Ć

WICZENIE 7

Małgorzata Płonka

, grupa poniedziałek 8

15

Znaczenie centralnego atomu metalu pierścienia porfirynowego

cząsteczki chlorofilu.

W reakcjach fotochemicznych energia dostarczana jest spoza układu w postaci energii świetlnej.

Zależnie od reakcji, tylko światło o określonej długości fali uczestniczy w zamianie energii

ś

wietlnej na energię swobodną reagujących cząsteczek. Tylko substancje absorbujące światło

o określonej długości fali mogą ulegać przekształceniom fotochemicznym. Układy reakcji

aktywowane przez światło widzialne muszą zawierać barwnik absorbujący to światło. Jeśli światło

jest absorbowane tylko przez jeden składnik układu, to kształt krzywej obrazującej widmo

czynnościowe odpowiada krzywej absorpcji światła wyznaczonej dla tego składnika. Jeśli

w układzie fotochemicznym światło aktywuje kilka składników, to widmo czynnościowe reakcji

jest wynikiem nakładania się na siebie kilku krzywych absorpcji.

Podobnie jak dla prostych reakcji fotochemicznych, również dla reakcji fotobiologicznych można

wyznaczyć widmo czynnościowe i określić receptor promieniowania świetlnego. Podstawowym

receptorem światła aktywnego w procesie fotosyntezy jest barwnik chlorofil, nadający roślinom

zieloną barwę. Absorbuje on światło w zakresie widzialnym, a jego główne pasma pochłaniania

znajdują się w zakresie niebieskiej i czerwonej części widma absorpcji. Istnieje wiele odmian

chlorofilu, oznaczonych kolejnymi literami alfabetu. Różnice strukturalne występujące pomiędzy

poszczególnymi odmianami chlorofilu powodują istnienie pewnych różnic w ich widmach

absorpcyjnych. Wszystkie organizmy fotosyntetyzujące, które produkują tlen, zawierają chlorofil a.

Cząsteczka chlorofilu zbudowana jest z 5-pierścieniowej pochodnej porfiryny, zwanej feoporfiryną,

oraz reszty 20-węglowego alkoholu - fitolu, dołączonej wiązaniem estrowym do reszty kwasu

propionowego, która jest jednym z podstawników IV pierścienia pirolowego feoporfiryny.

Fragmenty czterech połączonych pierścieni pirolowych oraz dodatkowego pierścienia

niepirolowego tworzą układ następujących po sobie kolejno wiązań pojedynczych i podwójnych

(układ wiązań sprzężonych), który charakteryzuje się zdolnością absorpcji promieniowania

ś

wietlnego. Centralne miejsce w pierścieniu porfirynowym zajmuje atom magnezu, połączony

z atomami azotu pierścieni pirolowych. Przyjmuje się, że magnez pełni istotną rolę w agregacji

cząsteczek chlorofilu.

Absorpcja kwantu promieniowania przez cząsteczkę fotoreceptora powoduje, że energia swobodna

tej cząsteczki zwiększa się o porcję energii tego kwantu. To zwiększenie energii swobodnej

1

nazywane jest wzbudzeniem cząsteczki. Związek ten w stanie wzbudzenia jest mniej trwały, łatwiej

wchodzi w reakcje chemiczne, a ponadto zawiera znaczny nadmiar energii swobodnej w stosunku

do związku niewzbudzonego, co zmienia stosunki energetyczne i równowagę reakcji. Jeżeli brak

jest możliwości wykorzystania energii wzbudzenia przez układ, to jest ona uwalniana w postaci

ciepła lub jako wtórne promieniowanie świetlne (fluorescencja - uwalnianie w momencie

naświetlenia lub fosforescencja - uwalnianie przez pewien czas od naświetlenia; w obu tych

przypadkach długość fali światła emitowanego jest większa, niż światła absorbowanego przez

receptor (ponieważ energia kwantu jest mniejsza).

Wykorzystanie energii promieniowania słonecznego w procesie fotosyntezy jest możliwe dzięki

absorpcji światła przez chlorofil. W niektórych sytuacjach fizjologicznych (np. w chloroplastach,

w których łańcuch przenoszenia elektronów jest wysycony) część energii stanu wzbudzenia może

być emitowana w postaci ciepła lub jako czerwone promieniowanie fluorescencyjne. Zgodnie

z regułą Stockesa, maksimum widma emisji przesunięte jest w kierunku fal dłuższych w stosunku

do maksimum absorpcji danego barwnika.

Chlorofile należą do jednych z najmniej stabilnych barwników roślinnych - wysoka temperatura,

ś

wiatło lub działanie rozpuszczalnikami znacząco przyspiesza rozpad cząsteczki; bardzo łatwo

ulegają też rozpadowi pod wpływem kwasów oraz zasad, dając odpowiednio chlorofilidy

(cząsteczki pozbawione fitolu) oraz feofityny (cząsteczki, w których jon magnezu został

wymieniony na dwa jony wodorowe). Jony magnezu w cząsteczce chlorofilu można także łatwo

podstawić jonami innych metali dwuwartościowych, co najczęściej prowadzi do zmiany barwy,

zwiększenia stabilności cząsteczki oraz zmniejszenia jej aktywności biologicznej (zjawisko stresu

ś

rodowiskowego).

Celem ćwiczenia jest określenie swoistej roli magnezu w budowie i funkcjonowaniu chlorofilu.

1. Przygotowanie ekstraktu barwników.

Rozdrobnione liście przenieść do moździerza, dodać 100% acetonu i dobrze rozetrzeć. Przesączyć.

2. Otrzymywanie feofityny.

Do przesączu mieszanego na mieszadle magnetycznym dodać 2N roztworu HCl.

Spektrofotometrycznie określić stężenie otrzymanej feofityny.

C

feo

=22,42⋅A

665

6,81⋅A

653

[

µ

g

ml

] , gdzie:

A

665

, A

653

- wartości absorbancji przy odpowiedniej długości fali

2

C

feo

=22,42⋅0,21 6,81⋅0,127=3,84[

µ

g

ml

] dla rozcieńczenia 10x

stężenie feofityny w otrzymanej próbce: 38,4 [

µ

g

ml

]

3. Otrzymywanie Cu-porfiryn.

Do zlewki z brunatnym roztworem feofityny dodawać kroplami 0,2 M CuSO

4

do ponownego

uzyskania zielonej barwy (podstawienie atomu miedzi w miejsce centrum pierścienia

porfirynowego feofityny). Przesączyć.

4. Rozdział barwników - chromatografia cienkowarstwowa.

Przesącz Cu-porfiryny rozdzielić w rozdzielaczu z dodatkiem benzyny ekstrakcyjnej i wody

destylowanej - pobrać warstwę benzynową, nanieść na płytkę powleczoną żelem krzemionkowym.

Płytkę umieścić w kamerze zawierającej rozwijacz (100 benzyna : 10 izopropanol : 0,25 woda).

Rozwijacz podsiąkając do góry pociąga za sobą poszczególne barwniki w kolejności zależnej od ich

polarności.

5. Wykreślanie widm absorpcyjnych barwników.

Płytkę z rozdzielonymi barwnikami suszyć przez kilka minut z dala od źródeł światła. Pasma

Cu-chlorofilu a oraz Cu-chlorofilu b zdrapać i wsypać do oddzielnych suchych probówek. Do

każdej z nich dodać 100% acetonu. Przesączyć. Klarownych ekstraktów użyć do

spektrofotometrycznego wykreślania krzywych widm absorpcji barwników.

Wnioski:

barwnik

zakres długości

absorbowanej fali [nm]

barwa światła

maksimum dł. fali

absorbowanej przez

chlorofil

*

[nm]

Cu-chlorofil a

370 - 445; 650 - 690

fioletowa; czerwona

405; 665

Cu-chlorofil b

370 - 460; 640 - 680

fioletowoniebieska; czerwona

430; 655

*

odpowiednio: chlorofil a - dla Cu-chlorofilu a oraz chlorofil b - dla Cu-chlorofilu b

3

6. Obserwacja fluorescencji barwników roślinnych.

Trzy ekstrakty otrzymane na różnych etapach eksperymentu:

roztwór A - zielony; przesącz barwników otrzymany pod wpływem ucierania liści

z acetonem (chlorofil) - fluorescencja czerwona

roztwór B - brunatny; otrzymany poprzez działanie 2N roztworem HCl na przesącz

barwników (feofityna) - fluorescencja czerwona

roztwór C - zielony; otrzymany poprzez działanie 0,2 M roztworem CuSO

4

na roztwór

feofityny (Cu-porfiryna) - brak fluorescencji

należy obserwować pod lampą UV. Wyjaśnić obserwowane zjawisko.

Wnioski:

Fluorescencja jest to zjawisko uwalniania energii przez fotoreceptor w przypadku, gdy nie jest

możliwe wykorzystanie jej przez układ. Długość fali światła emitowanego jest większa, niż światła

absorbowanego przez receptor, dlatego - pomimo absorbowania przez chlorofil światła

fioletowoniebieskiego i czerwonego - w przypadku fluorescencji obserwujemy jedynie światło

czerwone. Nie jest możliwe zatem naświetlanie światłem czerwonym i obserwacja światła

4

zielonego. Roztwór Cu-chlorofilu nie wykazuje fluorescencji, ponieważ cząsteczka chlorofilu

z podstawionym atomem miedzi w miejsce atomu magnezu nie jest zdolna do pełnienia funkcji

biologicznej (nie absorbuje energii świetlnej, zatem nie jest w stanie jej emitować).

Literatura

1. Podstawy fizjologii roślin, pod red. Kopcewicz J., Lewak S., Wydawnictwo Naukowe PWN,

Warszawa, 1998

2. Skrypt do ćwiczeń z fizjologii roślin dla studentów III roku biologii

5