1

Temat:

KONTROLA SKUTECZNOŚCI

MYCIA I DEZYNFEKCJI

Szybkie metody kontroli

Szybkie metody kontroli:

Możliwość szybkiego sprawdzenia poprawności

wykonywanej pracy

działa mobilizująco na pracowników

produkcyjnych i wykonujących

zabiegi mycia i dezynfekcji.

Luminometria

Zasada luminometrii:

W każdej żywej komórce oraz materiałach pochodzenia

biologicznego obecny jest adenozynotrifosforan (ATP).

Wzór:

C

10

H

13

N

5

O

13

P

3

Na

3

Masa cząsteczkowa:

573,1 (acid form: 507,2)

Zasada luminometrii:

Zasada luminometrii:

Podczas hydrolizy ATP do ADP i ortofosforanu lub do

AMP i pirofosforanu uwalniana jest pewna ilość energii
swobodnej, którą można zmierzyć jako emisję kwantów
światła.

Zjawisko to nosi nazwę

chemiluminescencji

,

a w przypadku katalizowania jej przez enzym -
bioluminescencji.

2

Zasada luminometrii:

Intensywność wydzielanego światła jest proporcjonalna

do ilości ATP obecnego w środowisku.

ATP + lucyferyna + lucyferaza + Mg

2+

↓

Oksy-lucyferyna + AMP + CO

2

+ światło

Zasada luminometrii:

Obecność ATP wskazuje na istnienie zanieczyszczeń

organicznych na badanej powierzchni.

Pomiar ATP informuje o ilości obecnego materiału

biologicznego poprzez liczbową wartość tzw.
umownych jednostek luminescencyjnych (RLU).

Luminometria:

Zawartość ATP w materiale organicznym jest różna:

1 gram mięsa

lub soku pomarańczowego

10

-7

g

1 gram mleka

10

-9

g

1 gram lodów lub piwa

10

-8

g

1 komórka bakteryjna

10

-16

- 10

-18

g

1 komórka drożdży

10

-12

g

Luminometria:

Typowe wartości krytyczne (progowe) określane są

indywidualnie dla danego zakładu
i poszczególnych miejsc pomiarowych.

Luminometria:

Przykłady wartości krytycznych [RLU]:

Wartość

bez zastrzeżeń

Wartość

do zaakceptowania

Mleko

< 100

< 250 - 300

Mięso,
ryby

< 300

< 1 000

Warzywa,
owoce

< 500

< 1 500

Luminometria:

Luminometr HY-

LiTE® (firmy MERCK)

Urządzenie
do szybkiej kontroli
warunków higienicznych,
do kontrolowania
powierzchni i popłuczyn.

3

Luminometria:

Luminometr HY-

LiTE® (firmy MERCK)

Obsługa aparatu i wykonanie
testu nie wymagają
specjalistycznej wiedzy
i są na tyle proste, że nawet
pracownik wykonujący zabiegi
mycia i dezynfekcji może sam
sprawdzić skuteczność
wykonywanych czynności.
Wyniki są powtarzalne
i łatwe do interpretacji.

Luminometria:

Luminometr Uni-Lite (np. firmy NOACK POLEN):

Jest to przenośne urządzenie służące do badania

skuteczności mycia i dezynfekcji urządzeń
i linii technologicznych.

Luminometria:

Luminometr Uni-Lite:

Pozwala na jednoznaczne potwierdzenie skuteczności

mycia i dezynfekcji, a tym samym na natychmiastowe

podjęcie decyzji, co do kontynuowania produkcji.

Luminometria:

Luminometr Uni-Lite:

Aparat cechuje prostota obsługi, dokładność

i precyzja pomiaru oraz możliwość dokumentowania

wyników badań.

Luminometria:

Luminometr LUM-T:

(oferta firmy Bentley)

novaLUM:

Luminometria:

„pióra” do luminometrów:

4

Luminometria:

Zalety bioluminescencji:



szybkość pomiaru od kilku do kilkudziesięciu sekund,



wykonanie analizy poza laboratorium, prawie

w każdych warunkach (aparatu są małe, przenośne),



dostępność gotowych zestawów,



poręczne narzędzie monitoringu w ramach systemu
HACCP -

bezpośrednia interpretacja wartości w danych

punkcie pomiaru.

Luminometria:

Wady bioluminescencji:



Jest testem niespecyficznym, tzn. nie rozróżnia

rodzajów materiału biologicznego



Wykorzystanie metody do oznaczania zawartości ATP

mikrobiologicznego w żywności wymaga

przygotowania próbki, tzn. usunięcia z niej ATP

komórek eukariotycznych, które zawierają nawet do

tysiąca razy więcej ATP niż komórki prokariotyczne

Luminometria:

Wady bioluminescencji:

Uwaga !!!
W około 5% przypadków oznaczeń, przy niskich

odczytach poziomu ATP, w porównywalnych

posiewach metodą płytkową wyrasta stosunkowo duża
liczba kolonii.

Może to być to spowodowane obecnością na badanej

powierzchni przetrwalników lub spor, które nie

zawierają ATP i w związku z tym dają wynik negatywny
w luminometrze.

Luminometria:

Zależność między wynikami metody płytkowej [j.t.k./cm

3

]

i Xcel [Relative Light Units],

wykonane w wodzie chłodzącej.

Luminometria:

Zastosowanie bioluminescencji w praktyce:



kontrola czystości powierzchni produkcyjnych,

urządzeń i rąk pracowników



ocena skuteczności przeprowadzanych procesów

mycia -

o skuteczności mycia decyduje nie tylko brak

bakterii, ale także brak pozostałości materiału
biologicznego



badanie mrożonej żywności, soków i napojów



badanie wody pitnej

Luminometria:

Zastosowanie bioluminescencji w praktyce:



ocena procesów fermentacyjnych (browarnictwo,

przemysł spirytusowy, mleczarski)



kontrola skuteczności środków myjących

i dezynfekujących



przeprowadzanie szybkiej oceny wzrostu

drobnoustrojów oraz badanie wpływu czynników

chemicznych i fizycznych na dynamikę hamowania

wzrostu drobnoustrojów

5

Luminometria:

Schemat postępowania przy ocenie stanu

higienicznego powierzchni:

Wymaz z badanej powierzchni

↓

Dodatek ekstrahentu

(który powoduje lizę komórek i ułatwia

wydzielenie na zewnątrz ATP)

↓

Dodatek kompleksu lucyferyna-lucyferaza

↓

Odczyt wyniku

Luminometria:

Oparte na luminometrii:



AccuPoint



Biotrace Uni-Lite XCEL



Charm Lum-T / Firefly



BioControl Lightning MVP

Luminometria:

Inne

nowoczesne metody

VERIcleen:

VERIcleen (oferta firmy Bentley Polska):
Szybki test do oceny umycia, czuły na pozostałości

żywności.

VERIcleen:

6

VERIcleen:

Zanieczyszczona

powierzchnia powoduje
zabarwienie paska na
różowo po 10-60s.

VERIcleen:

Jest czuły na obecność

cukru

, ale nie białka.

HY-

RiSE®:

HY-

RiSE® Colour Hygiene Test Strip

(oferta firmy MERCK):

To wskaźnik czystości

powierzchni, wykrywa
resztki żywności.

HY-

RiSE®:

HY-

RiSE® Colour Hygiene Test Strip:

Jest czuły na obecność NAD, NADH, NADP, NADPH.
Jeśli są one obecne, Glukono-DH® przekształca β-D-

glukozę w D-glukonolakton, który potem jest
przemieniany w barwny związek.

HY-

RiSE®:

HY-

RiSE® - procedura:

1. otwarcie opakowania z paskiem

2. dodanie Reagentu A

na pasek

HY-

RiSE®:

HY-

RiSE® - procedura:

3. pobranie próbki z gładkiej powierzchni

o długości ok. 10 cm lub z 10 miejsc powierzchni
szorstkiej

7

HY-

RiSE®:

HY-

RiSE® - procedura:

4. w przypadku próbki popłuczyn nie trzeba stosować

Reagentu A

5. dodać po 1 kropli Reagentów B i C

HY-

RiSE®:

HY-

RiSE® - procedura:

6. włożyć pasek testu z powrotem do foliowego

opakowania, pozostawić na 4-5 minuty
w ciemności w temperaturze od +15°C
do +30

°C od chwili dodania Reagentu C.

Wynik:

barwa żółta - czysto!

Inne testy oparte na wykrywaniu cukrów prostych:



Pro-

Tect (cukry redukujące)



Spot check (glukoza)



Spot check+ (glukoza / laktoza)

Inne testy oparte na wykrywaniu białek:



Pro-Tect (Biotrace)



Flash (BioControl)

Testy oparte na reakcjach immunologicznych.
Dwa rodzaje testów:



SANDWICH ELISA



COMPETITIVE ELISA

ELISA

1.

Reakcja
immunologiczna

2.

Reakcja
enzymatyczna

SANDWICH ELISA

8

1. Reakcja immunologiczna

2. Reakcja

enzymatyczna

COMPETITIVE ELISA

Testy ELISA wykrywające patogeny lub ich metabolity:

Listeria

Campylobacter

E. coli O157:H7

Salmonella

Legionella

enterotoksyczny B. cereus

werotoksyny

Testy ELISA

Testy ELISA wykrywające Listeria:

wynik po 30 minutach

Testy ELISA

testy oparte na wykrywaniu substancji hamujących

(mięso, miód, mleko):

Podobne testy

testy oparte na wykrywaniu alergenów:

Podobne testy



ATP

– szybki wynik, ogólna informacja



Testy na cukry /

białka - 10 minut, bardziej specyficzne



Testy na alergeny - 10-60 minut, bardziej specyficzne,
dotyczą wybranych białek



Posiewy agarowe - 24-72 godzin, bardziej specyficzne,
dotyczą wybranych mikroorganizmów

Porównanie metod:

9

Jest to stosunkowo szybka (25 -

30 minut) i czuła metoda

stosowana do określania liczby drobnoustrojów:
bakterii, pleśni i drożdży, zarówno żywych jak
i martwych.

Bezpośrednia
epifluorescencja (DEFT)

Jest od dawna stosowana do badania mleka surowego

(aparat BACTOSCAN).

Wykorzystuje się w niej liczenie komórek za pomocą

mikroskopu.

Bezpośrednia
epifluorescencja (DEFT)

Schemat badania:

trawienie trypsyną

filtracja przez filtr membranowy poliwęglanowy
i barwienie oranżem akrydynowym (ten fluorescencyjny
barwnik ma silne powinowactwo do jąder
komórkowych mikroorganizmów, tworzenie
kompleksów z DNA i RNA)

uzyskanie zabarwienia -

żywe

komórki fluoryzują

pomarańczowo do czerwonego,

martwe

- zielono

badanie powierzchni filtra pod mikroskopem

fluorescencyjnym

Bezpośrednia
epifluorescencja (

DEFT

)

Oparta jest na barwieniu

przyżyciowym

komórek

drobnoustrojów z wykorzystaniem chlorku 2-p-
jodofenylo-5-fenylo-tetrazolu (INT) i oznaczeniu jego
zawartości na podstawie powstania czarno-fioletowych
kryształów formazanu wewnątrz komórek aktywnych
metabolicznie.

Do przeprowadzenia badań jest wymagany barwnik INT,

mikroskop oraz aparatura do przeprowadzenia filtracji
membranowej.

Czas testu wynosi około 15 minut.

Bezpośrednie barwienie
komórek za pomocą

INT

Zawierają oligonukleotydy odpowiadające tysiącom

genów

Biochipy
(chipy DNA, sondy DNA)

Zasada metody z zastosowaniem sondy DNA polega

na wykorzystaniu jej właściwości do przyłączania się
do komplementarnych fragmentów DNA występujących
w komórkach drobnoustrojów.

Wystarczy znaleźć specyficzną dla danego

mikroorganizmu sekwencję nukleotydów
i otrzymać komplementarną sondę.

Biochipy
(chipy DNA, sondy DNA)

10

Budowa:

Biochipy
(chipy DNA, sondy DNA)

metoda o bardzo dużej dokładności i czułości.

metoda bardzo specyficzna, gdyż obecność

drobnoustrojów oznaczana jest na podstawie ich cech
genotypowych, co decyduje o dużej wybiórczości testu

Średnica pojedynczej sondy DNA nie przekracza 200

mikronów, zaś na 1 cm

2

płytki może znajdować się

ponad 10 tysięcy sond.

Biochipy
(chipy DNA, sondy DNA)

Trwają prace nad zastosowaniem w toksykologii i badaniu

jakości mikrobiologicznej wody.

To ostatnie zastosowanie ma za zadanie wykrywać

jednocześnie i z niezwykłą czułością wszystkie
spodziewane drobnoustroje chorobotwórcze podczas
jednego badania próbki wody.

Pozwoli to na oszczędność czasu i skrócenie procedury

badawczej z 4 dni do około 4 godzin. Byłaby to
jednocześnie analiza jakościowa i ilościowa skażeń
mikrobiologicznych wody.

Biochipy
(chipy DNA, sondy DNA)

Biochipy
(chipy DNA, sondy DNA)

Biochipy
(chipy DNA, sondy DNA)

Biochipy
(chipy DNA, sondy DNA)

11

Biochipy
(chipy DNA, sondy DNA)

biochipy:

NUTRIChip:

badanie mikroflory, białek

GMOChip:

badanie GMO

Biochipy
(chipy DNA, sondy DNA)

http://www.gene-chips.com/

Skuteczność dezynfekcji

Interpretacja wyników

Skuteczność dezynfekcji:



Prawidłowo wykonana dezynfekcja powoduje redukcję

liczby drobnoustrojów o 5 cykli logarytmicznych.



Dla porównania - prawidłowy proces mycia zmniejsza

liczbę drobnoustrojów o ok. 3 cykle logarytmiczne
(np. z poziomu 10

6

do wartości 10

3

j.t.k.).

Skuteczność dezynfekcji:

Po dezynfekcji nie może być drobnoustrojów

chorobotwórczych !

Skuteczność dezynfekcji:

Przy badaniu skuteczności dezynfekcji badanie

powierzchni przeprowadza się przed i po zabiegu
dezynfekcji:

A -

liczba drobnoustrojów na badanej powierzchni przed

procesem dezynfekcji

B -

liczba drobnoustrojów na badanej powierzchni po

procesie dezynfekcji

12

Skuteczność dezynfekcji:

Zadowalająca czystość mikrobiologiczna powierzchni

metodą szablonową:



brak bakterii Enterobacteriaceae



liczba drobnoustrojów ogółem

< 50 j.t.k. na 1 cm

2

powierzchni

Skuteczność dezynfekcji:

Zadowalająca czystość mikrobiologiczna opakowań

metodą popłuczyn:



brak bakterii Enterobacteriaceae
w 1 cm

3

popłuczyn

Kontrola czystości

rąk pracowników

Kontrola czystości rąk
pracowników:



metody mikrobiologiczne tradycyjne:
posiewy z popłuczyn, metody odciskowe



pomiar ATP

Kontrola czystości rąk
pracowników:

Kontrola czystości rąk
pracowników:



zmywka jałowym tamponem wewnętrznej powierzchni

dłoni (między palcami także) -

osobno

każdą rękę

kontrolowanego pracownika



wypłukanie obydwu tamponów w 25 cm

3

rozcieńczalnika mikrobiologicznego (np. płynu Ringera)



posiew popłuczyn do pożywek dla drobnoustrojów

ogółem i Enterobacteriaceae



po inkubacji płytek, liczbę mikroflory przeliczyć na 25

cm

3

rozcieńczalnika

13

Nowe regulacje prawne:



rozporządzenie UE nr 852/2004



rozporządzenie UE nr 853/2004

Oba obowiązują od 1 stycznia 2006 roku !!!



ustawa o bezpieczeństwie żywności i żywienia

Inne testy:

Inne testy

ułatwiające kontrolę

w zakładzie

Kontrola fosfatazy:

A Charm Lite Series Test (oferta firmy Bentley):

THE CHEF (Cooking Heat EFficiency)

- kontrola

skuteczności ugotowania mięsa oraz reinfekcji opiera
się na ocenie aktywności enzymu fosfatazy,
powszechnie występującego w tkankach mięsnych,
drobiowych, rybnych, owoców morza.

Fosfataza jest aktywna w mięsie surowym lub poddanym

obróbce termicznej nie przekraczającej 63-75°C,
lub w mięsie zanieczyszczonym po prawidłowo
wykonanej obróbce termicznej.

Kontrola fosfatazy:

Końcówka pióra

CHEF

Test

zawiera tamponik, którym

pobiera się badaną próbkę.

Po pobraniu wymazu,

końcówka jest zanurzana w
mieszaninie przygotowanych
reagentów zaś po 3-4 minutach
następuje odczyt wyniku.

Kontrola fosfatazy:

CHEF Test

wykorzystuje zjawisko

luminescencji substratu, który
emituje kwant światła po reakcji
katalizowanej przez aktywną
fosfatazę.

Luminescencja jest mierzona na

podobnej zasadzie jak przy
pomiarze ATP.

Kontrola fosfatazy:

Tempo termicznej inaktywacji fosfatazy

jest silnie skorelowane z termicznym niszczeniem
bakterii E. coli.

14

Kontrola fosfatazy:

99% obniżenie aktywności fosfatazy może oznaczać

redukcję liczby E. coli o 6 cykli log w danej
temperaturze.

Kontrola fosfatazy:

CHEF Test

wykrywa obecność

poniżej 0.01% surowej tkanki
mięsnej w próbce gotowanego
produktu.

Z tego powodu, monitoring

aktywności fosfatazy może być
stosowany w HACCP.

Aktywność katalazy:

Może być skutecznie stosowany do kontroli procesów

technologicznych, w których wykorzystywany jest

system HACCP i gdzie zagrożeniem są drobnoustroje
katalazo-dodatnie.

Test ten od dawna służy do oceny skuteczności

blanszowania warzyw. Użyteczny jest także do

ujawniania początkowych, nieznacznych zakażeń

mikrobiologicznych (głównie w mleczarstwie - do

wykrywania w mleku surowym drobnoustrojów i

leukocytów).

Wskaźniki laboratoryjne:

Sterikon® plus Bioindicator (firmy MERCK):

Test umożliwiający kontrolę biologiczną

procesu sterylizacji parowej
w autoklawie.

Fiolki testu zawierają zawiesinę

przetrwalników Bacillus stearothermophilus.

Sterile = red-violet

(no growth)

Non-sterile =

yellow, turbid

(growth)

Wskaźniki laboratoryjne:

Taśmy do kontroli sterylizacji (firmy MERCK):

Są to samoprzylepne taśmy służące do kontroli

sterylizacji.

Zawierają termoczuły barwnik, który w temperaturze

121

o

C i 134

o

C zmienia kolor z białawego na brązowy.