Ćwiczenie 07

MUTACJE I MUTAGENEZA.
Mutageny takie jak NTG (nitrozoguanidyna), 5-BUdR (5-bromodezoksyurydyna), HA (hydroksylamina) czy OA (oranż akrydyny) mają znany
mechanizm działania na bakterie, co jest wykorzystywane do odczytywania typu molekularnych zmian w genomach organizmów. W prostym teście
z użyciem krążków bibuły nasączonych mutagenem i naniesionych na płytkę z hodowlą bakteryjną można oznaczyć rodzaj mutacji pierwotnej, jak też
własności mutagenne badanych związków chemicznych.
Dołączone materiały:

1. Test Ames’a jako standardowy test biologiczny służący do badania nowych związków chemicznych pod względem ich własności mutagennych

(rys. 1, 2).

2. Podział mutacji genowych ze względu na charakter zmian wywoływanych w DNA (rys. 3).
3. Sposób działania mutagenów chemicznych i fizycznych (tab. 1).
4. Skutki mutacji punktowych na poziomie DNA, mRNA i białka (rys. 4).

Materiały:

1. auksotroficzne szczepy E. coli na skosach lub płytkach;
2. probówki z płynem fizjologicznym (1ml);
3. płytki z podłożem minimalnym M9
4. wodne roztwory mutagenów: 0,2% 5-BUdR, 2% NTG, 10% HA, 0,5% HA;
5. jałowe krążki bibuły;
6. pipety automatyczne, tipy;
7. pincety;
8. głaszczki.

Wykonanie:

1. Płytki opisać nazwą wysiewanych bakterii oraz podzielić na 4 sektory wg schematu:

2. Ze skosów (lub płytek) pobrać uszko ezy materiału i zawiesić w płynie fizjologicznym.
3. Wetrzeć głaszczką po 100 µl zawiesiny każdego ze szczepów na odrębną płytkę.
4. Ułożyć w sektorach jałowe krążki bibuły.
5. Nakroplić na krążki po 5 µl odpowiednich mutagenów.
6. Płytki inkubować co najmniej 48h w 37 °C.

Zadania:

1. Wyniki mutagennego działania badanych substancji na poszczególne szczepy bakteryjne przedstawić w postaci tabeli, oznaczając jako „+”

wzrost bakterii w sąsiedztwie badanego mutagenu.

2. Określić naturę zmian molekularnych, które mógł wywołać dany mutagen.

TEST AMES'A

We współczesnym świecie liczba związków chemicznych znajdujących się w powszechnym użyciu jest niezwykle długa. Według szacunków jest
wśród nich około 1500 substancji aktywnych stosowanych w pestycydach, 6000 substancji aktywnych znajdujących się w lekach, 3000 konserwantów
stosowanych w produktach spożywczych, 2500 substancji o wartościach odżywczych i jeszcze około 50000 innych związków znajdujących się
w codziennym użyciu. Niektóre z tych związków chemicznych mogą akumulować się w organizmie przez lata a następnie wywoływać działanie
mutagenne. Ważne jest określenie, które ze stosowanych związków chemicznych, mogą stanowić zagrożenie dla ludzkiego zdrowia lub życia.
Rakotwórczość związków chemicznych można ustalać na podstawie badań epidemiologicznych. Są to jednak badania bardzo długie (trwają latami)
i niezwykle drogie. Inną metodą są testy biologiczne na zwierzętach. Pozwalają na przewidywanie niebezpieczeństwa działania kancerogennego
u ludzi, ale również są czasochłonne, drogie i niejednoznaczne etycznie (kilkaset zwierząt na jedno badanie). Z tych powodów, możliwość
zastosowania szybkich i tanich testów biologicznych opartych na wykorzystaniu drobnoustrojów do wstępnej oceny potencjalnych mutagenów,
stanowi bardzo cenną alternatywę.
Możliwość indukowania mutacji u różnych gatunków zwierząt przez czynniki fizyczne lub chemiczne sugeruje, że ludzie również mogą być wrażliwi
na środowiskowe czynniki mutagenne. Pomimo różnic międzygatunkowych w metabolizmie ksenobiotyków, naprawie DNA i innych procesach
fizjologicznych, które wpływają na częstość indukcji mutacji przez związki chemiczne, uniwersalność DNA jako materiału genetycznego uzasadnia
stosowanie do przewidywania mutagenności badanych związków chemicznych tak różnych systemów badawczych jak bakterie, owady, zwierzęta
doświadczalne i kultury komórek ssaków. Uzyskiwanie zbliżonych wyników w różnych testach pozwala na przewidywanie podobnych skutków
genetycznych w odniesieniu do organizmu człowieka. Ogólna ocena efektu mutagennego polega na wykryciu zmian w materiale genetycznym
wywołanych przez badany związek chemiczny lub czynnik fizyczny. W systemach bakteryjnych wynikiem może być zwiększona liczba kolonii
bakteryjnych powstałych na skutek rewersji mutacji w szczepach zmutowanych, nie mogących tworzyć kolonii bez zewnętrznego źródła niezbędnego
składnika, jakim może być np. aminokwas, taki jak np.: histydyna lub tryptofan. Zmiana barwy powstałych kolonii może również być wynikiem
świadczącym o indukcji mutacji przez badany czynnik (test na aktywność ß-galaktozydazy).
Istnieje wiele odmian testów badających częstość pojawiania się mutacji w DNA bakterii. Najczęściej stosowanym jest test Ames'a. Test ten jest
wykorzystywany przez wiele laboratoriów i służy wykrywaniu mutacji powrotnych u bakterii Salmonella typhimurium. Otrzymane wyniki posłużyły
do utworzenia licznych baz danych dotyczących właściwości mutagennych wielu związków chemicznych. Oprócz testu rewersji mutacji w histydyno-
zależnych szczepach Salmonella, naukowcy opracowali inne szczepy bakteryjne, w których poprzez rewersję mutacji można oceniać mutagenny
wpływ substancji chemicznych. Test na rewersję mutacji w systemie Escherichia coli lacZ został opracowany w 1990 roku. Jest on alternatywą dla
testu Ames'a. Do oceny mutagenności zostały wykorzystane szczepy E. coli lacZ-. Bakterie z allelem lacZ- kodują nieaktywną formę ß-galoktozydazy.
W obecności laktozy jako źródła węgla, bakterie te wymagają do wzrostu aktywnej formy tego enzymu, który hydrolizuje laktozę do glukozy
i galaktozy. Rewersja do formy lacZ+ pozwala na wzrost szczepów na podłożu zawierającym laktozę. Innym testem używanym w ocenie
mutagenności substancji, jest test rewersji mutacji w systemie E. coli WP2. Procedura jest taka sama jak w teście Ames'a z tym, że wzrost bakterii
wymaga tryptofanu a nie histydyny, ponieważ E. coli WP2 nie potrafią rosnąć na podłożu nie zawierającym tryptofanu w wyniku mutacji w operonie

tego aminokwasu.
Standardowy test Ames'a oparty jest na wykorzystaniu zdolności do rewersji histydyno–zależnych auksotroficznych mutantów bakterii Salmonella
typhimurium do form prototroficznych, które posiadają zdolność do wzrostu na podłożu minimalnym, pozbawionym czynnika wzrostowego (w tym
przypadku aminokwasu L–histydyny). Skonstruowano wiele szczepów testowych zawierających różne mutacje w operonie biosyntezy histydyny (9
genów – 9 enzymów). Działanie czynnika mutagennego na komórki takiego szczepu może powodować rewersję mutacji dającą w efekcie
przywrócenie funkcjonalnego genu i w konsekwencji, zdolności komórek do wzrostu na podłożu nie zawierającym histydyny.
Szczepy

Salmonella typhimurium

stosowane w

teście Ames'a:

TA 1535 – mutant z substytucją, która powoduje mutację mylną w genie kodującym pierwszy enzym w szlaku syntezy histydyny. Zmutowany enzym
ma prolinę podstawioną w miejscu leucyny w normalnym białku;
TA 100 – ma podobny defekt do szczepu TA 1535, ale wykrywa szerszy zakres mutagenów;
TA 1537 – ma mutację typu przesunięcia ramki odczytu (delecja 1 nukleotydu) w innym genie niż TA 1535;
TA 1538 – ma mutację typu przesunięcia ramki odczytu (insercja 1 nukleotydu) w tym samym genie co szczep TA 1537;
TA 98 – jest podobny do szczepu TA 1538, ale wykrywa szerszy zakres mutagenów;
TA 102 i TA 104 w miejscu zapisu rewersji zawierają mutacje ochre (kodon "stop").
Oprócz opisanych mutacji każdy z tych szczepów ma jeszcze dodatkowe mutacje takie jak:

1. Mutanty nie mają systemów naprawy uszkodzeń typu "reperacji przez wycinanie nukleotydów" – NER, które w dzikich szczepach są

odpowiedzialne za naprawę uszkodzeń DNA powstałych pod wpływem mutagenów. W efekcie, uszkodzenia DNA powstałe pod wpływem
kontaktu z badanym w teście Ames'a mutagenem nie są naprawiane i wszystkie mutacje punktowe są widoczne fenotypowo.

2. Mutanty posiadają defekty w budowie lipopolisacharydu (LPS) co pozwala na łatwiejszą penetrację związków chemicznych do wnętrza

komórki w porównaniu z dzikim szczepem.

Podłoże minimalne używane do testu zawiera śladowe ilości histydyny dodawane tylko do tzw. top-agaru, tworzącego wierzchnią warstwę agaru. Te
śladowe ilości histydyny są konieczne, ponieważ niektóre mutageny działają tylko na replikujące DNA. Kiedy mutanty Ames'a są wysiewane na takie
podłoże, rosną tylko dotąd dokąd nie wyczerpią histydyny (2 – 3 podziały komórkowe trwające ok. w1 godziny) i tworzą ledwie widoczne zmętnienie
w miękkim agarze. W przeciwieństwie do nich rewertanty tworzą duże kolonie, ponieważ ich wzrost nie jest limitowany ilością histydyny w podłożu.
Wiele związków chemicznych występujących w przyrodzie nie jest mutagenna dopóki nie zostanie skonsumowana przez zwierzę (lub człowieka).
Jedną z przyczyn jest fakt, że w wątrobie w procesie detoksykacji niektórych związków chemicznych powstają związki, które są bardzo silnymi
mutagenami. Z tego powodu wiele związków badanych w teście Ames'a powinno być rutynowo inkubowanych z wyciągiem z wątroby szczura
(frakcja S9) w środowisku tlenowym, aby oksygenazy wątroby "aktywowały" badany związek. Dopiero zaktywowany związek powinien być
stosowany do testu na bakteriach.
W ocenie mutagenności związków za pomocą testu Ames'a przyjmuje się, że mutagenem jest każdy związek, który indukuje powstanie
dwukrotnie większej liczby mutantów (rewertantów) w stosunku do liczby mutantów spontanicznych.

RYS. 1. Schemat standardowego testu Amesa

RYS. 2. Skrócona instrukcja wykonania mikropłytkowego testu Ames MPF Fluctuation Assay.

RYS. 3. Podział mutacji genowych ze względu na charakter zmian wywoływanych w DNA

RYS. 4. Skutki mutacji na poziomie DNA, RNA i białka

Ćwiczenie 08

BIOCHEMICZNA CHARAKTERYSTYKA MUTANTÓW.
Mutacje w genach strukturalnych mogą powodować zahamowanie syntezy aminokwasów. Ustalenie miejsca bloku metabolicznego w syntezie
aminokwasu, np. tryptofanu, jest możliwe dzięki testom biochemicznym, testowi krzyżowego żywienia i wzrostu na metabolitach pośrednich.
Dołączone materiały:

1. Budowa operonu tryptofanowego u Escherichia coli (rys.1).
2. Rola komórkowego stężenia tryptofanu w regulacji ekspresji operonu tryptofanowego (rys. 2, 3).
3. Atenuacja jako dodatkowy mechanizm kontroli transkrypcji genów operonu tryptofanowego (rys. 4).

Materiały:

•

tryptofanozależne szczepy S. typhimurium trpA, trpB, trpC i trpD;

•

płytki z podłożem minimalnym M9 oraz M9 uzupełnionym:

•

zaszyfrowane zawiesiny szczepów S. typhimurium trpA, trpB, trpC i trpD.

I) Test krzyżowego żywienia:

Plan doświadczenia:
Cztery różne mutanty S. typhimurium nie syntetyzujące tryptofanu wysiać na podłoże minimalne w bliskiej odległości od siebie. Gromadzący się
metabolit pośredni mutanta w dalszych etapach szlaku biosyntezy będzie odżywiał sąsiadujące defektywne szczepy bakterii niezdolne
do przeprowadzenia wcześniejszych etapów tego szlaku.
Wykonanie:

1. Posiać liniowo wszystkie mutanty trp- na 4 płytki z podłożem M9, umieszczając każdorazowo inny szczep prostopadle do pozostałych trzech

w odległości ok. 3 mm (schematy wysiewu poniżej).

2. Inkubować płytki 48 h w 37°C.

Opracowanie wyników:
Odczytać wyniki i umieścić w tabeli zaznaczając "+" wzrost bakterii w sąsiedztwie innego szczepu.

II) Test wzrostu na metabolitach pośrednich:

Plan doświadczenia:
Mutanty defektywne w biosyntezie tryptofanu wysiać na podłoże minimalne uzupełnione metabolitem pośrednim w syntezie tego aminokwasu.
Wykonanie:

1. Wysiać mutanty trp- na płytki, podzielone na 4 sektory, z podłożem M9 oraz M9 uzupełnionym kwasem antranilowym, indolem lub

tryptofanem.

2. Inkubować płytki 48 h w 37°C.

Opracowanie wyników:
Wyniki dla poszczególnych mutantów trp- przedstawić w postaci tabeli:

Zadania:
Na podstawie obu testów ustalić kolejność bloków metabolicznych u mutantów S. typhimurium trpA, trpB, trpC i trpD, a wyniki wpisać
do uproszczonego szlaku biosyntezy tryptofanu:

rys. 1. Operon tryptofanowy u E. coli

rys. 2. Represja operonu tryptofanowego. Źródło: R. F. Weaver, 1999

rys. 3. Derepresja operonu tryptofanowego. Źródło: R. F. Weaver, 1999

rys. 4. Mechanizm atenuacji w operonie trp. Źródło: R. F. Weaver, 1999

Ćwiczenie 09

Konstytutywna i indukowana synteza β-galaktozydazy. Represja kataboliczna.

β-galaktozydaza jest enzymem katalizującym rozpad laktozy na glukozę i galaktozę, które są bezpośrednio wykorzystywane w glikolizie. Enzym ten
jest syntetyzowany indukcyjnie, gdy w podłożu znajduje się laktoza. Indukcja genów operonu lac może być również spowodowana syntetycznymi β-
galaktozydami, np.: izopropylotiogalaktozydem (IPTG), czy tiometylogalaktozydem (TMG). Substratem dla β-galaktozydazy w reakcji barwnej jest o-
nitrofenylogalaktozyd, który jest rozkładany na galaktozę i ortonitrofenol (ONP). ONP nie jest dalej rozkładany przez bakterie i w roztworze
o wysokim pH przybiera żółtą barwę. Intensywność zabarwienia w przeliczeniu na jednostkę czasu określa aktywność β-galaktozydazy.

Dołączone materiały:

1. Budowa operonu laktozowego u Escherichia coli (rys. 1).
2. Negatywna kontrola ekspresji operonu laktozowego (rys. 2, 3).
3. Represja kataboliczna operonu laktozowego (rys. 4).
4. Synteza enzymów operonu lac w merozygotach i

+

/i

-

oraz o

c

/o

+

(rys.5, 6).

Materiały:

1. szczepy bakteryjne:

E. coli lac

+

(i

+

z

+

y

+

)

E. coli lac

-

(i

+

z

-

y

+

)

E. coli lac

-

(i

+

z

+

y

-

)

E. coli lac

+

(i

-

z

+

y

+

)

2. probówki z płynnym podłożem M9 uzupełnionym 0,5% glicerolu
3. 3 ml glukozy (0,1 mol/l)

4. 3 ml laktozy (0,1 mol/l)
5. 3 ml ONPG w stężeniu 4 mg/ml [rozpuścić 0,1 g ONPG w 25 ml buforu Na

3

PO

4

(0,25 mol/l), pH 7,0 zawierającego MgSO

4

(0,001 mol/l),

MnSO

4

(0,0002 mol/l) i β-merkaptoetanol (0,1 mol/l). Lekko ogrzać do rozpuszczenia, ostudzić i przechowywać w lodówce]

6. 10 ml Na

2

CO

3

(1 mol/l)

7. 15 ml buforu Z [Na

2

HPO

4

x 7H

2

O (60 mM), NaH

2

PO

4

x 7H

2

O (40 mM), KCl (10mM), MgSO

4

x 7H

2

O (1 mM), β-merkaptoetanol (50 mM),

pH 7,0]

8. toluen
9. probówki zwykłe i aglutynacyjne, pipety, łaźnie wodne o temperaturze 28°C i 37°C, spektrofotometr.

Wykonanie:
1. Przygotowanie hodowli bakterii:

•

pobrać 5 ml podłoża płynnego M9 z glicerolem do probówki 15 ml;

•

zaszczepić jałowo jednym lub dwoma oczkami ezy danego szczepu bakteryjnego;

•

hodować w temperaturze 37°C z wytrząsaniem przez 18 godzin;

•

dodać 0,05 ml całonocnej hodowli bakterii każdego ze szczepów do trzech probówek z podłożem M9;

•

inkubować z wytrząsaniem 3-4 godziny w 37°C.

2. Indukcja enzymu:

•

probówki zawierające odmłodzone hodowle danego szczepu uzupełnić odpowiednio:
1-0,5 ml H

2

O dest.

2-0,5 ml glukozy
3-0,5 ml laktozy;

•

inkubować z wytrząsaniem 30 minut w temperaturze 37°C.

3. Oznaczanie aktywności enzymu:

•

przygotować 12 probówek aglutynacyjnych (po 3 na każdy szczep) dodając do każdej kroplę toluenu

•

do każdej probówki z toluenem dodać 1 ml odpowiedniej hodowli, wytrząsnąć i wstawić je do łaźni wodnej o temp. 37°C na około 30 minut

•

przenieść probówki do łaźni wodnej o temp. 28°C i dodawać kroplami 0,2 ml ONPG

•

po 15 minutach zatrzymać reakcję przez dodanie 0,5 ml Na

2

CO

3

do wszystkich probówek (zapisać czas trwania reakcji)

•

zmierzyć gęstość optyczną w każdej probówce przy długości fali 420, 550 i 600 nm (probówka nr 1 stanowi kontrolę)

4. Opracowanie wyników:

•

dla każdego szczepu policzyć aktywność β-galaktozydazy ze wzoru:

t- czas trwania reakcji (min)
v- objętość hodowli pobrana do oznaczenia (ml).

1 U β-galaktozydazy = 1 nmol substratu / 1 min. / 1 mg białka

Zadania:
Porównać aktywność β-galaktozydazy w różnych mutantach rosnących na podłożu z laktozą i glukozą.

rys. 1. Model operonu laktozowego u E. coli

rys. 2. Represja operonu laktozowego. Źródło: R. F. Weaver, 1999

rys. 3. Indukcja operonu laktozowego. Źródło: R. F. Weaver, 1999

rys. 5. Indukcyjna synteza enzymów operonu lac w merozygotach i

+

/i

-

rys. 6. Konstytutywna synteza enzymów operonu lac w merozygotach o

c

/o

+

Ćwiczenie 10

Mapa koniugacyjna chromosomu Escherichia coli

Mapowaniem genów nazywamy ustalanie ich kolejności i odległości między nimi. Koniugacja jest jednym ze sposobów mapowania genów
bakteryjnych. Komórki dawcy oznaczone Hfr, zawierające zintegrowany z chromosomem plazmid F (rys. 2), przekazują swój materiał genetyczny
do komórek biorcy (rys. 3, 4). Dzięki przerywaniu koniugacji po określonym czasie można wpłynąć na to jak duża część chromosomu zostanie
pobrana do komórek biorcy (rys. 5). Położenie genów na chromosomie określa się w minutach, a odległości między genami można ustalić
z dokładnością do 1 minuty. Kolejność genów na chromosomie (w stosunku do miejsca integracji) ustala się na podstawie częstości ich przekazywania.
Im bliżej początku transferu (origin of transfer) leży gen, tym wydajniej jest przekazywany do biorcy.

Dołączone materiały:

1. Schematy koniugacji bakteryjnej (rys. 1, 3, 4, 5).
2. Etapy powstawania mutantów Hfr oraz F’ (rys. 2).
3. Kolista mapa genetyczna Escherichia coli (rys. 6).

Plan ćwiczenia:
Po zmieszaniu hodowli dawcy Hfr i biorcy F

-

oraz koniugacji trwającej określony czas, mieszaninę koniugacyjną należy wysiać na odpowiednie

podłoża (selekcja rekombinantów). Nabycie przez biorcę odpowiednich cech fenotypowych świadczy o koniugacyjnym przeniesieniu genów
kodujących te cechy, z dawcy do biorcy. Ilość kolonii na odpowiednich podłożach selekcyjnych świadczy o wydajności procesu, a to z kolei wskazuje
na odległość danego genu od początku transferu.

Materiały:

1. Szczepy:

- E. coli Hfr H str

s

– dawca;

- E. coli Hfr 2 str

s

– dawca;

- E. coli AB1157 F

-

thr

-

leu

-

pro

-

his

-

arg

-

str

r

- biorca.

2. Podłoża do hodowli i selekcji po koniugacji:

- podłoże LB płynne i stałe;
- podłoże M9A stałe: M9 uzupełnione 0,5% glukozy, 250 μg/ml streptomycyny i po 20 μg/ml argininy, proliny i histydyny;
- podłoże M9B stałe: M9 uzupełnione 0,5% glukozy, 250 μg/ml streptomycyny i po 20 μg/ml argininy, treoniny, leucyny i histydyny;
- podłoże M9C stałe: M9 uzupełnione 0,5% glukozy, 250 μg/ml streptomycyny i po 20 μg/ml argininy, treoniny, leucyny i proliny;
- podłoże M9D stałe: M9 uzupełnione 0,5% glukozy, 250 μg/ml streptomycyny i po 20 μg/ml treoniny, leucyny, proliny i histydyny.

3. Probówki i pipety.

Wykonanie:

•

całonocne hodowle dawcy i biorcy w podłożu LB odmłodzić przez 10-krotne rozcieńczenie w świeżym podłożu LB i hodować przez 2 godziny
w 37°C;

•

zmieszać 1 ml hodowli dawcy i 1 ml hodowli biorcy i inkubować w 37°C bez wytrząsania;

•

po 10 minutach inkubacji pobrać 0,1 ml mieszaniny koniugacyjnej, rozcieńczyć 10 razy w podłożu LB, wytrząsnąć energicznie i wysiewać
po 0,1 ml na podłoża selekcyjne:
M9A -selekcja rekombinantów thr

+

leu

+

M9B - selekcja rekombinantów pro

+

M9C - selekcja rekombinantów his

+

M9D - selekcja rekombinantów arg

+

;

Streptomycyna w podłożach selekcyjnych eliminuje dawcę i chroni przed ponownym tworzeniem się par koniugacyjnych na płytkach.

•

wysiewy mieszaniny koniugacyjnej na podłoża selekcyjne powtórzyć po 30 i 60 minutach;

•

płytki inkubować w 37°C przez 48 h;

•

wysiać po 0,1 ml hodowli biorcy i dawcy (przed zmieszaniem) na wszystkie podłoża selekcyjne jako kontrolę powstawania rewertantów.

•

hodowlę dawcy rozcieńczyć 10-4, 10-5 i 10-6 w podłożu LB i wysiać po 0,1 ml na stałe podłoże LB jako kontrolę miana dawcy.

Zadania:

1. Policzyć kolonie na płytkach kontrolnych i selekcyjnych.
2. Wykreślić krzywą zależności ilości rekombinantów danego typu od czasu trwania koniugacji.
3. Określić czas przekazywania badanych genów do biorcy.

4. Ustalić kolejność przekazywania badanych genów przez szczepy dawców E. coli Hfr H i E. coli Hfr 2.

rys. 1

rys. 2

rys. 3

rys. 4

rys. 5

rys. 6

Ćwiczenie 11

Plazmidy bakteryjne

Plazmidy bakteryjne stanowią pozachromosomowy materiał genetyczny bakterii. Warunkują one szereg cech fenotypowych bakterii, jak oporność
na leki, synteza substancji o charakterze antybiotyków (bakteriocyn), toksyn i innych związków. Plazmidy występują w formie kolistych cząsteczek
DNA i różnią się między sobą pod względem wielkości oraz liczby kopii w komórce.

Dołączone materiały:

1. Schematy plazmidów:

•

pUC19 (rys. 1);

•

pGEM (rys. 2);

•

pMPA221 (rys. 3).

Plan doświadczenia:

1. Oznaczyć fenotyp szczepów bakterii Escherichia coli zawierających plazmid z genem oporności na leki (plazmid R).
2. Wyizolować DNA plazmidowe jednego ze szczepów oraz wykonać rozdział elektroforetyczny plazmidów.

Materiały:

1. Szczepy:

- E. coli pUC19
- E. coli pGEM
- E. coli pMPA221
- E. coli DH5α
- E. coli HB101
Podłoże LB stałe, płytki, jałowe krążki z antybiotykami: ampicyliną, gentamycyną, tetracykliną oraz streptomycyną.

2. Bufory:

- bufor TC (Tris–HCl pH=8,0 - 10 mM, EDTA - 1 mM);
- bufor TCG (Tris–HCl pH=8,0 - 25 mM, EDTA - 10 mM, glukoza - 50 mM);
- bufor octanowy (octan potasu 5M – 60 ml, kwas octowy lodowaty – 11,5 ml, H2O – 28,5 ml);
- bufor TBE 10x stężony pH=8,3 (Tris base – 108g, kwas borowy – 55g, Na

2

EDTA x 2 H

2

O – 9,3g, H

2

O do 1000ml);

- bufor obciążający (błękit bromofenolowy – 0,25%, sacharoza – 40%, bufor TC – 1ml).

3. 2M NaOH, 10% SDS, żel krzemionkowy, 70% C

2

H

5

OH, H

2

O + RNAza (1 μl RNAzy o stężeniu 10 μg/ml + 1 ml H

2

O).

4. Sprzęt do elektroforezy, końcówki do pipet, agaroza, roztwór bromku etydyny.

Wykonanie:
1. Oznaczanie oporności na leki.

•

wylać 5 płytek z podłożem LB;

•

z nocnych hodowli szczepów E. coli pUC19, pGEM, pMPA221, HB101 i DH5α pobrać jałowo po 100 μl, nakroplić na oddzielne płytki z LB
i wetrzeć głaszczką;

•

na każdej płytce rozłożyć krążki z czterema różnymi antybiotykami i opisać je na spodzie płytki;

•

inkubować płytki w 37°C przez 24h.

2. Izolacja DNA plazmidowego.

•

1,5 ml nocnej hodowli szczepów E. coli pUC19, pGEM, pMPA221 odwirować przez 5 min przy 12000 obr/min;

•

osad bakterii zawiesić w 100 μl buforu TCG;

•

dodać 200 μl alkalicznego SDS przygotowanego tuż przed dodaniem (patrz tabela poniżej) i wymieszać;

•

dodać 150 μl buforu octanowego i zamieszać – pojawi się biały osad;

•

odwirować osad przez 5 min przy 12000 obr/min;

•

supernatant przenieść do nowych probówek;

•

dodać do supernatantu 0,4 ml zawiesiny żelu krzemionkowego i zamieszać;

•

odwirować krótko (10 s);

•

dwukrotnie przepłukać 70-75 % etanolem, tzn. dodać 1 ml etanolu, zawiesić w nim osad żelu krzemionkowego, krótko odwirować, usunąć
etanol, powtórzyć czynności, a następnie wysuszyć osad;

•

wyeluować DNA, tzn. dodać 25 μl wody z RNAzą, zawiesić żel krzemionkowy, odwirować przez 5 min przy 12000 obr/min i przenieść
supernatant do nowej probówki;

•

przygotować żel agarozowy (0,8 %) do elektroforezy: odważoną agarozę rozpuścić na gorąco w 1x stężonym buforze TBE, wylać do rynienki
z grzebieniem, pozostawić do zastygnięcia, a następnie umieścić gotowy żel w aparacie do elektroforezy i zalać buforem TBE 1x stężonym;

•

przygotować próbki do elektroforezy: do probówki dodać 5 μl próby, 1,5 μl buforu obciążającego oraz 3,5 μl buforu TC, przepipetować w celu
wymieszania składników, ewentualnie odwirować;

•

elektroforeza: 0,5 h, 140 V;

•

żel wybarwić w roztworze bromku etydyny, wypłukać wodą nadmiar barwnika i oglądać pod lampą UV.

Rys.1. Plazmid pUC19 jest powszechnie używanym wektorem klonującym. Podwójna nić kolistej cząsteczki ma długość 2686 par zasad.

pUC19 niesie polilinker zawierający 13 miejsc cięcia dla różnych enzymów restrykcyjnych oraz gen warunkujący odporność na ampicylinę.

Rys. 2. Plazmid pGEM jest powszechnie stosowany do klonowania produktów PCR. W swojej strukturze posiada:

gen warunkujący odporność na antybiotyk ampicylinę Ampr ułatwiający selekcję transformantów, promotor RNA

polimerazy T7, miejsce inicjacji transkrypcji RNA polimerazy T7, promotor RNA polimerazy SP6, gen kodujący β-laktamazę, operator lac.

Rys. 3. Plazmid pMPA221jest pochodną wektora pMP220 i zawiera:

gen warunkujący odporność na antybiotyk tetracyklinę Tcr oraz bezpromotorowy gen lacZ,

przed który wklonowano promotor genu nodA z Rhizobium leguminosarum bv. viciae.

Ćwiczenie 12

Metody wprowadzania DNA do komórek bakteryjnych (transformacja, koniugacja trójrodzicielska, elektroporacja).

Transformacją nazywamy proces pobierania egzogennego DNA przez komórkę biorcy. Zjawisko naturalnej transformacji jest częste w przypadku
bakterii rosnących w strukturze biofilmu, a w regulacji tego procesu znaczącą rolę odgrywa zjawisko wyczuwania liczebności (ang. quorum sensing).
Transformacja u większości bakterii wymaga zastosowania specyficznych metod laboratoryjnych. Jedynie komórki znajdujące się w stanie tzw.
kompetencji są zdolne do pobrania DNA ze środowiska. Niektóre rodzaje bakterii osiągają stan kompetencji spontanicznie np. Bacillus,
Streptococcus, Azotobacter czy Helicobacter, bądź też są w stanie konstytutywnej kompetencji jak Neisseria gonorrhoeae. Bakterie są zdolne
do pobrania każdego DNA, jedynie w przypadku N. gonorrhoeae i H. pylori wymagana jest homologia sekwencji do chromosomowego DNA.
W warunkach laboratoryjnych transformację chemiczną przeprowadza się dodając mieszaninę DNA do zawiesiny komórek uprzednio traktowanych
czynnikami chemicznymi w niskiej temperaturze. Całość poddaje się szokowi termicznemu, a po odpowiednim czasie inkubacji wysiewa na podłoża
selekcyjne. Odmianą transformacji jest elektrotransformacja (elektroporacja) wykorzystywana w przypadku bakterii, które nie uzyskują stanu
kompetencji pod wpływem czynników chemicznych lub gdy wydajność procesu transformacji jest niska. W tej metodzie mieszaninę DNA i bakterii
poddaje się krótkiemu (5 -10 msec) pulsowi prądu elektrycznego o napięciu rzędu 2,5 kV.
Wydajność transformacji w przypadku E. coli zależy od formy DNA: najwyższa dla formy CCC, niższa dla OC a najniższa dla formy liniowej.
Do komórki bakterii wnika najczęściej tylko jedna cząsteczka DNA, o czym warto pamiętać w przypadku przeprowadzania transformacji mieszaniną
różnych cząsteczek DNA.

Koniugacja jest definiowana jako proces przekazywania materiału genetycznego z jednej komórki bakteryjnej do drugiej, wymagający
bezpośredniego kontaktu obu komórek. Transfer koniugacyjny plazmidów jest zaliczany do najistotniejszych procesów HGT (ang. horizontal gene
transfer). Proces koniugacji można podzielić na dwa etapy:

•

przygotowanie DNA plazmidu do transferu koniugacyjnego tzw. funkcje Dtr (ang. DNA transfer and replication)

•

powstanie tzw. „mostu koniugacyjnego” czyli fuzji błon miedzy dawcą

a biorcą u bakterii gramujemnych a w przypadku bakterii gramdodatnich tworzenie agregatów koniugacyjnych, tzw. funkcje Mpf (ang. mating pair
formation).
DNA jest przekazywany jednokierunkowo w postaci jednoniciowego odcinka DNA dawcy o polarności 5’→3’. Powstały na skutek przecięcia nici
wolny koniec 5’ pozostaje przytwierdzony do błony komórkowej w pobliżu połączenia partnerów. Do biorcy wprowadzana jest tylko jedna nić DNA
(ta, która ulega przecięciu), stanowi ona matrycę do syntezy nici komplementarnej, czego efektem jest odtworzenie plazmidu w komórce biorcy.
Wolny koniec 3’-OH stanowi starter do syntezy komplementarnej nici w komórce dawcy wg modelu RC.

Plazmid koniugacyjny (Tra+ Mob-) - plazmid zawierający w obrębie swojej cząsteczki zespół genów warunkujących kompletny proces koniugacji.
Duże rozmiary (kilkadziesiąt kb) plazmidów koniugacyjnych utrudniają ich stosowanie jako wektorów.

Plazmid mobilizowalny (Tra- Mob+) - plazmid pozbawiony genów transferu, ale możliwe jest jego przeniesienie do komórki biorcy w obecności
innego plazmidu koniugacyjnego tzw. plazmidu mobilizującego (syn. plazmid pomocniczy; ang. helper).
Celem ćwiczenia jest wprowadzenie plazmidowego DNA do komórek dwóch gatunków bakterii: E. coli DH5α na drodze transformacji i elektroporacji
R. leguminosarum bv. viciae na drodze koniugacji.

Materiały:
1. Elektroporacja:

•

płynna hodowla E. coli DH5α w podłożu LB (OD

550

= 0,4 – 0,6);

•

podłoże płynne LB, płytki ze stałym podłożem LB z dodatkiem ampicyliny, preparat plazmidowy pGEM, zimna jałowa woda, zimny jałowy
10% glicerol, lód, alkohol skażony do jałowienia;

•

kuwety do elektroporacji, pulser do elektroporacji, wirówka z chłodzeniem, jałowe probówki, ciekły azot, pipety automatyczne, końcówki
do pipet, głaszczka.

2. Transformacja:

•

nocna płynna hodowla E. coli DH5α;

•

2x st. bufor TSS (20% PEG, 100 mM MgCl

2

, 20 ml podłoża LB), DMSO, płynne podłoże LB, płytki ze stałym podłożem LB z dodatkiem

ampicyliny, preparat plazmidowy pUC19, alkohol do jałowienia;

•

szklane gilzy wirówkowe, wirówka z chłodzeniem, jałowe probówki, ciekły azot, lód, pipety automatyczne, końcówki do pipet, głaszczka.

3. Koniugacja trójrodzicielska:

•

hodowla płynna R. leguminosarum bv. viciae (Rifr) w podłożu TY – biorca;

•

hodowla płynna E. coli pMPA221 (Tc

r

) w podłożu LB – dawca;

•

hodowla płynna E. coli pRK2030 (Km

r

) w podłożu LB – helper;

•

płytki ze stałym podłożem 79CA oraz 79CA z dodatkiem rifampicyny i tetracykliny, woda jałowa, alkohol skażony do jałowienia;

•

jałowe probówki, pipety automatyczne, końcówki do pipet, wirówka, głaszczka.

Wykonanie:
1. Elektroporacja:

•

płynną hodowlę E. coli DH5α chłodzić w lodzie przez 30 minut;

•

schłodzone hodowle odwirować (10 minut przy 9 tys. obr/min w temperaturze 4°C);

•

usunąć supernatant przy pomocy pompki wodnej, a następnie zawiesić komórki w zimnej wodzie;

•

komórki odwirować (10 minut przy 9 tys. obr/min w temperaturze 4°C);

•

powtórzyć jeszcze 3 razy płukanie w zimnej wodzie;

•

po usunięciu wody z ostatniego płukania, bakterie zawiesić w 90 μl 10% zimnego, jałowego glicerolu, a probówki umieścić w lodzie;

•

komórki odwirować (10 minut przy 9 tys. obr/min w temperaturze 4°C);

•

odrzucić supernatant i ponownie zawiesić bakterie w 90 μl 10% glicerolu – komórki stają się elektrokompetentne;

•

porcje komórek elektrokompetentnych zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w –70°C.

UWAGA!

Studenci otrzymują przygotowane wcześniej i zamrożone porcje komórek

elektrokompetentnych E. coli DH5α. Wykonują TYLKO elektroporację.

•

porcje komórek elektrokompetentnych umieścić w lodzie na 30 minut;

•

do każdej porcji komórek dodać 5 μl preparatu plazmidowego pGEM;

•

komórki inkubować 30 minut w lodzie;

•

zawiesinę przenieść do schłodzonych w lodzie kuwet 0,1 cm i poddać elektroporacji (2500 V, 100 Ω, 50 μF);

•

kuwety z komórkami po elektroporacji inkubować w lodzie przez 15 minut;

•

komórki zawiesić w 1 ml płynnego podłoża LB i przenieść do nowych probówek;

•

komórki odwirować i usunąć prawie cały supernatant;

•

komórki zawiesić w resztce supernatantu i wysiać 50-100 μl zawiesiny na płytki LB z ampicyliną przy pomocy głaszczki;

•

płytki inkubować przez kilka dni w 28°C aż do pojawienia się pojedynczych koloni.

2. Transformacja:

•

50 ml płynnego podłoża LB zaszczepić przy pomocy 800 μl nocnej hodowli E. coli DH5α;

•

kolbkę z hodowlą inkubować w 37°C z wytrząsaniem do OD

600

=0,3 - 0,4 (około 2 godzin);

•

komórki odwirować w szklanych gilzach przez 5 minut przy 4 tys. obr/min;

•

w międzyczasie przygotować 4 ml buforu TSS 1x stężonego (2x stężony bufor TSS – 2 ml, podłoże płynne LB – 1,8 ml, DMSO – 0,2 ml)
i umieścić go w lodzie;

•

usunąć supernatant, a odwirowane komórki zawiesić w 4 ml schłodzonego buforu TSS 1x stężonego – komórki stają się kompetentne;

•

zawiesinę komórek kompetentnych rozpipetować po 100 μl do nowych probówek (trzymać w lodzie);

•

próbki zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w –70°C.

UWAGA!

Studenci otrzymują przygotowane wcześniej i zamrożone porcje komórek

kompetentnych E. coli DH5α. Wykonują TYLKO transformację.

•

porcje komórek kompetentnych E. coli DH5α umieścić w lodzie na 30 minut;

•

do każdej porcji rozmrożonych komórek dodać 2 μl preparatu plazmidowego pUC19;

•

komórki inkubować w lodzie przez 30 minut;

•

zawiesić komórki w 1 ml płynnego podłoża LB i inkubować 1h w 37°C;

•

zawiesinę komórek odwirować (5 minut, 10 – 12 tys. obr/min);

•

usunąć prawie cały supernatant, a w resztce podłoża zawiesić komórki;

•

50 – 100 μl zawiesiny wysiać na płytki z podłożem LB i ampicyliną przy pomocy głaszczki;

•

płytki inkubować 24h w 37°C.

3. Koniugacja trójrodzicielska:

•

odwirować (5 minut przy 12 tys. obr/min) w osobnych probówkach po 1,5 ml nocnej hodowli R. leguminosarum bv. viciae (biorca), E. coli
pMPA221 (dawca) oraz E. coli pRK2030 (helper);

•

odrzucić supernatant, a osad zawiesić w 1,5 ml płynnego podłoża 79CA i odwirować (5 minut przy 12 tys. obr/min);

•

znowu odrzucić supernatant, a osad zawiesić w 1,5 ml płynnego podłoża 79CA;

•

zmieszać zawiesiny bakteryjne trzech szczepów w nowej probówce w stosunku 1:1:2 (dawca:helper:biorca), po czym nakroplić mieszaninę
na płytkę ze stałym podłożem 79CA;

•

płytki inkubować w 28°C przez 24h.

UWAGA!

Studenci otrzymują płytki z mieszaniną koniugujących szczepów dawcy,

biorcy i szczepu pomocniczego. Wykonują TYLKO selekcję szczepów po koniugacji.

•

na płytkę z mieszaniną bakterii nanieść 2 ml płynnego podłoża 79CA lub jałowej wody i zmyć warstwę bakterii przy pomocy głaszczki;

•

zawiesinę komórek nakroplić w ilości 50 – 100 μl na płytkę ze stałym podłożem 79CA oraz rifampicyną i tetracykliną (selekcja komórek
biorcy, które otrzymały od dawcy plazmid pMPA221 z opornością na tetracyklinę) i wysiać głaszczką;

•

inkubować płytki w 28°C przez 48h.

Ćwiczenie 13

Restrykcja i modyfikacja DNA

Jednym z systemów ochrony DNA bakteryjnego jest system restrykcji i modyfikacji. W jego skład wchodzą endonukleazy restrykcyjne oraz metylazy,
których zadaniem jest ochrona przed wniknięciem obcego DNA do komórki.

Dołączone materiały:

1. Przykłady enzymów restrykcyjnych typu II z uwzględnieniem rozpoznawanej sekwencji i sposobu cięcia DNA (rys. 1, 2).
2. Rozdział elektroforetyczny fragmentów DNA otrzymanych w wyniku cięcia restryktazą (rys. 3).
3. Przykłady zastosowań enzymów restrykcyjnych typu II:

a) RFLP (ang. Restriction Fragments Length Polymorphism – polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych) jako kluczowe narzędzie
w rozpoznawaniu DNA, określaniu obecności różnych alleli u osobników (rys. 4);
b) klonowanie genów (rys.5).

Plan doświadczenia:
Na przykładzie systemu restrykcji i modyfikacji Escherichia coli typu B i typu K12 wykazać zjawisko restrykcji i modyfikacji, namnażając faga λ
naprzemiennie na tych szczepach bakterii.

Materiały:

•

nocne hodowle szczepów E. coli B i K12 w płynnym LB;

•

podłoże stałe LB, płynne podłoże LB, podłoże LB 0,7% (agar miękki), chloroform, końcówki do pipet, krótkie probówki szklane, pipety
pasterowskie, łaźnia wodna o temperaturze 42°C i 37°C.

Wykonanie:

•

wylać 3 płytki z podłożem LB, a po zastygnięciu podłoża suszyć płytki przez 30 minut w suszarce;

•

rozpuścić 0,7% agar na łaźni wodnej i rozlać po 3 ml do krótkich probówek;

•

pozostawić probówki z agarem w łaźni wodnej w temperaturze 42°C, aby nie dopuścić do jego zestalenia;

•

zrobić rozcieńczenia faga λ 10

-2

, 10

-4

, 10

-6

w podłożu LB;

•

dodać po 100 μl faga z każdego rozcieńczenia i po 200 μl nocnej hodowli szczepu E. coli B do 3 ml rozpuszczonego agaru miękkiego LB,
a następnie wylać jako drugą warstwę na płytkę z LB;

•

inkubować przez 24h w 37°C;

•

płytkę z rozcieńczeniem faga 10

-2

zalać 3 ml podłoża LB i odstawić na 20 min;

•

po tym czasie zebrać podłoże z fagiem do krótkiej probówki, dodać 0,5 ml chloroformu i wirować 15 min przy 4000 obr/min;

•

zebrać fazę górną do nowej probówki i powtórzyć chloroformowanie;

•

zebrać fazę górną do nowej probówki i dodać 2 krople chloroformu, przechowywać w 4°C;

•

z uzyskanego supernatantu zawierającego cząstki fagowe zrobić szereg rozcieńczeń (10

-2

, 10

-4

, 10

-6

);

•

wylać 6 płytek z podłożem LB, a po zastygnięciu podłoża suszyć płytki przez 30 minut;

•

pobrać po 100 μl faga z każdego rozcieńczenia i dodać do kolejnych probówek z 3 ml rozpuszczonego agaru LB oraz dodać do wszystkich 3
probówek po 200 μl nocnej hodowli szczepu E. coli B;

•

po energicznym zmieszaniu wylać szybko na płytkę z LB tworząc drugą warstwę, nie dopuścić do powstawania grudek zestalonego agaru;

•

podobnie pobrać po 100 μl z rozcieńczeń: 10

-2

, 10

-4

, 10

-6

i dodać do kolejnych probówek z 3 ml rozpuszczonego agaru LB oraz dodać

do każdej z trzech probówek po 200 μl nocnej hodowli szczepu E. coli K12;

•

energicznie zmieszać i szybko wylać na płytkę z LB tworząc drugą warstwę;

•

inkubować płytki w 37°C przez 24h, po tym czasie odczytać wyniki.

Opracowanie wyników:
Policzyć ilość otrzymanych łysinek faga na dwu różnych szczepach bakterii E. coli. Wyjaśnić na czym polega restrykcja DNA, a na czym modyfikacja
zabezpieczająca przed zniszczeniem własnego DNA.

rys. 1

rys. 2

rys. 3

rys. 4

rys. 5