanego wyniku. 

10.  Za nie zaliczone uważa się ćwiczenie, na którym student nie był obecny,  na którym nie wykazał się znajomością 

materiału obowiązującego na ćwiczenia, lub złamał podany regulamin. 

11.  Zaliczenie  przedmiotu  uwarunkowane  jest:  uzyskaniem  zaliczenia  wszystkich  obowiązujących  ćwiczeń  oraz 

pozytywnym wynikiem kolokwium zaliczeniowego obejmującego wiadomości z wykładów i ćwiczeń. 

12.  Termin kolokwium zaliczeniowego ustala starosta grupy z prowadzącymi zajęcia. 
13.  Termin kolokwium zaliczeniowego na ocenę i  termin egzaminu ustala starosta roku w sekretariacie Katedry.  
14.  Wejście na egzaminy i zaliczenia  możliwe jest po okazaniu indeksu. 
15.   Wyniki  egzaminów  i  zaliczeń  ogłaszane  są  w  gablocie    Katedry  wg  numerów  indeksów  terminie 

siedmiodniowym. Żadne informacje w tym zakresie nie będą udzielane telefonicznie. 

16.  .  W  przypadku,  kiedy  student  nie  zgłasza  się  osobiście  po  wpis,  indeksy  do  których  należy  dokonać  wpisu 

przynosi starosta grupy lub roku wraz listą osób, które mu indeksy powierzyły. 

17.   Wszelkie  wątpliwości    związane  ze  stosowaniem  niniejszego  regulaminu  należy  zgłaszać    Kierownikowi 

Katedry. 

 

ZASADY BEZPIECZEŃSTWA I HIGIENY PRACY 

obowiązujące na terenie Katedry Biologii i Ochrony Środowiska 

 

Przed przystąpieniem do ćwiczeń laboratoryjnych należy zapoznać się z przepisami bezpieczeństwa i higieny 

pracy (BHP) w laboratorium oraz ściśle przestrzegać wskazań asystenta. Ponieważ pomieszczenia Katedry znajdują 
się na terenie Szpitala Klinicznego, obowiązują  także wszystkie przepisy porządkowe Szpitala. 
1. 

W pracowniach  przebywać można tylko w odzieży ochronnej (fartuchu laboratoryjnym). W razie konieczności 
należy używać okularów, rękawic itp. Nie wolno wnosić do laboratorium okrycia wierzchniego. 

2. 

W  pracowniach  nie  wolno  spożywać    pokarmów  i  płynów,  palić  papierosów,  żuć  gumy,  a  także  prowadzić  
zbędnych rozmów. 

3. 

Za    utrzymanie    czystości  i    porządku  na  sali  podczas  ćwiczeń  odpowiedzialni  są studenci. Podczas pracy na 
stołach  laboratoryjnych  i  pod  wyciągami  mogą  znajdować się tylko przedmioty i zestawy aparatury, sprzętu i 
odczynników niezbędne do wykonania określonego ćwiczenia, a także należący do studenta skrypt i materiały 
do sporządzania notatek.   

4. 

Roztwory należy wkraplać bezpośrednio z butelki lub pobierać pipetą, przy czym do każdego roztworu należy 
używać  czystej  pipety.  Podczas  dozowania  roztworów  należy  używać  pipet  pasteurowskich,  pipet 
automatycznych  bądź  pipet  z  nałożonymi  dozownikami  –  nigdy  nie  należy  pipetować  ustami.  Po  pobraniu 
koniecznej ilości roztworu butelkę należy natychmiast zamknąć i odstawić na wyznaczone miejsce.  

5. 

Nie wolno wlewać  z powrotem do butelek roztworów z nich pobranych. Nie wolno używać tej samej pipety do  
pobierania różnych roztworów. 

3 

 

6. 

Zaleca  się  szczególną  ostrożność  przy  posługiwaniu  się  stężonymi  kwasami  i  zasadami,  które  powodują 
oparzenia. 
- W przypadku oparzenia skóry kwasem bądź zasadą, miejsca oparzone należy dokładnie spłukać bieżącą wodą i 
przemyć  2-3%  roztworem  wodorowęglanu  sodowego  (po  zadziałaniu  kwasu)  lub  1-2%  roztworem  kwasu 
octowego lub cytrynowego (po zadziałaniu ługu) i przykryć gazą higroskopijną.  
-  W  przypadku  dostania  się  kwasu  lub  zasady  do  ust  należy  przepłukać  je  dużą  ilością  wody,  a  następnie 
odpowiednio  rozcieńczonym  roztworem  wodorowęglanu  sodowego  (po  zadziałaniu  kwasu)  lub  roztworem 
kwasu octowego (po zadziałaniu ługu).  
-  W  przypadku  połknięcia  roztworu  kwasu  lub  zasady  należy  natychmiast  wypić  dużą  ilość  mleka,  wody  z 
surowym białkiem jaja lub oleju jadalnego i natychmiast zgłosić się do lekarza.  
-  W  przypadku  oparzenia  oczu  należy  przepłukać  je  obficie  wodą,  wprowadzając  strumień  wody  do 
zewnętrznych kącików oczu, pod powieki i natychmiast zgłosić się do lekarza. ponieważ zmiany powstające w 
rogówce  i  spojówce  mogą  już  po  kilku  minutach  osiągnąć  takie  rozmiary,  że  uratowanie  wzroku  staje  się 
niejednokrotnie bardzo trudne. 

7. 

Pipety używane do stężonych kwasów lub zasad należy natychmiast przepłukać wodą. Kroplę ługu lub kwasu, 
która przypadkiem upadnie na stół laboratoryjny lub podłogę należy starannie zetrzeć. Nie wolno wlewać wody 
do stężonego kwasu, gdyż powstała mieszanina silnie się rozgrzewa i należy się liczyć z pęknięciem naczynia, 
co może spowodować oparzenie. 

8. 

Doświadczenia ze stężonymi kwasami, amoniakiem i bromem należy przeprowadzać pod wyciągiem 

9. 

Prace z substancjami wydzielającymi  trujące  lub  żrące  pary  oraz z truciznami (cyjanek, benzen, stęż. kwas 
azotowy)  należy  wykonywać  ze  szczególną  ostrożnością  Doświadczenia  z  takimi  substancjami  można 
wykonywać pod kontrolą asystenta. Płyny ogrzewane w probówce, szczególnie przy użyciu palnika gazowego 
należy  ustawicznie  mieszać,  aby  uniknąć  przegrzania  cieczy.  Równocześnie  nigdy  nie  kierować  wylotu 
probówki  w stronę siebie lub sąsiada.  

10.  Prace  z  substancjami  lotnymi,  łatwopalnymi    należy    prowadzić  z  uwzględnieniem  wszelkich  zasad 

bezpieczeństwa  i  zgodnie  z  obowiązującymi  w  tym  zakresie  przepisami.  Podczas  pracy  z  substancjami 
łatwopalnymi nie należy zapalać ognia. 

11.  W  przypadku  powstania  pożaru  natychmiast  zgłosić  ten  fakt  asystentowi.  W  razie  zapalenia  się  mieszaniny  

odczynników  w  probówce  należy  natychmiast  umieścić  ją  w  pojemniku  z  piaskiem.  W  razie  pożaru  lub 
włączenia  się  sygnalizacji  alarmowej  należy  spokojnie  opuścić  laboratorium  wyznaczonymi  drogami 
ewakuacyjnymi. Zastosowanie środków gaszących (koc azbestowy, odpowiednie gaśnice) należy do asystenta. 

12.  Przed odwirowaniem próbek należy sprawdzić, czy: 

- 

poziom  cieczy  w  probówkach  nie  przekracza  poziomu  bezpiecznego  (ok.  2  cm  poniżej  górnej  krawędzi 
probówki); 

- 

czy na dnie pojemnika z probówkami znajduje się gumowa podkładka; 

- 

czy masa przeciwległych pojemników z probówkami jest jednakowa (w innym przypadku należy pojemniki 
zrównoważyć). W razie stłuczenia probówki w trakcie wirowania należy natychmiast wirówkę wyłączyć i 
wezwać asystenta prowadzącego zajęcia. 

13.  Sprzęt jednorazowego użytku lub sprzętem szklanym, który po użyciu trzeba przepłukać wodą bieżącą i odłożyć 

do przeznaczonych na ten sprzęt pojemników. Odpadów  stałych, takich  jak stłuczka   szklana, bibuły, sączki, 
osady,  nie  wolno  wrzucać  do  zlewu  lecz  tylko  do  odpowiednio  oznakowanych  wiader.  Po    zakończeniu  
doświadczeń  zawartość   probówek   usuwamy do specjalnie w tym celu przeznaczonych pojemników 

14.  W przypadku  doznania w  czasie pracy obrażeń ciała, należy zastosować się do instrukcji BHP z treścią której 

winien zapoznać się każdy student na początku roku akademickiego.  

15.  Każdy wypadek należy natychmiast zgłosić asystentowi prowadzącemu ćwiczenie. 
16.  Należy pamiętać, że:  

- o powodzeniu przeprowadzonego doświadczenia decyduje dokładne i zgodne z  metodyką, jego wykonanie; 
-  trzeba oszczędzać odczynniki, prąd elektryczny oraz wodę; 
-  przed  opuszczeniem  pracowni trzeba uporządkować stanowisko pracy  oraz starannie umyć ręce. 

17.  W przypadku jakichkolwiek wątpliwości należy je bezzwłocznie zgłaszać asystentowi prowadzącemu zajęcia.  
18.  Aparatura  szklana  i  zestawy  specjalne  winny  być  przed  rozpoczęciem  ćwiczeń  sprawdzone  przez  asystenta. 

Uruchomienie  aparatury  oraz  jej  wyłączenie  może  się  odbywać  tylko  pod  bezpośrednim  nadzorem 
prowadzącego zajęcia. 

 
 
 
 

4 

 

1. WĘGLOWODANY 

 

       Wymagana jest znajomość następujących zagadnień: 

1.  Budowa, klasyfikacja i konfiguracja cukrów, stereochemia cukrów. 
2.  Reakcje cukrów prostych  mutarotacja,  redukcja i  utlenianie, epimeryzacja, estryfikacja).  
3.  Enolizacja cukrów redukujących. Pochodne cukrów prostych. 
4.  Tworzenie glikozydów, charakterystyka  wiązania  glikozydowego. Disacharydy. Wielocukry: homoglikany 

(skrobia, glikogen, celuloza) i heteroglikany. 

5.  Znaczenie biologiczne węglowodanów.  
 

Węglowodany (cukry, cukrowce) występują powszechnie w przyrodzie. Rośliny syntetyzują węglowodany w 

procesie  fotosyntezy  z  dwutlenku  węgla  i  wody,  wiążąc  energię  światła  słonecznego.

 

Są  grupą  związków 

karbonylowych  (aldehydów,  ketonów),  które  mają  kilka  grup  hydroksylowych.  Należą  do  nich  cukry  proste 
(monosacharydy),  oligosacharydy  i  polisacharydy.  Wielocukry  są  produktami  polikondensacji  jednocukrów 
połączonych  ze  sobą  wiązaniami  glikozydowymi.  Masa  cząsteczkowa  wielocukrów  waha  się  w  granicach  0d  kilku 
tysięcy  do  kilku  milionów.  Ze  względu      na  budowę  chemiczną  wielocukry  można  podzielić  na  homoglikany 
(wielocukry jednoskładnikowe) i heteroglikany (wieloskładnikowe).  

Do  heteroglikanów  o  dużym  znaczeniu  biologicznym  należy  grupa  glikozaminoglikuronoglikanów  (kwaśne 

mukopolisachary),  w  skład  której  wchodzą:  zawarte  w  tkance  chrzęstnej  wielkie  polimery  kwasu  hialuronowego 
(tworzą  one  rdzeń  natywnych  proteoglikanów),  chondroityna  spotykana  się  w  rogówce  oka,  czy  heparyna.  Rola 
heparyny (wysoko siarkowane formy tego glikanu są biologicznie najbardziej czynne) najdobitniej uwidacznia się w 
przedłużaniu czasu krzepnięcia krwi u ssaków.  
 

Węglowodany  (np.  skrobia  i  niektóre  disacharydy)  są  wykorzystywane  przez  organizmy  cudzożywne  jako 

podstawowy składnik pożywienia. W jelicie człowieka są przekształcane do monosacharydów i wchłaniane w takiej 
postaci. Postacią „transportową” węglowodanów w krwi jest glukoza. W komórkach jest ona wykorzystywana jako 
materiał  energetyczny,  w  celu  odzyskania  niezbędnej  do  życia  energii  lub  przetwarzana  na  inne  produkty. 
Węglowodanem zapasowym jest glikogen magazynowany przede wszystkim przez wątrobę i mięśnie. Węglowodany 
mogą  być  połączone  kowalencyjnie  z  białkami  (glikoproteiny)  lub  lipidami  (glikolipidy)  i  być  składnikiem  ścian 
komórkowych. W postaci rozpuszczalnej glikoproteiny występują w krwi ( białka osocza). 

 

1.1.  JEDNO- i DWUCUKRY 

 

1.1.1. Wykazanie obecności grup alkoholowych cukrów 

Na skutek obecności grup alkoholowych cukry mogą łatwo tworzyć rozpuszczalne połączenie kompleksowe z 

wodorotlenkami niektórych metali np. wodorotlenkiem miedziowym. 

CuSO

4 

+ 2NaOH 

 Cu(OH)

2 

 (

koloidalny błękitny osad)

 + Na

2

SO

4

 

 Cu(OH)

2

 + R(OH)

2

 

 

rozpuszczalny związek kompleksowy  

o barwie szafirowej  

Wykonanie:  
Do 1ml 2M NaOH dodać około 1 ml  roztworu 2 % CuSO

4

 x 5H

2

O. Następnie do zawiesiny galaretowatego 

osadu wkraplać roztwór glukozy 
(około 1 ml). Obserwować zmianę barwy zawartości probówki w trakcie dodawania kolejnych odczynników.  
Koloidalny, błękitny osad wodorotlenku miedziowego w obecności grup hydroksylowych glukozy tworzy 
rozpuszczalny związek koloru szafirowego. 
 
1.1.2. Reakcje redukcyjne cukrów prostych 
 

Wszystkie  monocukry  (z  wolną  grupę  aldehydową  lub  ketonową),  przejawiają  właściwości  redukujące, 

jednocześnie same utleniając się. W środowisku alkalicznym cukry redukują tlenki lub wodorotlenki metali (Cu, Bi, 
Ag,  Hg),  które  w  środowisku  zasadowym  istnieją  w  postaci  łatwo  wytrącających  się  koloidalnych  zawiesin.  W 
obecności  związków  zawierających,  sąsiadujące  ze  sobą,  grupy  wodorotlenowe  (winian  sodowo-potasowy,  kwas 
winowy,  gliceryna)  tworzą rozpuszczalne, częściowo zdysocjowane, połączenia kompleksowe, dostarczając małych 
ilości jonów metalu, które wchodzą w reakcje redukcji.  
 
 

2NaOH + CuSO

4

 

 Cu(OH)

2

   + Na

2

SO

4

 

 

 

 

        

niebieski osad wodorotlenku miedziowego

 

 

5 

 

 
Pod wpływem zasady i soli miedziowych w wyniku reakcji z roztworem cukru (związkiem redukującym) po ogrzaniu 
powstaje  źle  rozpuszczalny  osad,  który  może  mieć  barwę  żółtą  (dla  cząstek  drobnych)  przez  pomarańczową  do 
czerwonej (dla osadów gruboziarnistych).  

2Cu(OH)

2

 

 Cu

2

O  + 2H

2

O + 1/2O

2

 

osad czerwonego tlenku miedziawego 

Cukry w środowisku zasadowym mogą redukować także kwas pikrynowy czy błękit metylenowy. 
 
1.1.2.1. Wpływ warunków na przebieg odczynów redukcyjnych 
  
Wykonanie: 
Do 5 probówek dodać po 5 kropli 2% roztworu siarczanu miedzi,  a następnie kolejno, po 1 ml wody, glicerolu, 
winianu sodowo-potasowego, amoniaku i glukozy. Następnie do każdej probówki dodać po 5 kropli 2M NaOH 
i umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. Do probówki 2, 3 i 4 dodać po 5 kropli 1% glukozy i ponownie 
ogrzać w 100ºC. 
 
Wynik obserwacji zapisać w tabeli. 

 
 
 
W prawidłowo wykonanym doświadczeniu w próbie 1 tworzy się osad koloidalny wodorotlenku miedziowego, w 
probówkach 2, 3 i 5 powstają rozpuszczalne kompleksy. W  próbie  z amoniakiem również powstaje szafirowy 
rozpuszczalny kompleks miedzi. W wyniku ogrzewania w probówce 1 wytrąca się czarny tlenek miedziowy, a w 
probówce 5 wytrąca się czerwony tlenek miedziawy.  Po dodaniu do prób glukozy i ponownym ogrzaniu wytrąca się 
osad Cu

2

Ow próbie 2 i 3. Jony amonowe w próbie 4 zapobiegają redukcji do chwili, aż amoniak nie odparuje. 

 
1.1.2.2. Reakcja Fehlinga.   
 

Glukoza redukuje wodorotlenek miedziowy do wytrącającego się z roztworu czerwonego osadu tlenku 

miedziawego. 
Wykonanie: 
Zmieszać w probówce 1ml odczynnika Fehlinga I  z 1ml odczynnika Fehlinga II, ogrzać do wrzenia i dodać 
1ml  1% roztworu glukozy. Po ponownym ogrzaniu próby pojawia się osad. 
 
 
1.1.2.3. Reakcja Benedicta 

Odczyn Benedicta jest czulszy i bardziej swoisty od odczynu Fehlinga, a z natężenia barwy osadu można 

ODCZYNNIK (ml) 

Probówka

 

1 

Probówka

 

2 

Probówka

 

3 

Probówka

  

4 

Probówka

  

5 

2% CuSO

4

  

0,2 

0,2 

0,2 

0,2 

0,2 

H

2

O  (ml) 

1 

 

 

 

 

10%Glicerol  

 

1 

 

 

 

10%winian Na-K 

 

 

1 

 

 

amoniak  

 

 

 

1 

 

1% glukoza (ml) 

 

 

 

 

1 

2M NaOH ( krople) 

0,2 

0,2 

0,2 

0,2 

0,2 

WYNIK 

osad koloidalny 

 

Cu(OH)

2

 

rozpuszczalne 

kompleksy

 

 

Cu(OH)

2

 

rozpuszczalne 

kompleksy 

 

Cu(OH)

2

 

Niebieski kompleks  

{Cu(NH

3 

)

4

}(OH)

2

 

szafirowy 

rozpuszczalny 

kompleks  

 

Cu(OH)

2

 

OGRZEWAĆ

100ºC, 5 min

 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

1% glukoza  

 

1 

1 

1 

 

OGRZEWAĆ

100ºC, 5 min

 

 

+ 

+ 

+ 

 

WYNIK 

czarny  CuO 

czerwony 

Cu

2

O 

czerwony 

Cu

2

O 

Jony amonowe 
zapobiegają redukcji 
do chwili, aż amoniak 
nie odparuje.(

 

Cu

2

O)

 

czerwony 

Cu

2

O 

6 

 

wnioskować o ilości glukozy w badanej próbce, nadaje się więc np. do wykrywania glukozy w moczu. 
Wykonanie: 
Do 1 ml odczynnika Benedicta dodać kilka kropel  1% glukozy i ogrzewać. 
W zależności od ilości glukozy tworzy się osad żółty, pomarańczowy lub czerwony wytrąconego tlenku miedziawego. 
 
1.1.2.4. Próba Tollensa 
 

Glukoza redukuje jony srebra ( z dysocjacji Ag(NH

3

)

2

+

 ) do srebra metalicznego. 

Wykonanie:  
Do 1 ml 0,1 M amoniakalnego roztworu AgNO

3

 dodać 1 ml 1% glukozy i ogrzewać we wrzącej łaźni. 

Wydzielanie się na ściankach probówki lustra metalicznego srebra świadczy o właściwościach redukujących glukozy.  
 
1.1.2.5. Odróżnienie cukrów redukujących od nieredukujących 
 

Reakcję wykonuje się z odczynnikiem Benedicta. 

    Wykonanie: 

Przygotować 4 probówki. Do pierwszej dodać kilka kropli roztworu 1% glukozy,  do 2.   1% maltozy, do 3.  
1% sacharozy, do 4.  1% skrobi. Do wszystkich dodać po 1 ml odcz. Benedicta i ogrzewać przez kilka minut.  
Wytrącenie osadu świadczy o obecności cukru redukującego. 
 
1.1.2.6. Próba Barfoeda - odróżnienie cukrów prostych od dwucukrów redukujących 
 

Zjawisko  zmniejszania  się  zdolności  redukcyjnych  cukrów,  w  miarę  zwiększania  kwasowości  środowiska, 

wykorzystano  do  różnicowania  cukrów.  W  obecności  cukrów  redukujących  po  ogrzaniu  z  odczynnikiem  wypada 
czerwony osad tlenku miedziawego. 
Wykonanie: 
Przygotować probówkę z 0,5 ml 1% glukozy i drugą z 0,5 ml 1% maltozy.  
Do obu dodać po 1 ml odczynnika Barfoeda i ogrzewać przez 3 min. w łaźni wodnej w 100ºC. 
W takich warunkach dodatni wynik daje tylko próba z glukozą.  
Ogrzewać obie próby przez kolejne 15 min.  
Dwucukry redukujące dają próbę dodatnią po dłuższym ogrzewaniu i w probówce z maltozą także pojawia się osad 
tlenku miedziawego. Próba ma znaczenie kliniczne, gdyż np. w moczu pozwala odróżnić obecność glukozy od 
laktozy. 
 
1.1.2.7. Badanie właściwości redukujących produktów powstałych w wyniku kwaśnej hydrolizy sacharozy  
 

Kwas pikrynowy w środowisku alkalicznym ulega redukcji i daje czerwono zabarwiony pikraminian sodu. 

Wykonanie: 
Do 2 ml  1 % sacharozy dodać 0,5 ml 2 M HCl i ogrzewać kilka minut we wrzącej łaźni wodnej. Próbę 
rozdzielić do dwóch probówek  i do jednej dodać 1 ml 10% NaOH, a następnie do obu prób dodać po 1 ml 
nasyconego roztworu kwasu pikrynowego i ogrzewać przez kilka minut. 
W próbie zalkalizowanej obserwujemy czerwone zabarwienie roztworu. 
 
1.1.2.8. Redukcja błękitu metylenowego 
 

Błękit metylenowy spełnia rolę przenośnika wodoru i w wyniku jego redukcji powstaje leukozwiązek. 

Wykonanie: 
Do 1 ml  0,05% błękitu metylenowego dodać 4 krople 2M NaOH i ogrzać (barwa nie znika).  
Następnie dodać kilka kropli 1% glukozy i ponownie zagotować. Następuje odbarwienie próby. Po ostudzeniu i 
wstrząśnięciu, pod wpływem tlenu z powietrza, leukozwiązek ponownie utlenia się i obserwujemy powrót 
zabarwienia.

  

 

S

N

N(CH

3

)

2

(CH

3

)

2

N

-H

2

-H

2

Cl

S

N

N(CH

3

)

2

(CH

3

)

2

N

H

+

+

HCl

 

 błękit metylenowy 

 

leuko

związek (biel metylenowa) 

 
 
 
 

7 

 

1.1.3. Wpływ zasad na cukry (próba Moore’a) 
 

W środowisku zasadowym cukry redukujące ulegają enolizacji, zanika asymetria przy C2 i np. glukoza może 

się  przekształcić  we  fruktozę  lub  mannozę.  Wiązanie  enolowe  łatwo  ulega  rozerwaniu,  więc  z  cukrów  mogą 
powstawać pochodne ulegające polimeryzacji (powstają ciała żywicowate). Roztwory glukozy w obecności stężonych 
zasad  barwią  się  na  kolor  nawet  brunatnoczerwony  przy  czym  można  poczuć  zapach  karmelu.  Na  działanie  zasad 
odporne jest wiązanie glikozydowe. 
Wykonanie: 
Przygotować cztery probówki. Do  pierwszej wlać 1 ml  1% glukozy, do następnych wlać po 1 ml 1% 
sacharozy, 1% maltozy i 1% skrobi. Do wszystkich probówek dodać po 1 ml 10% NaOH . Wstawić na kilka 
minut do wrzącej łaźni wodnej i obserwować zabarwienie próby 
 
1.1.4. Reakcje barwne cukrów  

Cukry  proste  ogrzewane  ze  stężonymi  kwasami  (siarkowym,  solnym,  octowym)  ulegają  odwodnieniu    np. 

pentozy  do  furfuralu,  heksozy  do  hydroksymetylofurfuralu,  które  z  jednowodorotlenowymi  fenolami  dają  barwne 
(triarylometanowe)    produkty  reakcji  (oligosacharydy  i  polisacharydy  ulegają  pod  wpływem  kwasu  najpierw 
hydrolizie). Metoda fenolowa jest metodą kolorymetryczną pozwalającą na analizę jakościową i ilościową cukrów.  

 

H

2

 O

O

H

O

OH

O

CH

OH

O

furfural

+

2

-

 

O

gólna reakcja „fenolowa” 

 

 
Wielowodorotlenowe fenole dają z pochodnymi furfuralu barwne połączenia ksantenowe.  
 

O

H

OH

H

OH

O

H

H

O

CH

2

OH

CH

O

O

CH

2

OH

OH

O

O

H

C

H

O

CH

2

OH

O

O

O

H

C

80

H

2

 O

O

2

-

-2H

+1/2

Barwne połączenie ksantenowe

 

 

 
Odmianami metody fenolowej są: 
 

- próba Molischa z  -naftolem 

OH

dająca reakcję z każdą heksozą 

-próba Seliwanowa z rezorcyną

OH

OH

  na zawartość ketoz  

-próba Biala z orcyną  

OH

OH

C

H

3

 

pozwalająca wykryć obecność pentoz 

 

8 

 

W  reakcję  kondensacji  z  pochodnymi  furfuralu  mogą  wchodzić  także  inne  związki  aromatyczne  takie  jak,  antron, 
benzydyna lub difenyloamina. W produkcie kondensacji układ chinoidowy stanowi grupę chromoforowi decydującą o 
barwie powstałego związku. 

Omówione  metody  umożliwiają  ilościowe  oznaczanie  zawartości  cukrów  w  białkach  czy  w  kwasach 

nukleinowych. 
 
1.1.4.1. Reakcje ogólne. Próba Molischa z  -naftolem  

Cukry  (heksozy)  pod  wpływem  stężonego  H

2

SO

4

  przekształcają  się  w  wyniku  odwodnienia  w  pochodne 

furfuralu, które z  -naftolem dają barwne produkty reakcji. 
 

O

H

O

H

O

H

H

OH

OH

-H

2

O

O

CH

OH

O

H

H

O

H

+

 

                              hydroksymetylofurfural 

      -naftol 

      prawdopodobny produkt barwny 

 

 
Wykonanie: 
Przygotować 3 probówki i do pierwszej wlać 1 ml 1% roztworu glukozy, do drugiej  1 ml 1% sacharozy a do 
trzeciej 1 ml 1% skrobi. Do każdej próby dodać 2 krople roztworu   -naftolu (odczynnika Molischa), 
wymieszać i po ściance wlać około 1 ml stężonego kwasu siarkowego, tak aby utworzyły się dwie dobrze 
odgraniczające się warstwy.  
Na granicy zetknięcia się obu roztworów powstaje czerwono-fiołkowy pierścień. Pojawiająca się 
niecharakterystyczna zielona barwa pochodzi od zanieczyszczeń. Ujemny wynik reakcji wyklucza obecność cukrów, 
nawet połączonych z innymi związkami, ale dodatni nie jest wystarczającym dowodem na obecność cukrów, gdyż 
odczyn jest czuły, ale nieswoisty. Dodatnią próbę wykazują: aldehydy, aceton, kwasy organiczne (np. mrówkowy, 
cytrynowy).  
W moczu człowieka znajdują się związki niecukrowe, które także dają dodatni odczyn z  -naftolem. 
 
1.1.4.2. Reakcje selektywne 
 

Reakcje barwne wywołane działaniem stężonych kwasów na cukry w obecności pochodnych fenylowych są 

reakcjami typu furfuralowego. 
 
1.1.4.2.1. Reakcja Seliwanowa (wykrywanie ketoz)   
 

Przy zachowaniu ściśle określonych warunków (ogrzewanie przez pół minuty w 100ºC próby badanego cukru 

z  rozcieńczonym  około  12%  kwasem  solnym)  ketozy  ulegają  przekształcają  się  w  pochodne  furfuralowe  znacznie 
szybciej niż aldozy (doświadczenie pozwala na odróżnienie ketocukrów od aldocukrów). 
 

H

2

 O

H Cl

O

H

O

H

O

H

H

fruktoza 

-3

hydroksymetylofurfural

rezorcynol

czerwony 
produkt kondensacji

 

 
Wykonanie: 
Przygotować 4  probówki  i wykonać doświadczenie z roztworami fruktozy, glukozy i sacharozy. Do czwartej 
probówki ( próba odniesienia) wlać 1ml wody. Do 1ml 1% fruktozy dodać 0,5 ml stężonego HCl (uwaga! 
nadmiar kwasu uniemożliwia uzyskanie poprawnego wyniku) i ogrzewać w 100ºC (łaźnia wodna) przez pół 
minuty. Probówkę ostudzić pod bieżącą wodą. Dodać szczyptę rezorcyny i ponownie próbę ogrzać do wrzenia.  
Próbę należy wykonać w taki sam sposób z roztworem: 1% glukozy, 1% sacharozy, oraz wody.  
Zaobserwować różnicę w reakcji poszczególnych cukrów. 
W  obecności  ketoz  roztwór  zabarwia  się  na  kolor  łososiowo-czerwony.  Reakcje  barwne  wywołane  działaniem 
stężonych kwasów na cukry w obecności pochodnych fenylowych są reakcjami typu furfuralowego. 

9 

 

1.1.4.2.2. Próba Tollensa z floroglucyną (1,3,5,trihydroksybenzen)

 

 - wykrywanie pentoz 

 

Z pentoz  na skutek działania kwasu solnego powstaje furfural, który z floroglucyną daje kompleks o barwie 

wiśniowej. 
Wykonanie: 
Do  0,5  ml  1% rybozy dodać 1 ml stężonego HCl i kryształek floroglucyny. Podobnie wykonać próbę z 1 ml 
1% glukozy. Obie próby ogrzewać w łaźni wodnej w 100ºC przez 2 minuty.   
W obecności pentoz roztwór w probówce zabarwia się na kolor różowo-wiśniowy. Heksozy dają produkt reakcji o 
zabarwieniu żółtym lub brązowym. 
Oprócz pentoz dodatnio reaguje galaktoza i kwasy uronowe. 
 
1.1.4.2.3. Próba z orcyną (wykrywanie pentoz) 
 

W  obecności  stężonego  kwasu  solnego  produkt  kondensacji  furfuralu  z  orcyną  (orcynolem)  ma  barwę 

brązowo-żółtą. 
Wykonanie: 
D 0,5 ml 1% rybozy dodać 0,5 ml stężonego kwasu solnego i szczyptę orcynolu krystalicznego. Ogrzać do 
wrzenia i utrzymywać w 100ºC przez pół minuty.  
 
Modyfikacją tego odczynu jest  próba Biala (wprowadzenie do środowiska reakcji jonów żelaza).   
 

Pod  wpływem  ogrzewania  z  kwasem  solnym  pentozy  przekształcają  się  w  furfural,  który  w  kwaśnym 

środowisku w obecności soli żelaza (III) z (orcyną) daje produkt kondensacji o barwie zielonej.  
Na podstawie tego odczynu można kolorymetrycznie oznaczać ilości rybozy w kwasach nukleinowych.  
 

CH

3

OH

O

H

O

C

O

H

n

 

Fe

3+

H

2

 O

H Cl

orcynol

furfural

kompleks barwny 
koloru zielonego

ryboza 

-3

ogrzewanie

 

 
Wykonanie: 
Przygotować 2 probówki z 1 ml  odczynnika Biala. Do pierwszej dodać roztworu 0,5 ml  1% rybozy, do drugiej  
0,5 ml  1% roztworu glukozy. Próbę wstawić do łaźni wodnej i ogrzewać przez kilka minut w 100ºC.  
Pojawiające się zielone zabarwienie świadczy o obecności pentozy. W reakcji z heksozami powstaje w tych 
warunkach hydroksymetylofurfural, który słabiej reaguje z orcynolem dając produkt o zabarwieniu żółto-brązowym. 
 
1.1.5. Otrzymywanie osazonów monosacharydów. 

Cukry  redukujące  z  fenylohydrazyną  tworzą  żółte  nierozpuszczalne  w  wodzie  związki  zwane  osazonami, 

różniące  się  temperaturą  topnienia  i  kształtem  kryształów.  Żółte  kryształy  dają  się  łatwo  identyfikować  pod 
mikroskopem.  Ponieważ  reakcja  fenylohydrazyną  zachodzi  przy  dwóch  pierwszych  węglach,  wobec  tego  cukry 
epimeryczne,  różniące  się  rozmieszczeniem  podstawników  przy  tych  węglach  tworzą  identyczne  osazony.  Wobec 
tego glukoza, mannoza, fruktoza nie mogą być różnicowane między sobą na podstawie reakcji tworzenia osazonów. 
 
 

H

O

OH

H

H

O

H

H

H

CH

2

OH

OH

OH

C

6

H

5

NHNH

2

C

6

H

5

NHNH

2

-C

6

H

5

NH

2

-NH

3

H

2

 O

N

H

N

OH

H

H

O

H

H

H

CH

2

OH

OH

OH

H

N

H

N

N

H

O

H

H

H

CH

2

OH

OH

OH

H

N

H

glukoza

fenylohydrazon

2

-2

osazon

 

 

10 

 

  Odczynniki ( do ćwiczenia  1.1. JEDNO- i WIELOCUKRY) 

Roztwory cukrów:      1%   glukoza, 1%  fruktoza, 1%  ryboza,  1%  maltoza, 

1%sacharoza,  

1%skrobia, 

 

H

2

SO

4

, stężony (kwas siarkowy)  

HCl, stężony (kwas solny) 
HCl, 2M (kwas solny) 
HCl, 1M (kwas solny) 
NaOH, 10% (wodorotlenek sodowy) 
NaOH,  2M (wodorotlenek sodowy, ług sodowy) 
NaOH,  1M (wodorotlenek sodowy) 
amoniak, 1% (NH

4

OH) 

AgNO

3

, 0,1M roztwór amoniakalny (azotan srebra) 

winianu sodowo-potasowy, 10% 
CuSO

4

·5H

2

O,  2%  (siarczan miedziowy uwodniony)  

glicerol, 10% 
kwas pikrynowy, roztwór nasycony ( około 1,3%) 
błękit  metylenowy, 0,05% 
rezorcyna, krystaliczna (lub rezorcyna, 0,5% roztwór w stężonym HCl) 
 

  Odczynniki ( do ćwiczenia  1.1. JEDNO- i WIELOCUKRY) 

Odczynnik Fehlinga I: 
- siarczan miedzi (CuSO

4

 x 5H

2

O) 34,65g. 

- kwas siarkowy stężony (H

2

SO

4

) 1 ml. 

- woda destylowana - uzupełnić do 500 ml.              
Odczynnik Fehlinga II: 
- winian sodowo-potasowy – 175g 
- 10% NaOH  - uzupełnić do 500 ml. 
Odczynnik Benedicta: 
- cytrynian trójsodowy  - 173g 
- węglan sodowy bezwodny - 90g 
- siarczan miedziowy - 17,3g  
- H

2

O  - uzupełnić do 1000 ml 

(w 600 ml gorącej wody rozpuścić węglan i przesączyć, dodać 100 ml rozpuszczonego siarczanu miedzi, dodać 
cytrynian sodowy i uzupełnić do 1000ml) 
Odczynnik Barfoeda 
- octan miedziowy - 24g (rozpuścić w 450 ml gorącej wody) 
- kwas mlekowy - 25 ml (r-r 8,5%)  (lub 2,5 ml 85% kwasu mlekowego) 
- woda destylowana - uzupełnić do 500 ml. 
Odczynnik Biala, (0,3g orcynolu rozpuścić w 500 ml stężonego HCl i dodać 1ml 10% FeCl

3

 ) 

Odczynnik Molischa, (α-naftol,  2%  roztwór alkoholowy) 
 
 

1.2. WIELOCUKRY  

Polisacharydy  różnią  się  od  mono-  i  dwucukrów  właściwościami  fizycznymi  i  chemicznymi.  Nie mają one 

słodkiego  smaku  i  są  nierozpuszczalne  w  wodzie.  Większość  z nich, ze względu na obecność grup hydrofilowych, 
pęcznieje  w  obecności  wody  dając  roztwory  koloidowe  (wyjątek  stanowi  celuloza,  której  cząsteczki  łącząc  się  w 
większe skupiska - micele, mają grupy hydrofilowe związane między sobą mostkami wodorowymi).Polisacharydy w 
zależności od tworzących je cukrów dzielą się na homoglikany (zbudowana z cząsteczek glukozy skrobia, glikogen, 
celuloza, dekstran, z  cząsteczek fruktozy – inulina) i heteroglikany (mukopolisacharydy). 
 
1.2.1. Preparatyka skrobi z ziemniaka 
1.2.1.1. Izolowanie skrobi. 
Wykonanie: 
Obrany ziemniak utrzeć na miazgę i wymieszać z wodą (1:4), przesączyć przez gazę do zlewki i odczekać 10 
minut. Obserwować osadzanie się skrobi na dnie naczynia. Nadsącz ostrożnie zdekantować, a osad wysuszyć. 
 
1.2.1.2. Przygotowanie kleiku skrobiowego 

11 

 

Ziarna  skrobi  tworzące  w  wodzie  zawiesinę  po  ogrzaniu  pęcznieją  i  pękają.  Tworzy  się  lepki,  koloidalny 

roztwór. 
Wykonanie: 
Około 1g otrzymanej skrobi zawiesić w 10 ml wody i wlewać do 50 ml wrzącej wody stale mieszając. 
Otrzymuje się jednolity, opalizujący roztwór skrobi. 
 
1.2.2. Reakcja skrobi z jodem.  

Zabarwienie roztworu w reakcji skrobi z jodem powstaje w wyniku adsorpcji cząsteczek jodu na cząsteczkach 

polisacharydów.  Adsorpcja  ma  charakter  "kanałowy"  tzn.  cząsteczki  jodu  wchodzą  do  kanału  utworzonego  przez 
spiralnie skręcone łańcuchy wielocukru, a na jeden skręt spirali przypada około 6 reszt cukrowych. Barwa zależy od 
długości  łańcucha;  np.  amyloza  (skrobia)  daje  z  jodem  barwę  niebieską,  a  w  miarę  skracania  łańcucha  następuje 
zmiana barwy na fioletową  (amylodekstryny), fioletowo-czerwoną (amylopektyna, glikogen) i czerwoną (dekstryny). 
Achro- i malto-dekstryny (maltoza, izomaltoza) i glukoza nie dają zabarwienia z jodem. 
Wykonanie: 
Do 1ml kleiku skrobiowego, dodać 1 kroplę rozcieńczonego „płynu Lugola” (roztwór J2 w KJ). Próba zabarwia 
się na kolor ciemnoniebieski. 

 

1.2.2.1. Wpływ temperatury 
Wykonanie: 
Probówkę z 1ml kleiku skrobiowego z 1 kroplą roztworu jodu (kolor ciemnoniebieski próby) ogrzewać aż do 
zniknięcia barwy. Po ostudzeniu próby barwa powraca. 
 
1.2.2.2. Wpływ pH środowiska 
 

W środowisku zasadowym jod wchodzi w reakcję z wodorotlenkami, uwalniając jon podjodawy i jodkowy 

(barwa zanika).  
 

 

J

2

  + 2NaOH = NaJ + NaJO + H

2

O 

 
Dodanie kwasu  solnego powoduje odtworzenie jodu cząsteczkowego (powrót barwy niebieskiej). 
 
 

 

NaJ + NaJO + 2HCl = 2Na Cl + J

2

 + H

2

O 

 

 

KJ + J

2

 = KJ

3 

Wykonanie: 
Przygotować 2 probówki z kleikiem skrobiowym (po 1 ml) i kroplą płynu Lugola. Dodawać kroplami 1M 
NaOH do obu probówek, aż do odbarwienia, następnie do jednej z prób dodawać 1M HCl do momentu 
ponownego pojawienia się barwy. 
 
1.2.3. Wysalanie skrobi 
Wykonanie: 
Do 5 ml otrzymanego kleiku dodać 5 ml nasyconego roztworu (NH

4

)

2

SO

4

. Wymieszać i po 10 min przesączyć 

przez sączek z bibuły. Do przesączu dodać kroplę roztworu jodu.  
Dowodem, że skrobia się wytrąciła i została odsączona jest brak pozytywnej reakcji z jodem.   
 
1.2.3. Hydroliza wielocukrów, wykrywanie produktów ich rozkładu 
 
1.2.3.1.Wpływ rozcieńczonych kwasów – stopniowa hydroliza skrobi 
 
 

Skrobia  pod  wpływem  kwasu  ulega  stopniowej  hydrolizie  do  glukozy.  Pękają  wiązania  glikozydowe  z 

przyłączeniem cząsteczek wody i długie łańcuchy ulegają rozbiciu na coraz krótsze fragmenty. W miarę skracania się 
łańcucha zmienia się zabarwienie kompleksu z jodem.  W próbach z jodem zabarwienie roztworu zmienia się kolejno 
z niebieskiego (skrobia i dekstryny) poprzez fioletowe (amylodekstryny), czerwone (erytrodekstryny) do słomkowego 
(w wyniku hydrolizy łańcuchy skrobi są coraz krótsze, a w końcu otrzymujemy achrodekstryny  amylozę i glukozę, 
które  nie  dają  pozytywnej  reakcji  z  jodem).  Przy  większych  stężeniach  kwasu  hydroliza  skrobi  przebiega  bardzo 
szybko, prowadząc do uwolnienia glukozy. 
Kwaśna  hydroliza skrobi znalazła zastosowanie w przemyśle spożywczym w produkcji np. syropu ziemniaczanego 
czy sztucznego miodu. 
Wykonanie: 
a). Przygotować: 10 probówek (opisać numerami od 1 do 10) z 3 kroplami rozcieńczonego roztworu jodu 

12 

 

każda i  
 

 

    10 probówek (oznaczonych 11 – 20) z 0,5 ml 1M NaOH.  

b). Do probówki z około 15 ml otrzymanego kleiku skrobiowego dodać 1 ml stężonego kwasu solnego, 
zamieszać, pobrać po 0,5 ml roztworu badanego i przenieść kolejno do probówek oznaczonych nr 1  i 11.  
Następnie zakwaszony kleik umieścić w łaźni wodnej i ogrzewać we wrzącej łaźni (100ºC). Po 3 minutach 
przenieść 0,5 ml roztworu do probówki oznaczonej numerem 2 (z jodem) i 0,5 ml do probówki oznaczonej jako 
12    (z NaOH). Dalej co 3 minuty przenosić po 0,5 ml do kolejnych probówek, aż do nr 10 i 20.  
Do prób z NaOH i badanym roztworem hydrolizowanej skrobi dodawać po 1 ml odczynnika Benedicta i 
ogrzewać do wrzenia.  
Daje się zaobserwować coraz wyraźniejszą reakcję dodatnią, aż do pojawienia się osadu Cu

2

O, co świadczy o 

wzroście stężenia redukującej glukozy w wyniku postępującej hydrolizy. 
 
1.2.3.2. Hydroliza celulozy 
Wykonanie: 
Skrawki bibuły umieścić w probówce, zalać 10 ml H

2

O i dodać 1 ml stężonegokwasu siarkowego. Ogrzewać 

kilkanaście minut w łaźni wodnej o temperaturze 100ºC. Następnie próbę ochłodzić i wykonać reakcję na 
obecność cukrów redukujących (glukozy).   
Pobrać 0,5 ml roztworu hydrolizatu, dodać 0,5 ml 1M NaOH i zamieszać. 
Do próby dodać1 ml odczynnika Benedicta. Próbę można wykonać także dodając 1 ml odczynnika 
Fehlinga(I+II) 
Ogrzewać  we wrzącej łaźni wodnej do pojawienia się osadu tlenku miedziawego. 
Próba redukcyjna wypadnie dodatnio, ponieważ pod wpływem kwasu celuloza uległa hydrolizie do glukozy. 
 
1.2.4. Dializa roztworu koloidowego (kleiku skrobiowego) 

Dializa  polega  na  selektywnej  dyfuzji  substancji  małocząsteczkowych  poprzez  błonę  półprzepuszczalną, 

zgodnie z gradientem stężenia, przy równoczesnym zatrzymywaniu cząstek koloidowych i makrocząsteczek. 
Wykonanie: 
Umieścić w woreczku dializacyjnym 5 ml roztworu  1% skrobi zmieszanej z 2 ml 1% Na

2

CO

3

 i  2 ml  1% 

glukozy. Woreczek umieścić w zlewce z wodą destylowaną z dodatkiem kilku kropel fenoloftaleiny (roztwór 
zewnętrzny)  i dializować przez około jedną godzinę.  
 
Po dializie w roztworze zewnętrznym wykonać próby na obecność:  
a) węglanów:    do 1 ml roztworu zewnętrznego dodać 1ml 0,1 M  BaCl 

2

. 

Pojawiające się zmętnienie wskazuje na obecność węglanów. 
b) skrobi:          do 1 ml roztworu zewnętrznego dodać 1 kroplę płyn Lugola.  
Przy właściwie przeprowadzonej dializie nie obserwuje się dodatniej reakcji na skrobię (nie powinno pojawić się 
niebieskie zabarwienie). 
c) glukozy:       do 1 ml roztworu zewnętrznego dodać 1 ml odczynnika Benedicta i zagotować. 
Pojawiający się osad  tlenku miedziawego wskazuje na obecność glukozy. 
 

  Odczynniki (do ćwiczenia 1.2.4. Dializa...) 

skrobia, 1% (kleik skrobiowy),  glukoza, 1% 
BaCl

2

, 0,1M (clorek baru) 

Na

2

CO

3,

 1% (węglan sodu) 

Fenoloftaleina, wskaźnik  
Płyn Lugola (J

2

 w KJ) 

 

  Odczynniki  (do ćwiczenia 2.2.WIELOCUKRY) 

H

2

SO

4

, stężony (kwas siarkowy) 

HCl, 1M (kwas solny) 
kleik skrobiowy, 1% (ziemniaki) 
NaOH, 1M (wodorotlenek sodu) 
(NH

4

)

2

SO

4,  

roztwór nasycony (siarczan amonu) 

odczynnik Benedicta  (lub odczynnik Fehlinga  I + odczynnik Fehlinga  II) 

Płyn Lugola, (J

2

 w KJ,), (0,5% roztwór jodu w roztworze 2% jodku potasu.  

Jod rozpuszcza się w wodnym roztworze jodku potasowego, dając nietrwały jon zespolony J

3 

-

). 

13 

 

2. TŁUSZCZE 

Wymagana jest znajomość następujących zagadnień: 
1.  Kwasy tłuszczowe - budowa i właściwości, nazewnictwo. 
2.  Charakterystyka tłuszczów prostych i złożonych;  podział, budowa i występowanie. 

3. 

Znaczenie biologiczne lipidów.

 

  

 

Lipidy (tłuszczowce – termin ten obejmuje zarówno kwasy tłuszczowe, jak i pochodne izoprenu np. steroidy, 

witaminy)  charakteryzuje  się  przez  określenie  ich  właściwości  fizycznych  i  składu  chemicznego.  Najbardziej 
powszechne  są  tłuszcze  proste,  dzielone  na  tłuszcze  właściwe  -  zbudowane  z  glicerolu  połączonego  wiązaniami 
estrowymi  z  cząsteczkami  kwasów  tłuszczowych  oraz  woski  –  estry  wyższych  jednowodorotlenowych  alkoholi  i 
wyższych  kwasów  tłuszczowych  np.  wosk  pszczeli.  Badanie  tłuszczów  złożonych  (fosfolipidy,  glikolipidy, 
sulfolipidy), dodatkowo posiadających zasady azotowe, cukry lub reszty kwasu fosforowego, musi być poprzedzone 
ich izolacją z materiałów biologicznych. Jako związki powierzchniowo czynne obniżają napięcie powierzchniowe na 
granicy  faz.  Tłuszcze  złożone  stanowią  materiał  budulcowy  błon  plazmatycznych  (np.  takich  jak  osłony  włókien 
nerwowych). W materiale biologicznym występują też prekursory i pochodne lipidów (np. kwasy tłuszczowe, glicerol 
i  inne  alkohole,  sfingozyna).  Do  lipidów  zaliczamy  sulfolipidy  i  aminolipidy a także lipoproteiny- cząsteczki, które 
biorą udział w dystrybucji i przemianie lipidów w organizmie. Do glikosfingolipidów, które zawierają oprócz kwasu 
tłuszczowego i sfingozyny komponent cukrowy zaliczamy obficie występujące w mózgu cerebrozydy (z galaktozą lub 
sulfogalaktozą)  i  gangliozydy  (tłuszcze  rozpuszczalne  w  wodzie,  za  co  odpowiedzialny  jest  składnik  cukrowy,     
najczęściej  heksozy,  heksozoaminy  i  kwas  neuraminowy).  Gangliozydy  stanowiące  blisko  6  %  substancji  szarej 
mózgu  mają  istotne  znaczenie  fizjologiczne.  Transport  większości  składników  lipidowych  między  narządami    i 
tkankami  odbywa  się  w  kompleksach  z  białkami  –  lipoproteinach,  których  aktualnie  wyróżniamy  4  frakcje: 
chylomikrony,  VLDL,  LDL  i  HDL.  Ważnym  elementem  strukturalnym  lipoprotein    są  składniki  białkowe  – 
apoproteiny, o dużym powinowactwie do receptorów komórkowych a także działające jako aktywatory lub inhibitory 
enzymów lipolitycznych. 

 
2.1. TŁUSZCZE PROSTE 

 

2.1.1. Badanie składu i podstawowych właściwości triglicerydów 
 
2.1.1.1. Wykazanie glicerolu za pomocą próby akroleinowej 

Akroleina jest nienasyconym aldehydem, który powstaje z glicerolu (składnika tłuszczów) w wyniku utraty 

dwóch cząsteczek wody.  

H-C

H-C

H-C

OH

OH

OH

H

H

KHSO

4

H

2

 O

CH

2

CH

C

H

O

glicerol

akroleina

-2

 

Wykonanie: 
Do suchej probówki wsypać około 0,2g KHSO

4

 i 2 krople oleju. U wylotu probówki umieścić pasek bibuły 

zwilżony amoniakalnym roztworem azotanu srebra (0,1M  AgNO

3

). Probówkę ostrożnie ogrzewać w 

płomieniu palnika gazowego.  
W trakcie ogrzewania akroleina wydziela się w postaci ciężkiego drażniącego drogi oddechowe  dymu, o przykrym 
zapachu. Bibuła czernieje na skutek pojawienia się srebra metalicznego (w wyniku redukcji jonów Ag

+

). 

 

2.1.1.2. Zmydlanie tłuszczów (wykazanie reakcją zmydlania obecności kwasów    tłuszczowych). 
 

Proces  hydrolizy  (zmydlanie)  polega  na  ogrzewaniu  tłuszczów  prostych  z  mocnymi  zasadami  (NaOH  lub 

KOH) co prowadzi do otrzymania glicerolu (w wyniku rozkładu wiązań estrowych) i mieszaniny rozpuszczalnych w 
wodzie mydeł (soli  wyższych kwasów tłuszczowych)  

14 

 

C

C

C

H2

H

H2

O

O

O

C

C

C

R 

1

R 

2

R 

3

O

O

O

C

C

C

H2

H

H2

OH

OH

OH

ONa

C

R 

1

O

ONa

C

R 

2

O

ONa

C

R 

3

O

+ 3NaOH

+

+

TAG

glicerol

mieszanina mydeł

 

2.1.1.2.1. Otrzymywanie mydła potasowego 
Wykonanie:   
W probówce umieścić około 5 kropli oleju i 1 ml 10% alkoholowego roztworu KOH. Ogrzewać próbę we 
wrzącej łaźni wodnej około 15 minut. 
Na dnie probówki powstaje mydło o konsystencji galarety. Do probówki z otrzymanym mydłem dodać 2,5 ml 
wody, Powstaje opalizujący roztwór, który przy wstrząsaniu się pieni ( roztwór mydła). Następnie do 
probówki dodać około 1 g krystalicznego NaCl i dobrze wymieszać. Dochodzi do wytrącenia wysolonego mydła 
( osad tworzy nad roztworem dość zwartą warstwę), które po dodaniu około 5 ml wody rozpuszcza się. 
Po dodaniu do roztworu mydła  chlorku sodu cząsteczki wody zostają usunięte z powierzchni miceli co powoduje 
wytrącenie koloidu. Zjawisko to zwane wysoleniem koloidu jest odwracalne, czyli po dodaniu wody wytrącony 
koloid ponownie się rozpuszcza. 
 
2.1.1.2.2. Otrzymywanie mydła nierozpuszczalnego 
 

Z  roztworów  mydła  rozpuszczalnego  (sodowego lub potasowego) roztwory zawierające  jony wapnia, baru, 

ołowiu  wytrącają    osad  nierozpuszczalnego  mydła.  Sole  te  nie  zmniejszają  napięcia  powierzchniowego.  (Mydła 
wapniowe i magnezowe tworzą  się w zetknięciu z twardą wodą i  nie mają właściwości myjących).  
Wykonanie: 
Do probówki z 1ml roztworu mydła ( otrzymanego w poprzednim ćwiczeniu) dodać 0,5 ml 0,1M CaCl

2 

. Próbę 

wykonać podobnie z 0,1 M BaCl

2

.  

Wytrąca się osad, który po dodaniu wody nie rozpuszcza się, a więc wytrącanie się nie jest procesem wysalania. 
 
2.1.1.3. Emulgacja tłuszczów 
 

Nierozpuszczalne  w  wodzie  tłuszcze,  w  obecności  substancji  emulgujących  mogą  tworzyć  trwałe  emulsje. 

Mydła  należą  do  substancji  obniżających  napięcie  powierzchniowe  i  dlatego  mogą  służyć  do  wytwarzania  trwałej 
emulsji z wodą. Tłuszcze spożyte z pokarmami są emulgowane w przewodzie pokarmowym przez kwasy żółciowe 
zawarte w żółci. 
Wykonanie: 
Do dwóch probówek  dodać po kilka kropli oleju. Następnie do jednej dodać 0,5 ml roztworu mydła a do 
drugiej probówki 0,5 ml wody. Obie próby silnie wstrząsnąć i odstawić na kilka minut.  
W probówce zawierającej mydło tworzy się trwała emulsja, próba z dodatkiem wody rozwarstwia się. 

 

2.1.1.4. Badanie rozpuszczalności tłuszczów 
Wykonanie: 
Do 5 probówek kolejnych rozlać po 1 ml wody, etanolu, chloroformu, benzenu i eteru, a następnie dodać do 
każdej po około 0,5 ml oleju.  
Obserwować różnicę rozpuszczania się tłuszczu w poszczególnych rozpuszczalnikach. 
 
2.1.1.5. Otrzymywanie z mydeł wolnych kwasów tłuszczowych

  

 

Mocny kwas mineralny wypiera z mydeł nierozpuszczalny w wodzie kwas tłuszczowy.   

 

CH

3

(CH

2

)

16

-COONa

H

2

SO

4

CH

3

(CH

2

)

16

-COOH

Na

2

SO

4

2

+

2

+

stearynian sodu

kwas stearynowy

 

Wykonanie: 
Do 2 ml roztworu mydła dodawać kroplami 1M H

2

S0

4  

do odczynu kwaśnego (sprawdzić papierkiem 

uniwersalnym). Na powierzchni roztworu pojawia się nierozpuszczalny w wodzie film wolnych kwasów 
tłuszczowych. 
 
2.1.1.6. Wykazanie obecności kwasów tłuszczowych nienasyconych 

 

N

ienasycone kwasy tłuszczowe  zawierają jedno lub więcej wiązań podwójnych. Tłuszcze zawierające takie 

kwasy tłuszczowe zdolne są do przyłączenie atomów chlorowca do dwóch sąsiadujących ze sobą węgli połączonych 
wiązaniem podwójnym. 

15 

 

 

CH

3

-(CH

2

)

7

CH=CH-(CH

2

)

7

-COOH

C

H

H

CH

3

-(CH

2

)

7

C

Br

Br

(CH

2

)

7

-COOH

Br

2

kwas oleinowy

kwas 9,10 dibromostearynowy

 

 

Wykonanie: 
W 1 ml chloroformu rozpuścić 2 krople oleju, a następnie do probówki dodać 1 ml wody bromowej. 
Następuje zmętnienie warstwy chloroformowej, gdyż powstaje nierozpuszczalny bromowany kwas tłuszczowy na 
skutek przyłączenia się bromu w miejscu wiązań podwójnych, zaś woda bromowa odbarwia się (warstwa górna). 
 

  Odczynniki (do ćwiczeń 2.1. TLUSZCZE PROSTE) 

 

olej  
roztwór mydła  
H

2

SO

4 , 

1M (kwas siarkowy) 

KHSO

4

,

  

krystaliczny 

AgNO

3

,

  

0,1M (roztwór amoniakalny), pasek bibuły 

KOH, 10% roztwór alkoholowy  
NaCl, krystaliczny (chlorek sodu) 
BaCl

2

, 0,1M (chlorek baru) 

CaCl

2

, 0,1M (chlorek wapnia) 

Woda bromowa (w 100 ml wody rozpuścić kilku kropli ciekłego bromu)  

 
2.2. TŁUSZCZE ZŁOŻONE 

 

2.2.1. Izolacja lecytyny i określenie jej składu chemicznego 
  
2.2.1.1. Otrzymywanie lecytyny z żółtka jaja kurzego 
         Lecytyny, dzięki obecności w cząsteczce grup hydrofilowych, tworzą z wodą roztwory koloidowe. Lecytyny są 
dobrze rozpuszczalne w etanolu i eterze, nierozpuszczalne zaś w acetonie, co wykorzystano w preparatyce lecytyn z 
żółtka jaja kurzego. Żółtko zawiera dużo tłuszczów złożonych, głównie lecytyn i kefalin i jest dogodnym materiałem 
do otrzymywania stosunkowo czystej frakcji lecytyn.  
Wykonanie: 

W zlewce na 50 ml umieścić około 5 g żółtka jaja i zalać 20 ml mieszaniny etanolu z eterem (1:1). 

Odstawić zlewkę z mieszaniną na 10 minut (pod wyciągiem), co jakiś czas mieszając bagietką. Przesączyć 
zawiesinę przez gazę  do suchej zlewki na 200 ml.  Przesącz odparować do sucha na wrzącej łaźni wodnej 
(uwaga: odparowywać pod wyciągiem). Ochłodzić próbę.  

Suchą pozostałość w zlewce rozpuścić w 3 ml eteru, a następnie wytrącić lecytyny przez dodanie 10 ml 

acetonu.  

Otrzymane lecytyny odsączyć i pozostawić na sączku. 
 

2.2.1.2. Skład chemiczny lecytyn 

P

(CH

3

)

3

N-CH

2

CH

2

-O

O

O

CH

2

C

H

C

H

2

O

O

C

C

R 

1

R 

2

O

O

+

lecytyna

 

 

 

2.2.1.2.1. Wykazanie glicerolu próbą akroleinową 
Wykonanie: 

16 

 

Do suchej probówki wsypać około 0,2g KHSO

4 

 i dodać niewielką ilość otrzymanego osadu lecytyn. U wylotu 

probówki umieścić pasek bibuły zwilżony amoniakalnym roztworem azotanu srebra (0,1M AgNO

3

). Probówkę 

ostrożnie ogrzewać w płomieniu palnika gazowego.  
W trakcie ogrzewania próby akroleina wydziela się w postaci ciężkiego drażniącego drogi oddechowe  dymu, o 
przykrym zapachu. Bibuła czernieje na skutek pojawienia się srebra metalicznego (w wyniku redukcji jonów Ag

+

). 

 
2.2.1.2.2. Wykazanie obecności fosforu 
Wykonanie: 
0,2 g  lecytyn stopić w probówce z trzykrotną ilością mieszaniny spalającej (2 części Na

2

SO

3

 + 3 części KNO

3

). 

Stop rozpuścić w 2 ml wody i przesączyć. Do 1 ml przesączu dodać 0,5 ml stęż. HNO

3

 i 1,5 ml 5% 

molibdenianu amonu. Po zagotowaniu próby wytrąca się krystaliczny żółty osad fosforomolibdenianu 
amonowego. 
 
2.2.1.2.3. Wykazanie obecności choliny (zmydlanie lecytyn) 
         Pod  wpływem  ługu  w  lecytynach  ulegają  alkalicznej  hydrolizie  estrowe  połączenia  glicerolu  i  kwasów 
tłuszczowych. W reakcji otrzymywania mydeł z lecytyn wydziela się trimetyloamina.  
Wykonanie: 
Do niewielkiej ilości lecytyny dodać 2 ml 10% alkoholowego roztworu KOH i ogrzewać probówkę we wrzącej 
łaźni wodnej przez 15 min. Wydziela się lotna trimetyloamina o charakterystycznej woni „śledziowej”, zaś 
wilgotny papierek lakmusowy u wylotu probówki staje się niebieski (trimetyloamina ma odczyn zasadowy).  
 
2.2.3. Reakcje na cholesterol. 

Cholesterol jest sterydem nierozpuszczalnym w wodzie, występuje w tkankach tak w stanie wolnym, jak też 

związanym w postaci estrów z kwasami tłuszczowymi. Jest bardzo ważnym składnikiem błon komórkowych. 

 

O

H

cholesterol

 

2.2.3.1. Wykazanie obecności cholesterolu reakcją Liebermanna-Burcharda 
         Pod  wpływem  kwasu  siarkowego  następuje  odwodnienie  cholesterolu.  W  obecności  bezwodnika  kwasu 
octowego tworzy się zielono zabarwiony produkt (kwas monosulfonowy bicholestadienu). 
Wykonanie:  
Do probówki zawierającej 1 ml 1% chloroformowego roztworu cholesterolu dodać 0,5 ml bezwodnika kwasu 
octowego i ostrożnie kroplę stężonego kwasu siarkowego (! reakcja egzotermiczna). Próba barwi się początkowo 
na czerwono, po czym przez kolor niebieski zmienia zabarwienie na zielone.  
2.2.3.2. Wykazanie obecności cholesterolu reakcją Salkowskiego 
Wykonanie: 
W probówce umieścić 0,5 ml  chloroformowego roztworu cholesterolu  
i ostrożnie podwarstwić 0,5 ml stężonego kwasu siarkowego. 
Warstwa choroformowa barwi się na czerwono, dolna kwasowa wykazuje zieloną fluorescencję. 
 

  Odczynniki (do ćwiczeń 2.2. TŁUSZCZE ZŁOŻONE ) 

żółtko jaja kurzego  
H

2

SO

4 , 

1M (kwas siarkowy) 

bezwodnik kwasu octowego, stężony  
KOH, 10% (roztwór alkoholowy 
Na

2

SO

3

, krystaliczny (siarczyn sodu) 

KNO

3

, krystaliczny (azotan potasu) 

HNO

3

 stężony (kwas azotowy)  

molibdenianu amonu, 5%. 
mieszanina etanolu z eterem, (1:1),  eter, aceton, cholesterol (1%  (roztwór chloroformowy) 

3. AMINOKWASY i BIAŁKA 

 

17 

 

Wymagana jest znajomość następujących zagadnień: 

2.  Budowa, właściwości i podział aminokwasów. Aminokwasy kwasowe i zasadowe. 
3.  Rola biologiczna aminokwasów; aminokwasy egzogenne i endogenne. 
4.  Zasady budowy i nomenklatury białek: charakterystyka wiązania amidowego (ugrupowania peptydowego). 

Nazewnictwo peptydów  

5.  Budowa przestrzenna białek. Kształtowanie i zachowanie struktury. Struktury drugorzędowe (helisa, 

harmonijkowa, pętle). Białka strukturalne i globularne – oddziaływania  stabilizujące natywną konformację.  

6.  Funkcje biologiczne i właściwości peptydów oraz  białek. 

 

Aminokwasy  (kwasy  2-aminokarboksylowe),  związki  stałe,  krystaliczne,  o  dość  wysokiej  temperaturze 

topnienia, nierozpuszczalne w rozpuszczalnikach niepolarnych, są przede wszystkim składnikami peptydów i białek. 
Tylko  20  aminokwasów  ma  trójnukleotydowe  odpowiedniki  w  kodzie  genetycznymi  i  te  właśnie  występują 
powszechnie w białkach w każdym żywym organizmie. Wszystkie aminokwasy, znalezione w produktach hydrolizy 
białek zbudowane są wg tego samego schematu  (grupa aminowa i grupa karboksylowa  związane są z tym samym 
atomem  węgla).  Aminokwasy  i  ich  pochodne  mogą  wchodzić  w  skład  lipidów  (np.  fosfatydyloseryna),  a  niektóre 
pełnią funkcje neuroprzekaźników lub są wykorzystywane do syntezy neuroprzekaźników czy hormonów. Określone 
aminokwasy  stanowią  substraty  np.  glukozy  w  glukoneogenezie,  puryn,  pirymidyn  czy  hemu.  Aminokwasy 
nieproteogenne  są  związkami  pośrednimi  w  metabolizmie  aminokwasów  proteogennych  i  w  cyklu  mocznikowym. 
Poznanie  właściwości  i  struktury  aminokwasów  stanowi  podstawę  zrozumienia  budowy  białek  i  ich  znaczenia  dla 
procesów biochemicznych determinujących zjawiska życiowe. 

Łańcuchy  zawierające  ponad  100  reszt  aminokwasów  określamy  jako  białka  i  są  to  wielkocząsteczkowe 

związki o masie cząsteczkowej od ok. 13000 do kilku milionów. Białka, nawet różnego pochodzenia, mają podobny 
skład pierwiastkowy (50-55% węgla, 6,6-7,3% wodoru, 25-19% azotu, 19-21% tlenu), mimo to różnią się znacznie 
właściwościami fizycznymi, chemicznymi i biologicznymi. 

Budowa, funkcje, oraz specyficzne właściwości białek są określone poprzez skład i sekwencję aminokwasów 

w łańcuchu, a także poprzez ukształtowanie cząsteczki w przestrzeni.  

Wszystkie  białka  są  makrocząsteczkami,  co  jest  przyczyną,  że  roztwory  ich  wykazują  cechy  koloidów  (nie 

dializują), wywierają ciśnienie koloido-osmotyczne, mają zdolność wiązania jonów, dzięki ładunkowi elektrycznemu 
cząsteczki wędrują w polu elektrycznym. Białka w roztworach silnych elektrolitów ulegają wysoleniu, są wrażliwe na 
podwyższoną  temperaturę  i  inne  czynniki  denaturujące.  Roztwory  białek  skręcają  płaszczyznę  światła 
spolaryzowanego  w  lewo  (są  zbudowane  z  aminokwasów  (z  wyjątkiem  glicyny)  optycznie  czynnych),  Cechuje  je 
duży  współczynnik  załamania  światła,  którego    wzrost  jest  proporcjonalny  do  stężenia  białka  w  roztworze  ,  co 
wykorzystuje  się  do  ilościowego  białka  metodą  refraktometryczną.  Białka  zawierające  tyrozynę  lub  tryptofan 
pochłaniają  światło  nadfioletowe  (maksimum  przy  λ=280  nm),  a  istnienie  wiązań  peptydowych  warunkuje 
pochłanianie przy λ=230 nm. 

Białka  można  podzielić  na  proste  (homoproteiny),  składające  się  prawie  wyłącznie  z  aminokwasów 

(protaminy,  histony,prolaminy,  gluteliny,  albuminy,  globuliny  i  skleroproteiny)  oraz  na  złożone  (heteroproteiny),  w 
których  poza  aminokwasami  możemy  wykryć  związki  nieaminokwasowe,  mocniej  lub  słabiej  wbudowane  w 
cząsteczkę białka, w tym: fosfo-, chromo-, gliko-, lipo-, nukleo- i metaloproteidy. 

 Białka strukturalne są odpowiedzialne za mechaniczną stabilność narządów i tkanek.  
Białka  pełnią  rolę  transportową  (hemoglobina  czy  białka  osocza).  Kanały  jonowe  i  inne  białka  błonowe 

pośredniczą w transporcie jonów oraz metabolitów przez błony biologiczne. W biochemicznych szlakach transdukcji 
sygnału białka są cząsteczkami sygnałowymi (hormony, cytokiny) jak i receptorami wiążącymi cząsteczki sygnałowe.  

Immunoglobuliny są ważnymi składnikami układu immunologicznego.  Najliczniejszymi  przedstawicielami 

białek są enzymy ( około 2000), bardzo różniące się masą cząsteczkową od 10 000 (dehydrogenaza alkoholowa) do 
500 000 (syntetaza glutaminowa). Białka są też odpowiedzialne za skurcz mięśni i inne procesy związane z ruchem. 
Białka roślinne są źródłem białek ważnych w pożywieniu człowieka - jako źródło egzogennych aminokwasów , zaś 
białka  budujące  mięśnie  mogą  być  wykorzystywane  jako  materiał  energetyczny  (z  aminokwasów  w  procesie 
glukoneogenezy powstaje glukoza). 

 

 

 
 

3.1. AMINOKWASY 

 
3.1.1. Wykazanie  właściwości amfoterycznych aminokwasów (na przykładzie tyrozyny) 

Tyrozyna  jest  prawie  nierozpuszczalna  w  punkcie  izoelektrycznym  (pH  przy  którym  aminokwas  nie  jest 

18 

 

obdarzony  ładunkiem,  nie  migruje  w  polu  elektrycznym),  a  przechodzi  do  roztworu  w  środowisku  kwaśnym  lub 
zasadowym. Większość aminokwasów przy obojętnym pH występuje jako jony obojnacze (forma amfoteryczna). W 
przypadku  aminokwasów  punkt  izoelektryczny  jest  identyczny  z  tzw.  punktem  izojonowym  (czyli  takim  pH    w 
którym cząsteczka ma jednakową liczbę protonów uwolnionych od grup karboksylowych i protonów związanych z 
grupami aminowymi).  

Dla białek pojęcia te nie są jednoznaczne. 

Wykonanie: 
Rozpuścić  w  probówce  około  0,1g  tyrozyny  w  0,5ml  1M  HCl  i  dodawać  stopniowo  po  kropli  2M  NaOH. 
Obserwować wytrącanie się osadu. 
Przy pH =4,7 tyrozyna jest prawie nierozpuszczalna , osad rozpuszcza się w nadmiarze NaOH. Należy kontrolować 
zmiany pH przy pomocy papierka uniwersalnego.  
 
3.1.2. Reakcje barwne na aminokwasy 

Reakcje barwne pozwalają wykazać obecność zarówno aminokwasów wolnych, jak i wchodzących w skład 

cząsteczki białka. 
 
3.1.2.1. Reakcja aminokwasów z ninhydryną – wykrywanie wolnych grup aminowych i karboksylowych  

Dodatnią reakcję dają ogrzewane z ninhydryną wolne   -aminokwasy i peptydy.  
Ninhydryna w tych warunkach ulega redukcji, a aminokwas utlenieniu do odpowiedniego aldehydu (uboższy 

o  1  atom  węgla)  z  wydzieleniem  CO

2

  i  NH

3

.  Ninhydryna  łączy  się  z  amoniakiem  i  zredukowaną  cząsteczką 

ninhydryny,  dając  barwny  związek.  Intensywność  barwy  jest  proporcjonalna  do  zawartości  wolnych  -aminowych 
grup i może być podstawą do ilościowego oznaczania wolnych aminokwasów, jednak badana próba musi być wolna 
od peptydów czy białek. 

Uwaga! Barwny test z ninhydryną dają też sole amonowe i aminy (aminocukry). 
 
 

C

H

COOH

NH

2

R

O

O

OH

OH

O

O

H

OH

CO

2

NH

3

C

O

H

R

O

O

H

OH

O

O

O

H

O

H

O

OH

N

O

O

NH

3

+

+

+

+

+

+

aminokwas

ninhydryna

zredukowana ninhydryna

zredukowana ninhydryna

ninhydryna

barwny kompleks

 

 
Wykonanie: 
Do 1 ml 0,5M glicyny  dodać kilka kropel roztworu 0,1% ninhydryny. Ogrzewać próbę we wrzącej łaźni 
wodnej. Podobnie wykonać próbę z 1 ml słabo zakwaszonego roztworu białka jaja. 
Pojawiająca się barwa niebieska świadczy o reakcji pozytywnej. 
 
3.1.2.2. Reakcja ksantoproteinowa

 

 

Żółta  barwa  pochodzi  od  nitrowych  pochodnych  pierścieni  benzenowych  (z  fenyloalaniny,  tyrozyny, 

tryptofanu), które pod wpływem zasad zmieniają się w związki o barwie pomarańczowej. 

19 

 

C

H

2

OH

COOH

NH

2

HNO

3

C

H

2

OH

COOH

NH

2

NO

2

-H

2

 O

C

H

2

O

COO

NH

2

NO

2

n

 

NaOH

H

2

 O

Na

+

+

-2

-

-

+2

pochodna nitrowa 
         (żółta)

pochodna aci-nitrowa
   (pomarańczowa)

tyrozyna

 

Wykonanie:

 

Do 1 ml wody dodać kroplę 1M HCl, szczyptę tyrozyny i 0,5 ml stężonego kwasu azotowego. Próbę zagotować. 
Po oziębieniu dodać 1ml 30% NaOH. Drugą próbę wykonać z roztworem białka jaja. Do 1 ml białka dodać 0,5 
ml stężonego HNO

3

. Żółty osad wytrąconego białka zalać 1ml 30% NaOH (żółta barwa przechodzi w 

pomarańczową. Uwaga! Reakcja silnie egzotermiczna.  
 
3.1.2.3. Reakcja aldehydowa  - wykazanie pierścienia indolowego w tryptofanie. 

Związki zawierające pierścień indolowy  (obecny w tryptofanie) w środowisku kwaśnym dają z aldehydami 

barwne produkty kondensacji.  

N

R

H

N

R

H

O

H

H

N

R

H

N

R

H

H

H

H

2

SO

4

H

2

 O

+

+

-

tryptofan

  aldehyd
mrówkowy

tryptofan

barwny produkt kondensacji

 

 

Wykonanie:  

Do probówki z 1 ml roztworu białka (lub surowicy) dodać 1 kroplę roztworu  0,1% aldehydu mrówkowego i 1 
kroplę 10% siarczanu rtęciowego (przed użyciem roztwór w butelce zamieszać, ponieważ HgSO

4  

osadza się na 

dnie w postaci żółtego osadu. Zamieszać i  podwarstwić  roztwór (bardzo ostrożnie, po ściance probówki) 1 ml 
stężonego H

2

SO

4

.  

Na granicy warstwy wodnej i kwasu siarkowego powstaje fioletowy pierścień. Po zamieszaniu próba barwi się na 
purpurowo. 
 
3.1.2.4. Reakcja cystynowa  - wykazanie grup sulfhydrylowych (tiolowych). 

Z cystyny i cysteiny  w reakcji ze stężonym NaOH wydziela się siarkowodór, króry z octanem ołowiu daje 

czarny osad. Z metioniną w tych warunkach próba wypada ujemnie. Białka ogrzewane w ługu sodowym hydrolizują, 
a obecne w białku aminokwasy (cystyna i cysteina) przekształcają się w kwas pirogronowy, jony siarczkowe i siarkę. 
W obecności jonów Pb

2+

 powstaje czarny osad PbS. 

 

(CH

3

COO)

2

Pb + NaOH 

Pb(OH)

2

 + 2 CH

3

COONa 

 

Pb(OH)

2

 + H

2

S 

   PbS + 2H

2

O 

Wykonanie: 
Do 0,5 ml roztw. białka dodać kilka kropel octanu ołowiawego (0,25M) i 1 ml 30% NaOH. Próbę ogrzewać we 
wrzącej łaźni wodnej.  
Uwaga! Po dodaniu HCl wydziela się trujący siarkowodór. 
 
3.1.2.5. Reakcja na obecność metioniny. 

Metionina  i glicyna w reakcji z nitroprusydkiem sodowym dają barwne produkty o nieustalonej budowie. 

Wykonanie: 
Do 1 ml 1 % metioniny dodać 3 krople 30% NaOH i 3 krople 1% glicyny. Zamieszać i dodać 3 krople 
nasyconego roztworu nitroprusydku sodu. Próbę umieścić w łaźni ( 40 C) na 10 minut. Po ostudzeniu dodać 
kroplę stężonego kwasu solnego i zamieszać. Pojawiające się czerwone zabarwienie świadczy o obecności 
metioniny. 

20 

 

3.1.2.6. Odczyn Sakaguchi - wykazanie argininy. 

Związki zawierające grupę guanidynynową (arginina) utleniają się podbrominem sodu w obecności   -naftolu 

do barwnych produktów z jednoczesnym uwolnieniem amoniaku, który pod wpływem podbrominu także się utlenia. 
Przy  dłuższym  działaniu  podbrominu  powstały  barwnik  ulega  dalszemu  utlenieniu  i  próba  odbarwia  się.  Reakcja 
znajduje zastosowanie do ilościowego oznaczania argininy w białku. 

COOH

N

H

2

N

H

NH

N

H

2

OH

COOH

N

H

2

N

H

N

H

2

O

NaBrO

NH

3

NaBr

+

+

+

arginina

1-naftol

produkt barwny
   (czerwony)

 

 

2 NH

3

 + 3 NaBrO 

 N

2

 + 3 H

2

O + 3 NaBr 

 
Wykonanie: 
Do 1 ml roztworu białka dodać 2-3 krople odczynnika Molischa (2% etanolowy roztwór   -naftolu) i po 
zamieszaniu kilka kropli podbrominu sodowego.  
Powstające czerwone zabarwienie roztworu świadczy o obecności w białku argininy.  
 
 
 

  Odczynniki (do ćwiczenia 3.1. AMINOKWASY) 

 

białko jaja kurzego 
surowica krwi  
HNO

3,  

stężony (kwas azotowy) 

H

2

SO

4

 , stężony (kwas siarkowy) 

HCl, stężony (kwas solny) 
HCl, 1M (kwas solny) 
NaOH, 2M (wodorotlenek sodu) 
NaOH,  30%. 
glicyna,  0,5M  
glicyna,  1%  
metionina, 1%  
tyrozyna, krystaliczna  
Pb(CH

3

COO)

 2

, 0,25M  (octan ołowiawy)  

HgSO

4

, 10%  (siarczan rtęciowy) 

aldehyd mrówkowy,  0,1% 
nitroprusydek sodu, roztwór nasycony  
ninhydryna,  0,1% (roztwór w 50% etanolu) 
podbromin sodowy (do 50 ml 40% NaOH dodać kilka kropel bromu)  
 
Odczynnik Molischa ( 2% etanolowy roztwór   -naftolu)  
 
 
 

 
 
 
3.2. BIAŁKA  

21 

 

 
3.2.1. Amfoteryczność białek 

Większość  białek  dobrze  rozpuszcza  się  w  wodzie,  niektóre  rozpuszczają  się  tylko  w  rozcieńczonych 

roztworach soli, kwasów i zasad. O rozpuszczalności białek decyduje ich zdolność do hydratacji, budowa, obecność 
soli w środowisku oraz pH roztworu. Peptydy i białka mają również swoje punkty izoelektryczne, ale są one istotnie 
zróżnicowane  w  zależności  od  składu  aminokwasowego  tych  cząsteczek.  Ze  względu  na  amfoteryczny  charakter 
białek można je miareczkować zarówno rozcieńczonym roztworem zasad, jak i kwasów i w ten sposób określić ich 
punkt  izoelektryczny.  Punkt  izoelektryczny  będzie  powyżej  pH  7  dla  białek  zawierających  aminokwasy  zasadowe 
(arginina,  histydyna,  lizyna)  i  poniżej  pH  7  dla  białek  zawierających  aminokwasy  kwaśne  (kw.asparaginowy, 
glutaminowy).  Większość  białek  globularnych  ma  punkty  izoelektryczne  w  przedziale  pH  4,5-6,5  (ale  np.  pepsyna 
przy pH 1 czy trypsyna przy pH 10,5). Znajomość pI ma znaczenie przy rozdzielaniu i charakteryzowaniu białek. W 
punkcie  izoelektrycznym  można  białka  najłatwiej  wytrącić  i  wykrystalizować  (najmniejsza  rozpuszczalność), 
wykazują najmniejsze ciśnienie osmotyczne, najsłabiej pęcznieją, mają najmniejszą lepkość i nie reagują z anionami 
czy  kationami.  Białka  wykazują  różnice  w  rozpuszczalności  w  zależności  od  pH  roztworu,  temperatury, 
rozpuszczalnika,  stężenia  jonów  soli  w  roztworze  (siły jonowej). Niewielkie stężenia jonów wpływają dodatnio na 
rozpuszczalność, przy większym stężeniu soli białko wytrąca się. Przyczyną tego zjawiska jest odciąganie cząsteczek 
wody  od  cząsteczek  białka  przez  jony  soli.  Zjawisko  to  zostało  wykorzystane  do  rozdziału  mieszaniny  białek, 
ponieważ wysalanie nie zmienia rodzimych właściwości białek, tzn. białko wytrącone siarczanem amonu nie ulega 
denaturacji i po oddializowaniu soli otrzymujemy czysty roztwór białka o pełnej aktywności biologicznej. Sole metali 
ciężkich w połączeniu z białkami są trudno rozpuszczalne (małe wartości stałych dysocjacji) i np. sole rtęci, ołowiu, 
miedzi, wykorzystywane są do wytrącania białek z roztworów. Połączenia z niektórymi anionami, zwłaszcza kwasów 
organicznych (kwas sulfosalicylowy, pikrynowy, trichlorooctowy), są nierozpuszczalne. Zjawisko to wykorzystuje się 
do  odbiałczania  roztworów  (białka  wtedy  jednak  najczęściej  ulegają  denaturacji).  Alkohole  i  inne  substancje 
organiczne (eter, aceton) niszczą warstwę wodną otaczającą cząsteczki białek i powodują wypadanie ich z roztworu 
(efekt podobny do wysalania) ale białka wytrącane w ten sposób w niskiej temperaturze (-5 C do -15 C) nie ulegają 
denaturacji. Ogrzanie białka powyżej 60 C powoduje również ich denaturację (niezależnie od innych czynników). W 
środowisku kwaśnym i zasadowym, mimo denaturacji cieplnej, białko nie wytrąca się. 
 
3.2.1.1. Wykazanie właściwości amfoterycznych żelatyny 
Wykonanie: 
Przygotować 4 probówki  i dodawać odczynniki wg schematu. 
 

Próba 

Woda 

destylowana 

0,5% roztwór 

żelatyny 

Błękit 

bromotymolowy 

Zieleń 

bromokrezolowa 

1. 

2 ml 

- 

- 

1 kropla 

2. 

- 

2 ml 

- 

1 kropla 

3. 

2 ml 

- 

1 kropla 

- 

4. 

- 

2 ml 

1 kropla 

- 

 
Do prób 1. i 2. dodawać kroplami z pipety 0,01M HCl, aż do wystąpienia barwy żółtej (zanotować ilość kwasu 
solnego  dodanego  do  każdej  z  prób).  Do  prób  3.  i  4.  dodawać  po  kropli  z  pipety  0,01M  NaOH,  aż  do 
wystąpienia barwy niebieskiej (zanotować ilość wodorotlenku sodowego dodanego do każdej z prób).  
Porównać wyniki miareczkowania wody i roztworu białka (żelatyny). 
 
3.2.1.2. Wyznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny. 

Dodając kazeinę do roztworów o różnym pH (zawierających odpowiednie stężenia CH

3

COOH i CH

3

COONa) 

poszukujemy wartości pH (co odpowiada pI kazeiny) przy którym wystąpił najobfitszy osad. 
Wykonanie: 
Przygotować 9 probówek. Do pierwszej probówki wlać 1,6 ml 1 M CH

3

COOH i 4,4 ml wody, a do pozostałych 

po 2,5 ml wody. Po wymieszaniu zawartości z pierwszej probówki przenieść do drugiej 2,5 ml roztworu , a z 
drugiej 2,5 ml do trzeciej itd. Z ostatniej wylać 2,5 ml roztworu. Do każdej próby dodać po 0,5 ml kazeiny , 
wymieszać, odstawić na 30 minut.  
 
 
Wynik wpisać do tabeli.   

numer probówki 

1 

2 

3 

4 

5 

6 

7 

8 

9 

22 

 

0,1 M  CH

3

COOH 

1,6 

0,8 

0,4 

0,2 

0,1 

0,05 

0,025  0,012  0,006 

pH roztworu 

3,6 

3,8 

4,1 

4,4 

4,7 

5,0 

5,3 

5,6 

5,9 

zmętnienie 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

osad 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
3.2.2.Rozpuszczalność białek. Wysalanie białek. 
 
3.2.2.1. Wpływ pH na rozpuszczalność białek. 
Wykonanie: 
1 ml surowicy rozcieńczyć dwukrotnie wodą (1:1) i dodawać kroplami 0,1M HCl,  aż do zmętnienia roztworu. 
Sprawdzić pH.  Następnie dodawać kroplami 10% NaOH, aż do rozpuszczenia się osadu. 
 
3.2.2.2. Rozpuszczalność globulin w wodzie i rozcieńczonych roztworach soli. 

Globuliny w wodzie są nierozpuszczalne z powodu skłonności do tworzenia agregatów. Kationy i aniony soli 

zobojętniają  ładunki  dipola  białkowego  i  uniemożliwiają  agregację.  Albuminy  są  dobrze  rozpuszczalne  w  wodzie 
(moment dipolowy mniejszy od globulinowego)  wykazują też większe powinowactwo do wody. 
Wykonanie: 
Do 0,5 ml surowicy krwi dodać 10 ml wody, zmieszać i odstawić na kilka minut.  
Pojawia się zmętnienie, które znika po dodaniu kilku kryształków NaCl. 
 
3.2.2.3. Ekstrahowanie białek roślinnych rozcieńczonymi roztworami soli. 
Wykonanie: 
Około 0,5 g mączki grochowej zalać 10 ml  0,9% NaCl i ekstrahować około 15 minut. Odwirować osad. 1 ml 
supernatantu rozcieńczać powoli wodą do pojawienia się zmętnienia (wytrącanie globulin). Dodać parę 
kryształków NaCl.  Osad białka rozpuszcza się ponownie.

 

 
3.2.2.4. Wysalanie białka – oddzielenie albumin od globulin. 

Zawartość białka w surowicy wynosi średnio70 g/litr, z czego albuminy stanowią około 60%, a α-globuliny-

12%, β-globuliny-10%, γ-globuliny-18%. Zawartość białka zwiększa się rzadko (np. w szpiczaku pojawia się białko 
patologiczne), zmniejsza się częściej np. przy dużej utracie białka z ustroju w nerczycach. Często przy prawidłowym 
poziomie  białka  ogólnego  zachodzą  przesunięcia  w  obrębie  poszczególnych  frakcji.  Zmniejszenie  frakcji 
albuminowej  na  korzyść  frakcji  globulinowej  powoduje  zmniejszenie  współczynnika  albuminowo-globulinowego 
(A/G - normalnie wynosi 1,5). Zmniejszenie ilości albumin może wiązać się z niedostateczną ich podażą, nadmierną 
ich  utratą  z  ustroju  (białkomocz,  wysięki),  lub  zahamowaniem  syntezy  (choroby  wątroby).  Zwiększenie  frakcji 
globulin występuje w stanach zapalnych, w przewlekłych chorobach zakaźnych lub schorzeniach wątroby. 

Albuminy  można  oddzielić  od  globulin  wykorzystując  ich  różną  rozpuszczalność  w  stężonych  roztworach 

soli. Globuliny tracą wodę hydratacyjną już przy 50% nasyceniu siarczanem amonu. Albuminy wysalają się dopiero 
przy całkowitym nasyceniu roztworu. 
Wykonanie: 
Surowicę krwi (0,5 ml) rozcieńczyć solą fizjologiczną (2,5 ml), dodać 3 ml nasyconego siarczanu amonu. Po 
dokładnym wymieszaniu (półnasycenie) odsączyć wytrącone globuliny. Do przesączu dodawać powoli 
kryształki siarczanu amonu tak długo, aż na dnie probówki pojawią się wytrącone albuminy.  
 
3.2.3. Denaturacja białek 
 
3.2.3.1. Wytrącanie albumin i globulin etanolem. 

W środowisku o pH ok. 5 globuliny wytrącają się przy 15%, a albuminy przy 40% stężeniu etanolu.  Przy 

innych wartościach pH konieczne jest większe stężenie etanolu. Białka wytrącane etanolem lub acetonem w temp. 
około –15 C nie ulegają denaturacji, co wykorzystuje się do wydzielania frakcji białek. 
Wykonanie: 
Do 0,5 ml surowicy dodać 3 ml 0,9% NaCl, oziębić w łaźni lodowej, dodać 1ml wyziębionego 96% etanolu. 
Pojawia się zmętnienie, które znika po natychmiastowym rozcieńczeniu. 
3.2.3.2. Denaturacja termiczna białek. 

Denaturacja  białek  to  zmiany  w  konformacji  łańcucha  z  utratą  rodzimych  właściwości  pod  wpływem 

czynników fizycznych (ogrzewanie, wysychanie, ultradźwięki, promieniowanie krótkofalowe, wytrząsanie wodnych 

23 

 

roztworów  białka  w  atmosferze  powietrza)  lub  chemicznych  (kwasy,  zasady,  jony  metali  ciężkich,  mocznik, 
detergenty, fenol, chloroform, etanol, aceton). Ulega zniekształceniu lub zniszczeniu struktura białka (IV,III,II rzędu) 
bez  hydrolitycznej  degradacji  łańcucha.  Zagotowanie  stężonych  roztworów  białek  powoduje  natychmiastowe 
wytrącanie  się  osadu  zdenaturowanego  białka.  By  wytrącić  białko  z  rozcieńczonych  roztworów  konieczne  jest 
zakwaszenie. 
Wykonanie:  
Przygotować 2 probówki . 
Do pierwszej dodać 2 ml rozcieńczonej surowicy (1:5) i 2 krople  2M CH

3

 COOH.  

Po zagotowaniu wytrąca się osad białka. 
Do drugiej wlać 2 ml rozcieńczonego roztworu białka jaja zagotować i dodać 2 krople  2M CH

3

COOH.  

Wytrąca się denaturowane białko. 
 
Ciepło  powodując  zrywanie  wiązań  wodorowych  w  cząsteczkach  prowadzi  do  nieodwracalnej  denaturacji  białek. 
Proces denaturacji cieplnej rozpoczyna się w różnych temperaturach dla różnych białek – między 40 C a 100 C.  
Tylko nieliczne białka wytrzymują krótkie gotowanie ( żelatyna, rybonukleaza). 
 
3.2.3.3. Reakcje białek z jonami 
 
3.2.3.3.1. Strącanie białka kationami (solami metali ciężkich). 

Jeżeli  wartość  pH  jest  większa  od  pI  cząsteczki  białka  stają  się  anionami  i  mogą  reagować  z  kationami 

tworząc sole o bardzo małej dysocjacji i trudno rozpuszczalne. 

 

Wykonanie:  
Przygotować 4 probówki.  
1) Do probówki z 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać parę kropel roztworu 1% FeCl

3

.  

Uwaga; delikatny, brunatny osad rozpuszcza się w nadmiarze odczynnika. 
2) Do probówki z 1 ml białka jaja kurzego dodać parę kropli roztworu 0,1% CuSO

4

 . 5 H

2

O. 

Wytrącony jasnobłękitny osad białczanu miedziowego rozpuszcza się w nadmiarze dodanego 2 M NaOH (około 1 
ml), dając fiołkowe zabarwienie próby. 
3) Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 1 ml roztworu 0,1M AgNO

3

. 4) Podobną próbę wykonać 

dodając do probówki z 1 ml białka jaja 1 ml 0,25M (CH

3

COO)

2

Pb.  

Obserwuje się wytrącanie białka nierozpuszczalnego w nadmiarze soli. 
 
3.2.3.3.2. Strącanie białka anionami 

Po stronie kwasowej punktu izoelektrycznego cząsteczki białka mają ładunek dodatni i zdolność reagowania z 

anionami.  Niektóre  kwasy  organiczne  w  większych  stężeniach  stosuje  się  do  odbiałczania  płynów  biologicznych. 
Kwasy nieorganiczne denaturują białka (HCl, H

2

SO

4

, HNO

3

), ale tylko kwas azotowy wytrąca je z roztworu. 

 
Wykonanie: 
Przygotować trzy probówki i wykonać z roztworem białka poniższe reakcje: 
1) Działanie stężonego kwasu azotowego - reakcja Hellera.  
Na 1 ml stężonego HNO

3

 nawarstwić 0,5 ml roztworu białka jaja kurzego.  

Na granicy zetknięcia się warstw pojawia się pierścień z wytrąconego białka. 
2) Działanie kwasu trichlorooctowego   
Po zadaniu 0,5 ml roztworu białka 3 ml 10% CCl

3

COOH obserwuje się wytrącanie  białego osadu 

zdenaturowanego białka.  
Kwas trichlorooctowy stosuje się najczęściej do odbiałczania płynów biologicznych. 
 
3) Działanie taniny.  
Wykonanie: 
Do 1 ml roztworu białka dodać 1 ml 5% taniny.  
Wytrąca się białko. Lecznicze działanie garbnika na oparzoną skórę polega na powierzchniowym ścięciu się białka, 
które tworzy nierozpuszczalną błonę chroniącą uszkodzone tkanki.. 
 
3.2.3.4. Reakcje barwne białek. 
 
3.2.3.4.1. Reakcja biuretowa Piotrowskiego 

24 

 

 

 

H

3

N C

R 

1

H

C

O

O

H

3

N C

R 

2

H

C

O

O

H

3

N C

R 

1

H

C

O

N
H

C

R 

2

C

O

O

H

2

 O

+

wiązanie peptydowe

+

 

 

(Delokalizacja  elektronów w obrębie wiązania peptydowego powoduje, że staje się ono polarne i może występować w dwóch 
odmianach tautomerycznych!)  

Reakcja biuretowa jest swoistą reakcją na obecność wiązania peptydowego (aby zaszła reakcja konieczne są 

minimum 2 wiązania) 
Opiera się na reakcji jonów miedziowych w środowisku zasadowym z biuretem.  

 

Wykonanie: 
Do probówki z1 ml roztworu białka dodać 1 ml 2M NaOH i parę kropel 0,1% CuSO

4

 . 5 H

2

O.  

W wyniku tej reakcji powstaje czerwono-fiołkowy produkt soli kompleksowej. 
 
3.2.3.4.2. Reakcja Liebermanna. 
Wykonanie: 
Wlać do probówki 1 ml rozcieńczonej surowicy i 1 ml stężonego HCl i ogrzewać we wrzącej  łaźni przez 10 
minut.  
Roztwór zabarwia się stopniowo na fioletowo. Reakcja ta jest charakterystyczna dla glikoprotein. Białko hydrolizuje 
a z cukrów powstają pochodne furfuralu, które z uwolnionymi fenolami dają fioletowe połączenia. 

 

  Odczynniki (do ćwiczenia3.3 BIAŁKA) 

białko jaja kurzego,  surowica krwi,  mączka grochowa,  żelatyna,  0,5%  
HNO

3

, stężony (kwas azotowy) 

H

2

SO

4

, stężony (kwas siarkowy) 

HCl, stężony (kwas solny) 
HCl, 0,1M  
HCl, 0,01M  
CH

3

COOH, 1M (kwas octowy) 

CH

3

COOH, 2M  

CCl

3

COOH (kwas trichlorooctowy), 10% 

tanina, 5% (kwas taninowy) 
NaOH, 1 M (wodorotlenek sodu 
NaOH, 2 M  
NaOH, 10% 
NaOH, 0,01M  
NaCl, krystaliczny (chlorek sodu) 
NaCl, 0,9%  
 (NH

4

)

2 

SO

4,  

krystaliczny (siarczan amonu) 

(NH

4

)

2 

SO

4 

, roztwór nasycony  

FeCl

3

, 1%  (chlorek żelazowy) 

CuSO

4

 . 5 H

2

O,  0,1%  (uwodniony siarczan miedzi) 

AgNO

3,  

0,1M 

 

(CH

3

COO)

2

Pb, 0,25M  

etanol, 96%, wychłodzony  
błękit bromotymolowy  i zieleń bromokrezolowa (wskaźniki) 
kazeina,  0,1 M  w CH

3

COONa ( 0,25 g kazeiny rozpuścić w 25 ml wody ogrzanej do 40 C,  

dodać 5 ml 1M NaOH, 5 ml 1M CH

3

COOH i uzupełnić wodą do 50 ml). 

 
3.2.4. Oznaczanie zawartości białka 
 
3.2.4.1. Ilościowe oznaczanie białka surowicy krwi metodą biuretową  

25 

 

Aby  ilościowo  oznaczyć  białko  w  próbie,  wykonujemy  reakcję  biuretową.  Intensywność  zabarwienia 

roztworu  jest  wprost  proporcjonalna  do  liczby  wiązań  peptydowych.  Ze  względu  na  traktowanie  próby  NaOH  (co 
zapewnia  utrzymanie  białka  w  roztworze)  metoda  jest  szczególnie  przydatna  do  zawartości  białka  w  płynach 
biologicznych,  homogenatach  tkankowych,  zawiesinach  podstruktur  komórkowych  itp.  Reakcja  ta  jest  powszechnie 
stosowana do oznaczania białka w surowicy krwi w laboratoriach klinicznych. 
Wykonanie: 
Do 0,1 ml surowicy krwi obwodowej dodać 3,4 ml 0,2M NaOH. Po wymieszaniu dodać 4 ml odczynnika 
biuretowego i odstawić na 30 min. Zmierzyć absorbancję przy długości fali   = 550 nm wobec próby 
odczynnikowej (0,1 ml wody + 3,4 ml 0,2M NaOH + 4 ml odczynnika biuretowego). Wartość absorbancji jest 
wprost proporcjonalna do stężenia białka całkowitego. Posługując się wykresem kalibracyjnym należy odczytać 
stężenie białka w analizowanej próbie. 
 

  Odczynniki 

0,2M NaOH (wodorotlenek sodu) 
Odczynnik biuretowy: 0,9 g winianu sodowo potasowego i 0,3 g siarczanu miedzi (CuSO

4

 x 5 H

2

O) rozpuścić w 40 

ml 0,2M NaOH. Dodać 0,5 g KJ i uzupełnić wodą do 100ml. 
 
3.2.4.2. Oznaczanie białka metodą pomiaru absorbancji w nadfiolecie. 

Dzięki  obecności  tyrozyny  i  tryptofanu  białka  mogą  wykazywać  maksimum  absorbancji  przy    =  280  nm. 

Zakłócają  pomiar  kwasy  nukleinowe  mające  maksimum  pochłaniania  przy    =  260  nm.  Metoda  jest  obarczona 
znacznym błędem, ale ze względu na szybkość oznaczenia w małej ilości materiału w obecności dużych stężeń soli 
jest szeroko stosowana. 
Wykonanie:  
Dokonać pomiaru absorbancji próby badanej (rozcieńczony roztwór albuminy)  wobec próby odczynnikowej ( 
rozpuszczalnik) przy      = 280 nm  i     = 260 nm i obliczyć orientacyjną zawartość białka ze wzoru: 

 

 

 

C białka = 1,55 · A

( 280nm)

 ─ 0,76 ·A

( 260nm)  

Odczynniki :  albumina 1% , (roztwór w soli fizjologicznej) 

 

4. KWASY NUKLEINOWE 

 

       Wymagana jest znajomość następujących zagadnień: 

1. 

Nukleotydy: budowa i właściwości. 

 

2.  Znaczenie biologiczne wolnych nukleotydów. 
3.  Kwasy nukleinowe: DNA i RNA, budowa przestrzenna. 
4.  Organizacja informacji genetycznej( cechy kodu genetycznego) - replikacja, transkrypcja, translacja. 

Mutacje i czynniki mutagenne. 

 

Niezwykłe osiągnięcia w dziedzinie chemii i fizjologii kwasów nukleinowych są możliwe dzięki modelowi 

struktury przestrzennej DNA (Watsona i Crick   - 1953 r.). Istotą życia jest zdolność do powielania przez organizmy 
swojej informacji genetycznej i przekazywania jej organizmom potomnym.  

Podstawę tej informacji stanowi kwas dezoksyrybonukleinowy i następujący jej kierunek przekazywania: 

DNA   

   RNA   

   białka   

   komórka   

   organizm 

Centralnym dogmatem biologii molekularnej jest poniższy schemat przepływu informacji genetycznej: 

DNA   

   DNA   

   RNA   

   białko 

Synteza potomnej cząsteczki DNA to replikacja, przekazywanie informacji z DNA na RNA – transkrypcja, a 

z RNA dla syntezy białka  - translacja (przetłumaczenie informacji zapisanej jako sekwencja nukleotydów  na „język 
aminokwasów”, przekazywanie informacji z RNA na DNA to odwrotna transkrypcja.  

Kwasy nukleinowe powstają z połączenia nukleotydów, składających się z zasady azotowej (purynowej  lub 

pirymidynowej), cukru (pentozy) oraz reszty fosforanowej. Zasady azotowe łącza się z cząsteczkami cukru wiązaniem  
N-glikozydowym  tworząc  nukleozydy,  a  nukleozyd  połączony  wiązaniem  fosfoestrowym  z  kwasem  fosforowym 
tworzy  nukleotyd,  podstawową  jednostkę  łańcucha  polinukleotydowego  Wyróżnia  się  pierwszo-,  drugo-, 
trzeciorzędową    i  wyższe  struktury  kwasów  nukleinowych.  Kwasy  nukleinowe  stanowią  niebiałkową  część 
nukleoprotein. Ogrywają główną rolę w przechowywaniu (DNA) i w procesach ekspresji genów i biosyntezie białek 
(RNA). 

26 

 

 

Wolne  nukleotydy  magazynują  energię  (ATP,  GTP,  CTP,  UTP)  wykorzystywaną  w  procesach  fosforylacji 

czy  aktywacji  związków:  aktywna  glukoza(UDP-glukoza),  aktywna  cholina(CDP-cholina),   S-adenozylometionina), 
Nukleotydy  są  składnikami  koenzymów  (NAD,NADP,FAD)  jak  i  wtórnymi  przekaźnikami  informacji  hormonalnej 
(cAMP czy cGMP). 
 
4.1. Badanie DNA 
 
4.1.1. Izolowanie kwasu deoksyrybonukleinowego z wątroby 
Wykonanie: 
W moździerzu utrzeć 5 g wątroby, pociętej na drobne kawałki, z niewielką ilością piasku. Dodać 20 ml 0,9% 
NaCl. Zawiesinę przesączyć przez gęstą gazę. W zlewce (na 50 ml) zmieszać 10 ml przesączu z 1 ml siarczanu 
dodecylu , którego dodanie tego powoduje wzrost lepkości roztworu i odstawić na 5min. Następnie powoli, 
ciągle mieszając dodawać krystaliczny NaCl (około 0,6 g). Odwirować wytrącone białko, a nadsącz umieścić w 
zlewce (50 ml) i powoli, ciągle mieszając bagietką, wlewać po ściance 10 ml schłodzonego 96% etanolu (-15

0

C). 

Pod wpływem alkoholu wytrącają się włókienka DNA, które można nawinąć na bagietkę i wysuszyć na sączku. 
 
4.1.2. Otrzymywanie hydrolizatu nukleinianów 
Wykonanie: 
W probówce umieścić otrzymany z wątroby preparat DNA, dodać 2ml wody i 1 ml stężonego H

2

SO

4

 i 

hydrolizować próbę przez 30 minut we wrzącej łaźni wodnej. Roztwór oziębić i rozcieńczyć dwukrotnie wodą. 
 
4.1.3. Wykrywanie składników kwasów nukleinowych 
a. Wykrywanie puryn w kwasach nukleinowych 
Wykonanie: Do 1 ml 1% hydrolizatu nukleinianu dodać 0,5 ml amoniaku do słabo zasadowej reakcji i kilka 
kropel amoniakalnego roztworu AgNO

3

. Wytrąca się biały, delikatny osad soli srebrowych puryn. 

b. Wykrywanie kwasu fosforowego. 
Wykonanie : Do 1 ml hydrolizatu dodać 0,5 ml stężonego HNO

3

 i 1 ml 5% molibdenianu amonu. Po zagotowaniu 

wytrąca się żółty osad, co świadczy o obecności fosforanów. 
c. Wykrywanie pentoz  
Wykonanie: Do 1 ml hydrolizatu dodać 1 ml roztworu 0,5%floroglucyny i ogrzewać do wrzenia.  
Czerwone zabarwienie płynu świadczy o obecności pentoz.  
 
4.1.3.3.1. Wykrywanie deoksyrybozy.

  

Wykonanie: 
Do 1 ml hydrolizatu dodać 2 ml odczynnika dwufenyloaminowego i wstawić do wrzącej łaźni wodnej.  
DNA  reaguje  z  dwufenyloaminą  w  obecności  kwasu  octowego  i  siarkowego,  dając  niebiesko  zabarwiony  produkt 
reakcji. Reakcja ta może być podstawą do kolorymetrycznego oznaczania DNA, bowiem absorpcja światła o długości 
fali      600 nm (niebieski zakres widma światła) jest proporcjonalna do zawartości tego kwasu. 
 

  Odczynniki  

Wątroba, piasek  
HNO

3, 

stężony (kwas azotowy) 

H

2

SO

4, 

stężony (kwas siarkowy) 

amoniak, stężony (25% woda amoniakalna) 
NaCl, krystaliczny (chlorek sodu) 
NaCl, 0,9% (sól fizjologiczna) 
AgNO

3,  

0,1M (roztwór amoniakalny)  

etanol,  96% (wychłodzony do -15

º

C).  

molibdenian amonu,  5% 
siarczanu dodecylu, 5% (roztwór w 50% etanolu) 
hydrolizat nukleinianów 
floroglucyna, 0,5% 
odczynnik dwufenyloaminowy  

5. ENZYMY 

 
       Wymagana jest znajomość następujących zagadnień: 

27 

 

1.  Ogólne właściwości enzymów. Klasyfikacja enzymów i nazewnictwo. 
2.  Mechanizm  katalizy  enzymatycznej.  Centrum  aktywne.  Specyficzność  działania  i  specyficzność  substratowa 

enzymów 

3.  Aktywność enzymatyczna. Jednostki enzymatyczne i czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznej, 

regulacja aktywności enzymów. 

4.  Izoenzymy, preenzymy, kompleksy wieloenzymatyczne. 
5.  Koenzymy, witaminy. 

  

Enzymy  są  złożonymi,  ciepłochwiejnymi  wielkocząsteczkowymi  białkowymi  biokatalizatorami,  tzn. 

związkami  wytwarzanymi  przez  żywe  komórki  (ale  mogą  działać  poza  komórkami),  chociaż  znana  jest  także 
aktywność kaltalityczna kwasów rybonukleinowych. Odznaczają się dużą swoistością w przyspieszaniu  i nadawaniu 
odpowiedniego  kierunku  reakcjom  chemicznym.  Cząsteczka  enzymu  tworzy  z  substratem  przejściowy,  labilny 
kompleks, z którego po przekształceniu substratu uwalnia się produkt reakcji, a niezmieniony enzym może ponownie 
połączyć się z następną cząsteczką substratu.  

Wyróżnić można trzy kategorie enzymów: 
enzymy - białka proste, w których rolę grupy czynnej spełniają specyficzne zespoły aminokwasów (enzymy 

proteolityczne – amylaza, RNaza),   

enzymy  -  białka  złożone  zawierające  nieaminokwasowe  grupy  chemiczne  trwale  związane  z  cząsteczką 

białkową tzw. grupy prostetyczne ( katalaza, peroksydaza,  

enzymy  należące  do  białek  złożonych  zawierające  związane  luźno  nieaminokwasowe  grypy  zwane 

koenzymami,  część  białkowa  zwie  się  wtedy  apoenzymem,  a  aktywny  enzym  jako  całość  –  holoenzymem  (np. 
dehydrogenazy, których koenzymem może być NAD+ lub jego fosforan NADP+).  
 

Zorganizowany przebieg procesów metabolicznych (szlaków metabolicznych precyzyjnie - skoordynowanych 

ciągów  następujących  po  sobie  reakcji  chemicznych)  umożliwia  fakt,  że  każda  komórka  korzysta  z  własnych, 
genetycznie  zaprogramowanych  narzędzi  enzymatycznych.  Wiele  ciągów  reakcji  enzymatycznych  przebiega  na 
błonach.  Enzymy  podlegają  wielu  mechanizmom  regulacyjnym  w  zależności  od  zmiennych  warunków  środowiska 
wewnętrznego  organizmu.  Tylko  wyjątkowo  można  oznaczyć  ilość  enzymu  bezpośrednio  na  podstawie  zawartości 
białka  (  metody  cytometryczne,  przeciwciała).  Biochemiczne  oznaczanie  opiera  się  na  założeniu,  że  aktywność 
enzymu jest proporcjonalna do jego stężenia, a miarą aktywności jest szybkość katalizowanej reakcji, przebiegającej 
w warunkach optymalnych, przy nadmiarze substratu. Funkcja enzymu wyraża się przebiegiem katalizowanej reakcji, 
a  ilość  enzymu  w  układzie  można  oznaczyć  na  podstawie  pomiaru  szybkości  reakcji  (  w  określonych  ściśle 
warunkach szybkość ta jest proporcjonalna do ilości enzymu). Jednostką aktywności enzymatycznej jest katal.  
Jest to taka aktywność enzymu, która przekształca 1 mol substratu w   czasie 1 sekundy, a jej mianem jest „mol/s”. 
Jednym z kryteriów jednorodności enzymów jest osiągniecie w wyniku oczyszczania, maksymalnej liczby jednostek 
aktywności  przypadających  na  1  mg  azotu  białkowego.  Otrzymanie  enzymów  z  materiału  biologicznego  wymaga 
takiego postępowania i doboru metod, które pozwalają na zachowanie pełnej ich aktywności. Oznaczenie aktywności 
niektórych  enzymów  w  płynach  ustrojowych  znalazło  szerokie  zastosowanie  diagnostyczne.  Całkowita  aktywność 
enzymu  oznaczonego  w  surowicy  może  odzwierciedlać  rozmiar  uszkodzenia,  rodzaj  wykrywanych  we  krwi 
izoenzymów np. dehydrogenazy mleczanowej wskazuje na miejsce uszkodzenia komórkowego, gdyż każdy gen ulega 
w  różnych  narządach  odmiennej  ekspresji  i  każdy  narząd  ma  charakterystyczny  profil  izoenzymów.  Stosunkowo 
najlepiej rozwinęła się diagnostyka enzymologiczna schorzeń mięśnia sercowego, wątroby, trzustki czy żołądka. 

Występowanie  tego  samego  enzymu  w  kilku  odmianach  zwanych  izozymami,  które  różnią  się  budową  i 

właściwościami fizycznymi lecz wykazują takie samo działanie utrudnia izolowanie  i oczyszczanie enzymów. 

Wiele enzymów może występować w różnych konformacjach, które mają różne właściwości katalityczne, a 

ich  wzajemne  przekształcenia  są  regulowane  przez  substraty  i  inne  ligandy  (np.  enzymy  alosteryczne).Także 
temperatura i wiele substancji może mieć wpływ na aktywność enzymatyczną. Szczególne znaczenie mają inhibitory 
enzymów (inhibicję kompetycyjna, niekompetycyjna czy allosteryczna).  
 
5.1. Kinetyka reakcji enzymatycznych 

Kinetyka  reakcji  enzymatycznych  obejmuje  badania  szybkości  ich  przebiegu  w  zależności    od  stężenia 

reagujących  substancji,  temperatury,  pH,  obecności  aktywatorów  i  inhibitorów.  Badanie  kinetyki  pozwala  na 
ustalenie charakteru reakcji i poznanie zależności między szybkością reakcji a czasem jej trwania.  

Szybkość  reakcji  jest  proporcjonalna  do  stężenia  substancji  reagujących  i  oznacza  stosunek  przyrostu 

(ubytku) stężenia produktu reakcji do czasu, w którym ten przyrost nastąpił, gdyby szybkość reakcji w tym okresie 
była niezmienna. Miarą szybkości reakcji jest przyrost stężenia produktu jaki nastąpił w jednostce czasu. 

Stała    Michaelisa  jest  to  takie  stężenie  substratu,  przy  którym  szybkość  reakcji  osiąga  połowę  szybkości 

maksymalnej ; Stała Michaelisa określa liczbowo powinowactwo enzymu do substratu. Niskie wartości Km wskazują 

28 

 

na duże powinowactwo enzymu do substratu oraz dużą szybkość procesu i odwrotnie. Wartości Km dla większości 
enzymów  wahają  się  w  granicach  10-2  10

-5

  M.  Zależność  między  stężeniem  substratu  a  szybkością  reakcji 

enzymatycznej opisuje równanie Michaelisa-Menten. 
 
5.1.1. Badanie enzymatycznej aktywności amylazy ślinowej 

Amylaza  należy  do  hydrolaz  i  powoduje  hydrolityczny  rozkład  skrobi,  przez  rozrywanie  wiązań 

glikozydowych  pomiędzy  cząsteczkami  glukozy  (budującymi  dużą  cząsteczkę  wielocukru).  Skrobia  rozpada  się 
stopniowo  poprzez  amylo-,  erytro-,  achrodekstryny  do  pojedynczych  cząsteczek  glukozy.  Przy  pomocy  reakcji  z 
jodem,  można  śledzić  szybkość  rozkładu  skrobi.  Obserwuje  się  intensywnie  niebieską  barwę  w  reakcji  z  amylozą 
(skrobią),  amylodekstryny  dają  barwę  fioletową,  erytrodekstryny  czerwoną,  natomiast  achrodekstryny,  zawierające 
niewielką ilość reszt glukozy, nie dają zabarwienia z jodem. Hydrolizat wykazuje właściwości redukcyjne w związku 
z pojawiającą się coraz większą ilością wolnych grup aldehydowych. 

 

5.1.1.1. Wpływ temperatury na aktywność amylazy 
Wykonanie: 
Przygotować preparat amylazy w podany sposób: przepłukać dokładnie usta ciepłą wodą. Następnie nabrać do ust 
około 20 ml wody (destylowanej) i po kilku minutach wypluć wodę do zlewki. Przesączyć roztwór śliny przez watę. 
Otrzymany roztwór stanowi badany preparat amylazy ślinowej. 
Do trzech probówek wprowadzić 1 ml rozcieńczonego (0,005M) roztworu  J

2

 w KJ, 1  ml buforu (pH 6,6) i  1 

ml 1% roztworu skrobi.  Zamieszać próby i dodać do każdej po 1 ml roztworu śliny (amylaza).  Jedną 
probówkę wstawić do zlewki z lodem (0

º

C), drugą pozostawić w temperaturze pokojowej, a trzecią wstawić do 

łaźni wodnej o temperaturze 37

º

C. Po paru minutach porównać szybkość reakcji  w różnych 

temperaturach(czas, który upłynął do odbarwienia próbki). Wskazać optymalną temperaturę dla działania 
amylazy. 
 
5.1.1.2. Stopniowy rozkład skrobi przez amylazę 
Wykonanie: 
Przygotować 2 szeregi po 10 probówek. Do pierwszego szeregu wlać po 1 ml roztworu jodu, do drugiego po 0,5 
ml 2M NaOH. W celu hydrolizy probówkę z badanym roztworem (5 ml roztworu 1% skrobi + 5 ml 
przygotowanego preparatu amylazy) wstawić do łaźni wodnej o temp. 37

º

C. Co pół minuty pobierać pipetą 

próbki hydrolizatu (0,5 ml) i wlewać kolejno do probówek z obu szeregów. Obserwować przebieg reakcji 
barwnej z jodem w pierwszym szeregu, a do drugiego dodać po 1 ml odczynnika Benedicta i zagotować w łaźni 
wodnej. Obserwować pojawianie się osadu tlenku miedziawego ( reakcja redukcyjna na glukozę). 
 
5.1.1.3. Wpływ jonów chlorkowych na aktywność amylazy (silnie wzmagają aktywność amylazy). 
Wykonanie: 
Przygotować jedną probówkę z 1 ml wody i drugą z 1 ml 2% NaCl. Do obu dodać po 1 ml 1% skrobi, 1 ml 
roztworu amylazy i 1 ml rozcieńczonego do słomkowego koloru  roztworu J w KJ (0,005M). Wstawić próby do 
łaźni wodnej o temp. 37

º

C i porównać odbarwiania się obu prób. 

 
5.1.2. Stopniowe trawienie kazeiny trypsyną. 

Trypsyna  jest  hydrolazą  o  dużej  specyficzności,  która  katalizuje  tylko  wiązania  utworzone  z  grupy 

karboksylowej aminokwasów takich jak: lizyna lub arginina, a peptydy powstające w wyniku działania trypsyny mają 
te  aminokwasy  (z  wolną  grupą  karboksylową)  jako  końcowe.  Trypsyna  produkowana  przez  trzustkę  (w  postaci 
nieaktywnego trypsynogenu) ma optimum działania przy pH=7-8 

N

H

C

H

CO

R 

1

N

H

C

H

R 

2

CO

 

Wykonanie: 
Przygotować kilka probówek zawierających po 0,5 ml 10% kwasu trichlorooctowego. Do probówki z 15 ml 
roztworu 0,5% kazeiny wlać 1 ml  1% trypsyny i wstawić do łaźni wodnej o temp.37ºC i co minutę pobierać po 
0,5 ml hydrolizatu do przygotowanych wcześniej probówek . Hydrolizę prowadzić tak długo, aż w próbie nie 
będzie zauważalnego osadu wytrąconego białka. 
 
5.1.3.  Oznaczanie aktywności pepsyny metodą Ansona 
 

Pepsyna wytwarzana jest w żołądku w postaci nieczynnego pepsynogenu, który w środowisku kwaśnym (w 

29 

 

żołądku) zostaje zaktywowany przez odczepienie od preenzymu kilku oligopeptydów. Produktem katalitycznego 
działania pepsyny na białka jest mieszanina polipeptydów, a optimum jej działania leży w zakresie pH 1-2. 
Substratem dla pepsyny może być albumina lub hemoglobina. Podczas hydrolizy białka uwolnione zostają 
aminokwasy, m.in. tyrozyna i tryptofan, które z odczynnikiem Folina-Ciocalteau tworzą niebieski produkt.  
Wykonanie: 
Oznaczyć aktywność badanego roztworu pepsyny w następujący sposób: 
do czterech probówek dodać po 2 ml roztworu albuminy (1%);  
następnie do kolejnych probówek dodawać:  

do pierwszej   -  

0,5 ml 0,03M HCl (pH=4) 

do drugiej       - 

0,5 ml 0,3M HCl (pH=1,6)  

do trzeciej      -  

0,5 ml 2M HCl (pH=0,7)  

do czwartej    - 

0, 5ml wody dest. (pH=6) 

Wstawić probówki do łaźni wodnej o temp. 37

0

C i po 5 minutach dodać do każdej po 0,5 ml badanego 

roztworu pepsyny. Zanotować czas rozpoczęcia reakcji enzymatycznej. Po 10 min. przerwać reakcję przez 
dodanie do każdej próby po 5 ml 0,3M CCl

3

COOH. Następnie próby wymieszać i odwirować lub przesączyć. 

Do 2,5 ml klarownego przesączu dodać 5 ml 0,5M NaOH i po wymieszaniu dodać 1,5 ml odczynnika Folina - 
Ciocalteau. Po 10 min. zmierzyć absorbancję niebiesko zabarwionego roztworu wobec próby kontrolnej przy 
długości fali   = 700 nm. 

Wykonanie próby kontrolnej: 

Zmieszać 5 ml 0,3M kwasu trichlorooctowego, 2 ml roztworu albuminy, 0,5 ml 0,3M HCl i 0,5 ml pepsyny, 
wymieszać, po czym odsączyć wytrącone białka. Do 2,5 ml przesączu dodać  5 ml 0,5M NaOH i 1,5ml 
odczynnika Folina - Ciocalteau. 
Z wykresu kalibracyjnego (dla tyrozyny) odczytać odpowiadającą zmierzonej absorbancji równoważną ilości µmoli 
tyrozyny. Wynik podaje się w jednostkach aktywności wg Ansona. 
Jednostka aktywności Ansona jest to taka aktywność pepsyny, która w 37

º

C hydrolizuje albuminę z taką szybkością, 

że wytworzony w ciągu 1 min. produkt hydrolizy odpowiada 1 µmolowi tyrozyny. 
Na koniec należy określić pH odpowiadające maksymalnej aktywności pepsyny przez sporządzenie wykresu 
zależności aktywności pepsyny od pH mieszaniny inkubacyjnej. 
J. aktywności Ansona    µmole tyrozyny · 0,32  (0,32 - 

współczynnik uwzględniający rozcieńczenie próby i czas reakcji).  

 
5.1.4. Hydroliza enzymatyczna tłuszczów 
 

Lipaza  jest  enzymem  katalizującym  hydrolizę  tłuszczów  do  glicerolu  i  kwasów  tłuszczowych.  Lipazy 

wykazują niewielką specyficzność i katalizują rozkład estrów utworzonych przekwasi o krótkim i długim łańcuchu, 
nasycone i nienasycone oraz alkohole mające łańcuch krótki lub długi, jedno- lub wielowodorotlenowe.  
Katalizują więc rozszczepienie wiązania estrowego, a mniejszą rolę odgrywa budowa składników estru.  
Procesy  trawienne  ułatwiają  kwasy  żółciowe,  które  aktywują  lipazy  poprzez  obniżanie  napięcia powierzchniowego 
roztworu i wzmagając przez to lipolityczne działanie enzymu. Mają zwykle optimum działania przy pH 7 do 8,5. 
Wykonanie: 
W probówce zmieszać 10 ml oleju z 0,5 ml 0,1M roztworu NaOH i silnie zmieszać. Otrzymuje się trwałą 
emulsję. 
Przygotować 3 opisane probówki i dodawać odczynników zgodnie ze schematem podanym w tabeli.  
 

Numer Próby  Roztwór enzymu (lipazy) 

Emulsja oleju            

 Żółć 

I

 

2 ml 

1 ml 

- 

II

 

2 ml 

1 ml 

1 ml 

III

 

2 ml 

(zagotować przed dodaniem oleju)

 

1 ml 

- 

 
Zawartość probówek silnie zamieszać, a następnie inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37

º

C. Inkubować 

próby przez 2 godziny, mieszając co 15 min. Po 2 godzinach próby wyjąć z łaźni, ochłodzić do temperatury 
pokojowej  i do każdej probówki dodać po 2 krople fenoloftaleiny i zawartość probówek miareczkować 
roztworem 0,1M NaOH do różowego zabarwienia.  
Różnica  w ilości  mililitrów 0,1M NaOH zużytego do zobojętnienia  prób I a III i  II a III obrazuje ilość uwolnionych 
przez lipazę kwasów tłuszczowych. Różnica ilości mililitrów 0,1M NaOH zużytego do zobojętnienia  pomiędzy próbą 
I i II odzwierciedla wpływ żółci na enzymatyczną  hydrolizę oleju. 
 

5.1.5.  Wykrywanie obecności katalazy i peroksydazy. 

30 

 

Katalaza i peroksydaza (obficie występujące np. w ziemniakach, chrzanie) należa do oksydoreduktaz, których 

grupą  prostetyczną  jest  żelazo-porfiryna.  U  zwierząt  katalazę  znajdujemy  w  krwinkach  czerwonych  i  wątrobie  ,a 
peroksydazę w wątrobie, krwinkach białych, mleku. Mechanizm działania tych enzymów jest podobny: akceptorem 
elektronów jest nadtlenek wodoru, ale dla katalazy donatorem elektronów jest druga cząsteczka nadtlenku wodoru , a 
dla peroksydazy związek taki jak fenol lub amina aromatyczna. 

 

5.1.5.1. Rozkład wody utlenionej przez katalazę. 
Wykonanie: Rozcieńczyć 1 kroplę krwi w ok 2 ml wody. Roztwór ten rozlać do 2 probówek. Zawartość jednej z 
probówek zagotować Po oziębieniu dodać kilka kropel 3% nadtlenku wodoru. O obecności katalazy świadczy 
wydzielanie tlenu i tworzenie obfitej piany 
 
5.1.5.2. Wykrywanie obecności peroksydazy (utlenianie benzydyny)  

Peroksydaza w obecności nadtlenku wodoru utlenia benzydynę do błekitu benzydynowego. 

 

N

H

2

NH

2

N

H

NH

- 4H

benzydyna

błękit benzydynowy

 

Wykonanie: 
Do  dwóch  probówek  dodać  po  1g  skrawków  z  ziemniaka  i  zawiesić  w  2  ml  wody.  Jedną  z  prób  zagotować 
(inaktywacja  enzymu).  Po  oziębieniu  do  obu  dodać  po  kropli  odczynnika  benzydynowego  i  kilka  kropli  3% 
H

2

O

2

.  

O obecności  czynnej peroksydazy świadczy zabarwienie próby na niebiesko. Zdolność katalizowania reakcji 
peroksydazowej mają też inne żelazoporfiryny tzw. reakcja pseudoperoksydazowa. Wskutek zdenaturowania białka 
enzymatycznego przez zagotowanie próby reakcja peroksydazowa ustanie natomiast pseudo – np. z hemem będzie 
przebiegała nadal. 
 

5.1.6.   Izolacja sacharazy z drożdży. 

Wykonanie: Rozetrzeć w moździerzu 5 g drożdży  z niewielką ilością piasku. Dodać 10 ml wody, wymieszać i 
próbę odwirować albo przesączyć. Probówkę z przesączem umieścić w łaźni lodowej i dodawać  do próby 
zimnego acetonu aż do wytrącenia  się białego osadu sacharazy, który należy odsączyć i pozostały na sączku 
osad wysuszyć. 
Sprawdzenie aktywności otrzymanej sacharazy  

Miarą  zaś  jej  aktywności  jest  ilość  powstałej  podczas  hydrolizy  sacharozy  (dwucukier  nieredukujący)  oraz 

cukrów redukujących tj. glukozy i fruktozy. 
Wykonanie: 
Rozpuścić niewielką ilość otrzymanej  sacharazy w 5 ml wody. Do 2 probówek dodać po 1 ml roztworu 
enzymu. Jedną z prób zagotować (inaktywacja enzymu). Do obu probówek dodać po 1 ml roztworu 0,2M 
sacharozy. Umieścić w łaźni wodnej w temp. 37

º

C na 10 min. Zawartość produktów reakcji wykazać, dodając 

do każdej po 1 ml odczynnika Benedicta.  
Po zagotowaniu w próbie dodatniej pojawia się osad tlenku miedziawego, co świadczy o obecności cukrów 
redukujących. Sacharoza, w próbie z inaktywowanym enzymem, nie redukuje odczynnika Benedicta. 

  Odczynniki  

preparat amylazy ślinowej , 1%  skrobia, 2%. skrobia,  kazeina, 0,5% , trypsyna, 1% albumina, 1% , sacharoza, 0,2M  
olej, żółć (roztwór 2%), krew, skrawki ziemniaka, drożdże piekarskie,  piasek,  fenoloftaleina, 
roztwór lipazy, aceton (zimny)   
bufor fosforanowy (pH 6,6), CCl

3

COOH, 10%,   CCl

3

COOH, 0,3M (kwas trichlorooctowy)  

NaOH, 0,1M,  NaOH, 2M (wodorotlenek sodu),  NaOH, 0,5M (wodorotlenek sodu)  
HCl 0,03M (kwas solny),    HCl 0,3M,      HCl 2M  
odczynnik benzydynowy, (benzydyna, 4% w kwasie octowym lodowatym), woda utleniona, 3%  (H

2

O

2)

) 

odczynnik Folina – Ciocalteau  
odczynnik Benedicta ,   Płyn Lugola, (J

2

 w KJ, 0,005M,  roztwór rozcieńczony do słomkowego kolor 

6. ANALIZA PŁYNÓW USTROJOWYCH 
     

6.1. KREW 

31 

 

 Wymagana  jest znajomość następujących zagadnień: 

1.  Właściwości ogólne krwi. Skład krwi, budowa elementów morfotycznych. Funkcje biochemiczne. Niebiałkowe 

składniki organiczne i składniki nieorganiczne krwi. 

2.  Białka krwi (hemoglobina, funkcje białek osocza, immunoglobuliny).  
3.  Krzepnięcie krwi (rola fibrynogenu). Antykoagulanty. 
 

Krew swobodnie przemieszcza się w naczyniach krwionośnych i w ustrojach wielokomórkowych spełnia rolę 

tkanki  transportowej.    Składa  się  w 55% z osocza i zawieszonych w nim elementów upostaciowanych, tj. krwinek 
białych,  czerwonych  i  płytek  krwi,  stanowiących  45%  objętości.  Osocze  składa  się  w  91  -  92%  z  wody,  resztę 
stanowią  białka  (7-8%),  lipidy,  cholesterol,  monosacharydy,  aminokwasy,  jony  nieorganiczne.  Jednym  z  białek 
osocza  o dużym znaczeniu fizjologicznym jest fibrynogen, którego przemiana w fibrynę, pod wpływem trombiny i 
innych czynników, stanowi istotę krzepnięcia krwi. Osocze pozbawione fibrynogenu (włóknika) to surowica. Skład 
krwi odzwierciedla procesy zachodzące w organizmie.  
Skład chemiczny krwi jest zależny od stanu metabolicznego poszczególnych narządów i dlatego oznaczenia ilościowe 
składników  występujących  we  krwi  ma  podstawowe  znaczenie  diagnostyczne  (ważna  też  jest  łatwa  dostępność 
materiału do badań). 
Krew  bierze  udział  w  gospodarce  cieplnej,  wodno-elektrolitowej,  w  utrzymaniu  równowagi  kwasowo-zasadowej 
organizmu, dostarcza komórkom składników odżywczych (tlenu, substratów, koenzymów) i odbiera od nich produkty 
pośrednie i końcowe przemian metabolicznych (w tym dwutlenek węgla).  
Odczyn  krwi  utrzymuje  się  w  granicach  pH  =  7,35-7,42  dzięki  obecności  układów  buforowych  (węglanowego, 
fosforanowego, białczanowego i układu hemoglobiny i oksyhemoglobiny).  
Krew transportując hormony umożliwia przekazywanie informacji chemicznej na drodze humoralnej. 
Krew  stanowi  jedną  z  pierwszych  barier  obronnych  organizmu  ze  względu  na  obecność  przeciwciał  i  komórek 
zdolnych do fagocytozy. 
 
6.1.1. Ciśnienie osmotyczne. Hemoliza krwi 

Ciśnienie,  które  trzeba  wywrzeć  na  swobodną  powierzchnię roztworu aby zapobiec osmozie (wybiórczemu 

przenikaniu cząstek przez błonę półprzepuszczalną) nosi nazwę ciśnienia osmotycznego. Jest wprost proporcjonalne 
do  stężenia  molalnego 

(m) 

substancji  (mol/kg  wody)  i  do  temperatury  bezwzględnej  a  nie  zależy  od  rodzaju 

rozpuszczalnika i rozpuszczonego związku. Jednakowe ciśnienie mają roztwory o tym samym stężeniu molalnym. 
Pomiędzy  cieczami  ustrojowymi  znajdują  się  różne,  wybiórczo  działające  bariery  półprzepuszczalne  (błona 
komórkowa, śródbłonek naczyń, błony wyścielające jamy surowicze i przewód pokarmowy, nabłonek nerkowy). Dwa 
roztwory  przedzielone  błoną  półprzepuszczalną  i  nie  wywierające  żadnego  ciśnienia  (ciśnienia  z  obu  stron  błony 
równoważą się)  noszą nazwę izotonicznych. Roztwór o wyższym ciśnieniu osmotycznym niż drugi określa się jako 
hipertoniczny,  a  roztwór  o  niższym  ciśnieniu  jako  hipotoniczny.  Roztwory  0,3  molalne  uważa  się  za  izotoniczne 
względem  surowicy.  W  elektrolitach  uwzględnia  się  liczbę  jonów,  na    które  dysocjują  cząsteczki.  Roztworem 
izotonicznym jest więc roztwór  0,9% NaCl,  1,12% KCl,  5,4% glukozy,  10,2% sacharozy.  
Istnieją błony, które zatrzymują wielkie cząsteczki, a są przenikliwe dla związków  małocząsteczkowych. Sole takie 
dyfundują  bez  przeszkód  i  nie  powodują  różnicy  ciśnień  a  makrocząsteczki  (np.  białka)  zachowują  się  zgodnie  z 
prawami osmozy. Ciśnienie onkotyczne (koloido-osmotyczne) uwarunkowane obecnością koloidów (białek) jest małe 
ze  względu  na  stosunkowo  niewielką  ilość  makrocząsteczek,  ale  odgrywa  doniosłą  rolę  w  utrzymaniu  określonej 
objętości krwi krążącej i wymianie cząsteczek między cieczą międzykomórkową  a osoczem. 
Błona komórkowa krwinki czerwonej zachowuje się jak błona półprzepuszczalna, jest więc przepuszczalna dla wody, 
nieprzepuszczalna  dla  jonów  potasu,  sodu,  czy  wapnia,  przy  czym  ściana  włośniczki  nie  stanowi  dla  jonów  tych 
przeszkody.  Umieszczenie  krwinki  w  środowisku  hipotonicznym  powoduje  wnikanie  wody  do  jej  wnętrza, 
pęcznienie,  pękanie  błony  i  wylewanie  się  zawartości  na  zewnątrz  (hemoliza),  ponieważ  osiągnięta  maksymalna 
objętość jest ograniczona małą elastycznością błony. Krwinka czerwona w płynie izotonicznym nie zmienia swego 
kształtu.  
Hemolizę można też wywołać na drodze fizycznej np.: poprzez uszkodzenie błony krwinek przez wytrząsanie krwi, 
aspirację krwi do strzykawki pod zmniejszonym ciśnieniem, zamrożenie, zmianę ciśnienia osmotycznego środowiska. 
Można  też  uszkodzić  błonę  komórkową  rozpuszczalnikami  działającymi  na  tłuszcze  błonowe,  lub  działając 
substancjami obniżającymi napięcie powierzchniowe (detergenty, mydła, sole żółciowe). 
6.1.1.1. Hemoliza krwinek czerwonych czynnikami chemicznymi 

Otoczka  krwinek  czerwonych  zachowuje  się  jak  błona  półprzepuszczalna  (warunkuje  zjawisko  osmozy). 

Przepuszcza łatwo wodę, aniony, mocznik i glukozę, dla kationów sodu i potasu jest natomiast nieprzepuszczalna. W 
roztworze izotonicznym krwinki nie ulegają zmianom morfologicznym. Hemolizę krwi w roztworach izotonicznych 
można wywołać środkami chemicznymi takimi jak: aceton, eter, sole kwasów żółciowych, saponiny, kwasy, zasady i 

32 

 

jady  wężów.  Substancje  te    rozpuszczają  błonę  komórki  lub  wchodząc  w  reakcje  ze  składnikami  błony  powodują 
zanik jej półprzepuszczalności. 
 
Wykonanie: 
Przygotować 5 suchych probówek opisując je numerami od 1 do 5. Dodać do każdej po 2 krople krwi i kolejno 
wody, roztworów 0,9% i 2,0% NaCl, acetonu i 2% roztworu mocznika zgodnie ze schematem.  
Po zamieszaniu porównać wygląd prób.  
 
Zapisać spostrzeżenia w poniższej tabeli. 
 

 

Dodawany odczynnik ml 

Probówka 

1 

Probówka 

2 

Probówka 

3

 

Probówka

 

4 

Probówka 

5 

krew (krople) 

2 

2 

2 

2 

2 

H

2

O

 

1 

 

 

 

 

0,9%  NaCl 

 

1 

 

1 

 

2,0%  NaCl 

 

 

1 

 

 

aceton 

 

 

 

0,5 

 

2% mocznik 

 

 

 

 

1 

Wynik 

 

 

 

 

 

 
W poprawnie wykonanym doświadczeniu krew rozcieńczona wodą hemolizuje i roztwór staje się przezroczysty, a 
rozcieńczona solą fizjologiczną pozostaje nieprzezroczysta (krwinki pozostały nieuszkodzone i stanowią zawiesinę).  
Roztwory hipertoniczne powodują kurczenie się krwinek, które przybierają kształt morwowaty. Po dodaniu acetonu, 
mimo roztworu izotonicznego, krwinki ulegają hemolizie w wyniku uszkodzenia błony komórkowej przez 
rozpuszczenie lipidów błonowych. Cząsteczki mocznika przenikają swobodnie przez błonę do wnętrza komórki, a 
wraz z mocznikiem będzie wnikała odpowiednia ilość wody dążąc do wyrównania ciśnienia osmotycznego. Krwinka 
pęcznieje i pęka, czyli następuje hemoliza (roztwór w probówce staje się przezroczysty). 
 
6.1.1.2. Hemoliza przez zamrożenie 

Po zamrożeniu krwi, objętość wody zawartej w krwinkach powiększa się, co powoduje pękanie błon 

komórkowych. 
 
Wykonanie: 
Do dwóch probówek dodać po 2 krople krwi i jedną z nich zamrozić, a drugą pozostawić w temperaturze 
pokojowej. Następnie dodać do każdej po 1 ml soli fizjologicznej. Krew, która była zamrożona ulega hemolizie.  
 
6.1.1.3. Badanie oporności osmotycznej krwinek czerwonych. 

Środowisko wewnętrzne krwinki jest izotoniczne w stosunku do osocza i odpowiada ciśnieniu osmotycznemu 

0,9% NaCl (izotoniczny roztwór NaCl, tzw. roztwór fizjologiczny soli). Roztwór hipertoniczny powoduje kurczenie 
się  krwinek  (morwowacenie),  a  hipotoniczny  pęcznienie  krwinek.  Z  chwilą,  gdy  różnica  ciśnienia  osmotycznego 
przekroczy  granicę  oporności  krwinki,  krwinka  pęka  a  zawarta  w niej hemoglobina wylewa się do otaczającego ją 
roztworu         (płyn ulega hemolizie). Prawidłowe krwinki czerwone ulegają hemolizie w roztworach NaCl o stężeniu 
0,32% (oporność maksymalna) do 0,45% (oporność minimalna). W warunkach chorobowych oporność krwinek ulega 
zmianie, np. w żółtaczce hemolitycznej hemoliza występuje już przy stężeniu 0,6% NaCl.  
 
Wykonanie:  
Do przygotowanych 8 suchych probówek odmierzyć 1% NaCl i wodę zgodnie ze schematem. Wymieszać 
zawartość probówek, do każdej dodać po 3 krople krwi i ponownie zamieszać. Pozostawić w temperaturze 
pokojowej na 1 - 2 godz. 
Określić stężenie NaCl, przy którym obserwuje się początek hemolizy (lekkie żółte zabarwienie nad zawiesiną 
komórek) i całkowitą hemolizę (w całej objętości  próby przezroczysty czerwony roztwór). 
 

33 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
6.1.2. Wykrywanie hemoglobiny 

Krwinka czerwona składa się w 1/3 ze składników stałych, z czego 30% stanowi hemoglobina (Hb) - barwnik 

krwi.  Hemoglobina  powstaje  w  szpiku  kostnym,  jest  chromoproteiną  o  masie  cząsteczkowej  około 65000 i zawiera 
0,34% żelaza. Cząsteczkę hemoglobiny tworzą cztery heliakalne łańcuchy polipeptydowe. 

W  organizmie  człowieka  jest  nośnikiem  tlenu  w  postaci  hemoglobiny  utlenowanej  (oksyhemoglobiny,  Hb-

O

2)

). W procesie utlenowania stopień utlenienia żelaza (FeII) nie zmienia się, powstaje oksyhemoglobina. W reakcji 

utleniania  z  jednoczesnym  przyłączeniem  H

2

O  powstaje  methemoglobina  (Met-Hb),  a  żelazo  utlenia  się  (do  FeIII). 

Hemoglobina  300-krotnie  silniej  łączy  się  z  tlenkiem  węgla  i  już  przy  niewielkich  stężeniach  CO  znaczna  ilość 
hemoglobiny  przechodzi  w  postać  tlenkowęglową  (karboksyhemoglobinę).  Wynikiem  jest  zatrucie  organizmu, 
ponieważ  następuje  wyłączenie  hemoglobiny  z  udziału  w  transporcie  tlenu  i  blokadą  oksydazy  cytochromowej, 
uczestniczącej w utlenianiu tkankowym.  

W 100 ml krwi ludzkiej znajduje się 13 – 16 g hemoglobiny (g %, g/dl) 

 
Prawidłowe stężenie Hb wynosi: 
dla mężczyzn         12,5-19,6  g%,    (7,8-11,3 mmol/l) .              
dla kobiet               11,2-15,5  g%,    (7,2-10,0 mmol/l) 
dla noworodków   14,2-19,6  g%,    (8,8-12,2  mmol/l)   
  
6.1.2.1. Wykrywanie hemoglobiny metodą benzydynową 

Hemoglobina  ze  względu  na  swoją  budowę  (obecność  hemu)  może  zachowywać  się  w  reakcjach 

chemicznych podobnie jak peroksydaza. 
Wykonanie:  
Do 5ml wody dodać kroplę krwi. Rozlać do dwóch probówek i jedną z nich zagotować i ochłodzić. Następnie 
do obu dodać po 3 krople roztworu benzydyny w kwasie octowym i po 3 krople 3% wody utlenionej.  
Płyn barwi się na niebiesko w obu probówkach. Hemoglobina podobnie jak peroksydaza utlenia benzydynę w 
obecności wody utlenionej, lecz wynik pozytywny daje także próba po ogrzaniu, ponieważ Hb nie jest enzymem.  
Próba benzydynowa znalazła zastosowanie przy wykrywaniu śladów krwi. 
 
6.1.2.3. Ilościowe oznaczanie hemoglobiny metodą Drabkina  

Hemoglobina i jej pochodne pod wpływem odczynnika Drabkina ulegają przekształceniu w trwałą pochodną - 

cyjanmethemoglobinę wykazującą maksimum absorpcji przy λ   540nm.  

 

Wykonanie:  Do  2,5ml  odczynnika  Drabkina  dodać  0,01ml  krwi  przepłukując  mikropipetę  odczynnikiem  i 
całość wymieszać. Po 15 minutach odczytać absorbancję próby badanej i roztworu wzorcowego wobec próby 
odczynnikowej (odczynnik Drabkina). 
Wstawiając wyniki pomiaru absorbacji do podanego wzoru obliczyć stężenie hemoglobiny w badanej krwi 
 

   A próby badanej 

                            

Hb (g/100ml)

  =   

     c wzorca (g/100ml) 

 
                                                                  A wzorca 

 
Stężenie hemoglobiny można obliczyć z podanego wzoru, posługując się milimolowym współczynnikiem absorpcji 
(mε przy λ   540nm), którego wartość dla hemoglobiny wynosi 44. 

 

   A   masa molowa Hb   rozcieńczenie krwi 

numer probówki 

NaCl 1% 

(ml) 

woda 

(ml) 

otrzymane 

stężenie NaCl 

(%) 

hemoliza 

1 

3 

7 

0,3% 

 

2 

4 

6 

0,4% 

 

3 

5 

5 

0,5% 

 

4 

6 

4 

0,6% 

 

5 

7 

3 

0,7% 

 

6 

8 

2 

0,8% 

 

7 

9 

1 

0,9% 

 

8 

10 

- 

1,0% 

 

34 

 

Hb (g/100 ml) 

= —

 = 

mε   10   1000 

                                                     A   64 000 · 251 

= —

 = 

        44   10 000 

 

 

=  A   36,7 
 

  Odczynniki  (do ćwiczeń 1.KREW) 

krew 
NaCl, 0,9 % (sól fizjologiczna),  NaCl, 1.0 % (chlorek sodu),  NaCl, 2.0 %  
aceton  
mocznik, 2 % 
Odczynnik benzydynowy  

(rozpuścić 4 benzydyny w 100 ml kwasu octowego  lodowatego), 

H

2

O

2

, 3%  (woda utleniona)  

hemoglobina, roztwór wzorcowy o stężeniu 16 g % 
Odczynnik Drabkina 
(w kolbie miarowej rozpuścić 0,305 g K

2

[(Fe)CN

6 

], 1 g NaHCO

3  

i 0,05 g KCN i uzupełnić wodą do 1000 ml) 

 

 

 

 

 

 

6.2. MOCZ  

 
      Wymagana  jest znajomość następujących zagadnień: 

1.  Rola nerki w utrzymaniu homeostazy organizmu. 
2.  Funkcja nerki: filtracja, resorpcja zwrotna, sekrecja. 
3.  Skład chemiczny moczu. Składniki moczu patologicznego. 
 

Rolą  nerek  jest  wydalanie  produktów  przemiany  materii,  utrzymywanie  i  regulowanie  stanu  homeostazy 

ustrojowej,  które  w  tym  celu  wykorzystują  swą  zdolność  do  przesączania  (w  kłębkach  nerkowych),  wchłaniania  i 
wydzielania  (w  kanalikach  nerkowych).  Aby  utrzymać  stałe  stężenie  jonów  wodorowych  we  krwi  i  płynach 
ustrojowych,  pH    wydalanego  moczu  musi  zawierać  się  w  granicach  4,8  -  7,4.  Najczęściej    pH  moczu  jest  słabo 
kwaśne, ponieważ nerka wydala nadmiar nielotnych kwasów powstających w organizmie. Gdy pH moczu równa się 
pH krwi wówczas z moczem wydala się duża ilość jonów wodorowęglanowych (zwykle w moczu niewykrywalne). 
Przez  nerki  wydalane  są  głównie  fosforany    powstające  podczas  hydrolizy  estrów  fosforanowych.  Wydalenie 
nadmiernych  ilości  (H

2

PO

4

)

+   

podwyższa    pH  krwi,  a  jonów  (HPO

4

)

  2+

  obniża  je.    Nerka  usuwa  nielotne  kwasy 

organiczne,  które  powstają  w  przemianie  materii  zaoszczędzając  zasady  (HCO

3

-),  bierze  udział  w  utrzymywaniu 

stałego  stężenia  różnych  składników  w    płynach  ustrojowych,  zwłaszcza  elektrolitów,  oraz  w  utrzymywaniu  stałej 
objętości  i  stałego  pH  tych  płynów.  W  wyniku  tych  procesów  z  organizmu  zostaje  wydalony  mocz,  jest  to  tzw. 
czynność zewnątrzwydzielnicza nerki. Charakterystyczną cechą wydalania nerkowego jest wybiórczość (ponieważ z 
moczem  wydalane  są  tylko  niektóre  składniki),  a  także  zdolność  zagęszczania  wielu  składników  krwi.  W  nerce 
odbywa się również synteza związków biologicznie czynnych i jest to tzw. czynność wewnątrzwydzielnicza.  

Zależnie od sposobu wydalania wyróżnia się substancje: 

a)  wysokoprogowe  -  wchłaniane  czynnie  i  wskutek  tego  nie  występują  w  moczu  lub  są  tylko  w  małym  stężeniu. 
Pojawiają się w moczu, gdy ich stężenie w osoczu przekracza tzw. próg nerkowy (zdolność kanalików nerkowych do 
ich  resorpcji,  transport  maksymalny),  Substancje  wysokoprogowe  to  np.  NaCl,  jony  potasu,  wapnia,  jon 
wodorowęglanowy, glukoza, aminokwasy, witamina C, kreatyna. Nerka zachowuje te substancje dla ustroju, i tak np. 
glukoza zaczyna pojawiać się w moczu, gdy jej stężenie we krwi przekroczy 180 mg%.  
b) niskoprogowe - wchłaniane biernie, występują w moczu w stężeniu większym niż w  osoczu np.: mocznik, kwas 
moczowy, fosforany, siarczany. 
c) bezprogowe - nie ma ich w cieczy reabsorbowaniej, a zagęszczeniu ulegają silniej niż inne składniki moczu np.: 
kreatynina (wykorzystywana dla celów klinicznych do pomiaru filtracji kłębkowej), inulina.  
Mocz  jest  wytwarzany  przez  nerki  w  sposób  ciągły,  a  tzw.  mocz  ostateczny  jest  około  stukrotnie  zagęszczony  w 
porównaniu do tzw. moczu pierwotnego powstającego w ilości około 120 ml na minutę. Zawiera oprócz wody (92-
99%)  szereg  końcowych  produktów  przemian  ustrojowych  i  dlatego  badanie  właściwości  fizycznych  oraz  składu 
chemicznego  moczu  pozwala  na  ocenę  stanu  nerek  i  innych  narządów.  Ponieważ  skład  moczu  wydalanego  przez 
organizm zmienia się w ciągu doby, badania np. ilościowe należy wykonywać w moczu zbieranym przez 24 godziny. 
Badanie  pH  moczu  lub  badania  cytologiczne  powinny  być      wykonywane  w  moczu  świeżym,  a  np.  badania 
bakteriologiczne, mikroskopowe osadu i oznaczanie proteinurii wykonuje się w moczu wydalonym po nocy. 

Z moczem wydalane są: 

35 

 

a) związki azotowe - będące odpowiednikami azotu niebiałkowego krwi. W ciągu doby wydala się około 14 g azotu, z 
czego azot mocznika (końcowego produktu przemiany białek) stanowi 85%, kreatyniny i amoniaku po 0,5%, kwasu 
moczowego (końcowego produktu przemiany puryn) około 0,25%, a aminokwasów 0,15% 
b) związki nieazotowe organiczne - np. glukuronidy, hormony płciowe, bilirubina, różne związki siarkowe (wydalane 
w postaci związanej - nietrującej np. takie jak związany fenol), kwas szczawiowy, śladowe ilości glukozy, acetonu. 
c)  składniki  nieorganiczne  (sole  mineralne)  -  występują  jako  jony,  przy  czym  najwięcej  jest  kationów  sodowych  i 
potasowych,  w  mniejszej  ilości  występują  wapniowe  czy  magnezowe,  a  z  anionów  występują  jony  chlorkowe, 
siarczanowe i fosforanowe. W moczu zasadowym występują również jony wodorowęglanowe. 
 
Badania fizyczne moczu zwykle ograniczają się do oznaczania: 
a) ilości dobowej - u zdrowych ludzi wydala się 1000 - 1500 ml moczu na dobę (znacznie wzrasta np. w cukrzycy) 
b) gęstości - waha się w granicach 1,015 do 1,025 g/ml 
c)  odczynu  -  przeważnie  jest  lekko  kwaśny  pH  5,5  do  6,5  (przy  głodzeniu  lub  diecie  mięsno-zbożowej  występuje 
obniżenie pH, przy jarskiej może być nawet odczyn alkaliczny) 
d) barwy - zależy od występujących barwników (urobiliny, porfiryn), przyjętego pożywienia czy leków (mocz 
prawidłowy może mieć barwę od jasnożółtej do bursztynowej). 
e) przejrzystość - świeży mocz powinien być przejrzysty, po pewnym czasie może pojawić się zmętnienie pochodzące 
od niewielkich ilości białka, śluzu, komórek nabłonkowych czy leukocytów. Mogą się też wytrącać sole. 
f) zapach  - jest swoisty. Woń owocowa wskazuje na obecność ciał ketonowych (acetonu), a  amoniaku o rozkładzie 
moczu. Może się zmieniać po zjedzeniu np. szparagów, czosnku. 
 
6.2.1. Badanie moczu człowieka 
 
6.2.1.1. Badanie chemiczne moczu prawidłowego  

Skład chemiczny moczu prawidłowego  

Składnik 

zawartość w g/dobę 

woda    

1000 - 1500 

substancje stałe 

50 - 70 

związki azotowe 

 

mocznik 

25 - 35 

kreatynina 

   1 - 1,8 

kwas moczowy 

0,4 - 1 

amoniak 

0,4 - 1 

kwas hipurowy 

0,2 - 1 

aminokwasy 

0,2 - 0,4 

zasady purynowe 

0,01 - 0,06 

indykan 

 

0,01 - 0,03 

fenole   

0,1 - 0,2 

kwas szczawiowy 

0,01 - 0,02 

związki organiczne nieazotowe 

 

eterosiarczany (SO

3

) 

0,2-0,3 

siarka obojętna (SO

3

)

 

0,2-0,4 

sole mineralne  

 

chlorki   

6 - 9 

sód 

3 - 5 

potas 

1,5 - 3,5 

wapń 

0,1 

magnez 

0,1 

żelazo 

0,001 

fosforany 

1 - 1,5 

siarka całkowita 

2-3,4 

6.2.1.1.1. Wykrywanie jonów amonowych  

Amoniak  moczu  powstaje  w  komórkach kanalików nerkowych wskutek rozkładu glutaminianu. W kwasicy 

ilość amoniaku w moczu zwiększa się. Sole amonowe pod wpływem ługu w podwyższonej temperaturze rozkładają 
się z wydzieleniem amoniaku. 
Wykonanie: 

36 

 

2ml świeżego moczu zalkalizować 0,1M NaOH wobec fenoloftaleiny (do czerwonego koloru). Probówkę 
następnie ogrzać we wrzącej łaźni wodnej. Wydziela się amoniak, który rozpoznajemy po charakterystycznym 
zapachu lub po zmianie zabarwienia papierka wskaźnikowego.  
 
6.2.1.1.2. Wykrywanie jonów wapniowych 

Zasada  wykrywania  jonów  wapnia  polega  na  wytrącaniu  osadu  szczawianu  wapnia  nierozpuszczalnego  w 

kwasie octowym. 
Wykonanie: 
Do 2 ml moczu dodać 1 ml nasyconego szczawianu amonu. Sprawdzić rozpuszczalność wytrąconego białego 
osadu dodając do próby 1 ml 0,2M   CH

3

COOH. 

 
6.2.1.1.3. Wykrywanie jonów chlorkowych  

Ilość chlorków w moczu zależy od ilości NaCl pobieranego z pokarmami. Chlorki strąca  się w postaci AgCl 

(biały osad), który rozpuszcza się w amoniaku na skutek powstawania kompleksowego kationu diaminosrebrowego. 

AgCl + 2 NH

3

 → Ag(NH

3

)

2 

Cl 

Wykonanie: 
Do probówki wlać 2 ml moczu, zakwasić paroma kroplami stężonego kwasu azotowego i dodać kilka kropel 
0,1 M AgNO

. 

Powstały biały osad rozpuścić w 1 ml roztworu amoniaku.   

 
6.2.1.1.4. Wykrywanie jonów siarczanowych 

Jony  siarczanowe  wydalane  z  moczem  pochodzą  z  przemiany  aminokwasów  siarkowych.  W  moczu  siarkę 

wydalaną głównie w postaci siarczanów (90%) wykrywa się w postaci strątu siarczanu baru. 
Wykonanie: 
2 ml moczu zakwasić paroma kroplami 2 M kwasu solnego i dodać kilka kropel 0,1 M chlorku baru.  
Gdy  w  moczu  znajdują  się  jony  siarczanowe,  w  probówce  obserwujemy  wytrącanie  się  białego  osadu 
nierozpuszczalnego siarczanu baru. 
 
6.2.1.1.4. Wykrywanie jonów fosforanowych 

Wykrywanie  fosforanów  oparto  na  ich  reakcji  z  molibdenianem  amonu  w  środowisku  kwaśnym  z 

wytworzeniem żółtego fosforomolibdenianu amonowego. 
Wykonanie: 
Do 2 ml moczu dodać kilka kropel 2 M kwasu azotowego  i kilka kropel 5% molibdenianu amonu. Po ogrzaniu 
wytrąca się żółty osad. Gdy w moczu znajdują się substancje redukujące (np. witamina C), barwa próby może 
zmienić się na niebieską lub zieloną (powstaje błękit  molibdenowy).  
 
6.2.1.1.5. Wykrywanie mocznika 

Mocznik  jako  produkt  przemiany  aminokwasów  jest  wydalany  z  moczem  w  stężeniu  około  100-krotnie 

większym  niż  we  krwi.  Oddziaływanie  podbrominem    na  mocznik  powoduje  jego  rozkład  do  dwutlenku  węgla 
wiązanego przez NaOH, wody i azotu ( objętość wydzielającego się azotu jest proporcjonalna do stężenia mocznika). 

CO(NH

2

)

2

 + 3 NaBrO + 2 NaOH  → N

2

 + Na

2

CO

3

  + NaBr + 3 H

2

O 

Wykonanie: 
Do probówki z 1 ml moczu dodać kilka kropel podbrominu sodowego. Zmieszać zawartość.  
Wydzielający się gaz (azot) wskazuje na obecność mocznika. 
 
6.2.1.1.6. Wykrywanie kwasu moczowego 

Kwas moczowy jest końcowym produktem przemiany puryn. Wykrywanie kwasu moczowego opiera się na 

jego zdolności redukcji kwasu fosforowolframowego.  
Wykonanie: 
Do 1 ml moczu dodać 1 ml odczynnika fosforowolframowego i parę kropel 2M NaOH.  
W obecności kwasu moczowego roztwór barwi się na niebiesko (w wyniku redukcji kwasu fosforowolframowego do 
mieszaniny zabarwionych na niebiesko tlenków wolframu). 
6.2.1.1.7. Wykrywanie kreatyniny 
  

Kreatynina  z  krwi  jest  usuwana  przez  nerki  w  ilości  700-  2500  mg/dobę  i  zależy  od  ogólnej  masy 

mięśniowej. Kreatynina z kwasem pikrynowym tworzy czerwono zabarwiony kompleks.  
Wykonanie: 
Do 1 ml moczu dodać 3 krople nasyconego roztworu kwasu pikrynowego i 0,5 ml 10% NaOH. Pojawiające się 
czerwone zabarwienie świadczy o obecności kreatyniny. (Pozytywną reakcję dają białka, glukoza, witamina C.) 

37 

 

6.2.1.2. Badanie chemiczne moczu patologicznego 
  

W  stanach  patologicznych  wykrywa  się  w  moczu  takie  składniki  jak:  białko,  cukier,  związki  ketonowe, 

barwniki żółciowe, krew i kwasy żółciowe, porfiryny, azotyny.  
 
6.2.1.2.1. Wykrywanie białka 
  
 Ilościowe oznaczanie białka w moczu metodą turbidymetryczną Extona 
  

Z  moczem  prawidłowym  może  zostać  wydalone  do  kilkudziesięciu  mg  białka  na  dobę.  W  warunkach 

patologicznych ilość ta może wzrosnąć tysiąckrotnie (np. w nerczycach). Także białkomocz może pojawić się  przy 
niedostatecznym  ukrwieniu  nerek  np.  białkomocz  ortostatyczny,  w  gorączce,  po  zimnych  kąpielach,  po  dużym 
wysiłku fizycznym. Przy nadmiernym rozpadzie krwinek czerwonych pojawia się w moczu hemoglobina. W moczu 
może  pojawić  się  białko  patologiczne  (w  szpiczaku  mnogim  -  białko  Bence-Jonesa,  łańcuchy  lekkie 
immunoglobulin), lub mioglobina (m.cz. ok.17000) po zmiażdżeniu mięśnia.  
Do  wykrywania  białka  w  moczu  stosuje  się  reakcje  strątowe  (wytrącanie  kwasem  sulfosalicylowym, 
trichlorooctowym, azotowym lub koagulacja cieplna). 
Oznaczenie  ilościowe  opiera  się  na  pomiarze  absorbancji  zmętnienia  roztworu,  powstałego  w  wyniku  wytrącenie 
białka mieszaniną kwasu sulfosalicylowego i siarczanu sodowego. 
 
Wykonanie: 
Przygotować trzy probówki. Dodawać odczynników i moczu zgodnie ze schematem. 
 

 

próba badana 

(ml) 

próba kontrolna 

(ml) 

próba odczynnikowa 

(ml) 

badany mocz  

0,5 

0,5 

- 

0,9% NaCl 

- 

3,5 

0,5 

odcz. sulfosalicylowy 

3,5 

- 

3,5 

zmierzona 
absorbancja 

 

 

 

 
Próby dokładnie wymieszać i odstawić na kilka minut ( 4 – 10) . Następnie próby ponownie wymieszać i 
odczytać absorbancję  (przy długości fali  

 = 445 nm), próby badanej i próby kontrolnej wobec próby odczynnikowej (odczynnik sulfosalicylowy)  

Odjąć wartość absorbancji próby kontrolnej od absorbancji próby badanej. Dla wyliczonej absorbancji 
odczytać stężenie białka z wykresu kalibracyjnego. 
6.2.1.2.2. Wykrywanie cukru   
  

Glukoza  w  moczu  może  pojawiać  się  w  zaawansowanej  cukrzycy.  Najczęściej  cukry  wykrywamy 

wykorzystując ich właściwości redukcyjne. 
Wykonanie: 
Do 1ml moczu dodać 1 ml odczynnika Benedicta. Próbę zagotować.  
W razie obecności w moczu cukrów wytrąca się osad tlenku miedziawego. 
  
6.2.1.2.3. Wykrywanie acetonu (próba Lange'go) 
  

Związki  ketonowych  (tzw.  ciała  ketonowe:  kwas  acetooctowy,  aceton  i  kwas  β-hydroksymasłowy),  mogą 

pojawić się w moczu np. w cukrzycy, podczas głodzenia i przy diecie wysokotłuszczowej.  
Wykonanie:  
Do probówki z 2 ml moczu dodać 5 kropel nasyconego roztworu nitroprusydku sodu i 5 kropel lodowatego 
kwasu octowego. Zmieszać i nawarstwić na roztwór 0,5ml stężonego amoniaku.  
W wyniku reakcji na granicy roztworów powstaje purpurowy pierścień wskazujący na obecność acetonu. 
 
6.2.1.2.4. Wykrywanie kwasów żółciowych 
  

Kwasy żółciowe (pochodne kwasu cholanowego)  należą do końcowych produktów przemian cholesterolu. 

Są podstawowym składnikiem żółci i to jest główna droga ich wydalania z organizmu. Zwiększenie ich stężenia we 
krwi  i  pojawienie  się  w  moczu  ma  miejsce  np.  w  żółtaczce  mechanicznej  czy  w  chorobach  wątroby.  Obecność 
kwasów żółciowych manifestuje się obniżeniem napięcia powierzchniowego moczu.  
Wykonanie: 
Przygotować 2 probówki. Do jednej wlać 2 ml moczu, do drugiej 2 ml wody i do obu, na powierzchnię 
roztworu, wrzucić odrobinę siarki sublimowanej.  

38 

 

W razie obecności kwasów żółciowych w moczu siarka opada na dno probówki w postaci „deszczu” a  w probówce z 
wodą pozostaje na powierzchni.  
Kwasy żółciowe zbierają się w warstwie powierzchniowej znacznie zmniejszając napięcie powierzchniowe wody, co 
umożliwia przerwanie powierzchni płynu przez kryształki i opadanie siarki. 
6.2.1.2.5. Wykrywanie krwi w moczu metodą benzydynową 
  

Przyczyną obecności krwi w moczu są choroby nerek, krwi, urazy, zatrucia itp. Reakcja z benzydyną polega 

na wykorzystaniu peroksydacyjnych właściwości hemoglobiny.  
Wykonanie: 
Do 1ml roztworu benzydyny w kwasie octowym dodać kilka kropel moczu i kilka kropel wody utlenionej 3%.  
Kolor niebieski próby świadczy o obecności krwi w moczu. Hemoglobina ma zdolność utleniania benzydyny w 
obecności wody utlenionej do niebieskiej pochodnej. Odczyn dodatni mogą dawać znajdujące się w moczu leukocyty. 
(zawierają peroksydazę).  
 

 

Odczynniki  (do ćwiczenia  5.2.MOCZ) 

mocz prawidłowy,   mocz patologiczny 
 
HNO

3

, stężony (kwas azotowy)  

HNO

3

, 2 M (kwas azotowy)  

HCl, 2 M (kwas solny)  
CH

3

COOH, lodowaty  (kwas octowy)  

CH

3

COOH, 0,2M (kwas octowy)    

NaOH, 0,1 M (wodorotlenek sodowy) 
NaOH, 2M (wodorotlenek sodu) 
NaOH, 10% (wodorotlenek sodu) 
amoniak, (NH

3

 stężony)  

NaCl 0,9%, (sól fizjologiczna) 
AgNO

3

, 0,1 M (azotan srebra) 

BaCl

2

, 0,1 M (chlorek baru)  

molibdenian amonu, 5% 
szczawian amonu, roztwór nasycony  
fenoloftaleina, 2% (roztwór alkoholowy) 
nitroprusydek sodu, (roztwór nasycony)  
kwas pikrynowy,  1,2 %   
siarka, krystaliczna (sublimowana) 
 
Odczynnik fosforowolframowy   
 
Odczynnik Fehlinga I  
Odczynnik Fehlinga II 
Odczynnik Benedicta  
 
Podbromin sodowy  
(do 50 ml 40% NaOH dodać kilka kropli bromu) 
 
Odczynnik sulfosalicylowy – Exstona  
(5 g kwasu sulfosalicylowego (dwuwodnego) i 16 g siarczanu sodu (Na

2

SO

2

 · 10 H

2

O) rozpuścić i uzupełnić woda do 

100 ml)  
 
6.2.3. Testy paskowe w badaniu moczu 
  

Do  wykonywania  szybkich  badań  diagnostycznych  stosowane  są  tzw.  suche  testy,  które  pozwalająca 

wykonanie  oznaczeń  w  niewielkiej  ilości  materiału,  w  krótkim  czasie  i  z  dość  dużą  dokładnością.  Oznaczanie 
wybranych  składników  oparte  jest  na  specyficznych  reakcjach  chemicznych  i  enzymatycznych,  stosowanych  w 
tradycyjnej diagnostyce. Wykonanie oznaczenia zwykle polega na zanurzeniu paska testowego w badanym materiale 
biologicznym (moczu, osoczu) i porównaniu powstałego zabarwienie z załączoną skalą barw. Testy pozwalają np. na 
oznaczenie w moczu równocześnie takich parametrów jak, pH i ciężar właściwy moczu, zawartość  glukozy, białka, 
bilirubiny, związków ketonowych, azotanów, obecność krwi czy granulocytów.  
Wykonanie: 

39 

 

Zanurzyć pasek testowy (pole odczynnikowe) w moczu na 30 sekund. Odczytać wynik porównując powstające 
zabarwienie na odpowiednim polu testowym paska z załączoną skalą barw. Porównać odczytane wyniki ze 
skalą charakteryzującą wartości prawidłowe  i spróbować je ocenić

. 

 
6.2.4. Mikroskopowe badanie osadu moczu 
  

Obraz  mikroskopowy  ocenia  się  pod  kątem  występowania  kryształów  związków  organicznych,  soli 

nieorganicznych,  komórek  nabłonkowych,  elementów  morfotycznych,  śluzu,  bakterii,  pasożytów,  odlewów 
białkowych kanalików nerkowych itp. 
Wykonanie:  
Odwirować 10 ml moczu, nadsącz zdekantować, a pozostałość wymieszać. Wykonać preparat - kroplę 
zawiesiny nałożyć na szkiełko podstawowe i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Preparat oglądać pod 
mikroskopem.