KATEDRA BIOCHEMII
HODOWLE OKRESOWE PODSTAWY
Wydział Biologii i Ochrony
DROBNOUSTROJÓW BIOTECHNOLOGII
Åšrodowiska
l. Wstęp teoretyczny.
Wzrost drobnoustrojów to przyrost ich objętości, masy, a także podział komórek. Jest on
uwarunkowany syntezą materiału komórkowego (białka, kwasy nukleinowe, nukleotydy),
tworzeniem nowych organelli komórkowych a także dobudowywaniem nowych struktur do już
istniejących (ściana komórkowa, błona cytoplazmatyczna). Tempo wzrostu drobnoustrojów jest
uzależnione od składu podłoża hodowlanego oraz od odczynników fizykochemicznych, takich
jak temperatura, pH, potencjał redox. Maksymalny wzrost można osiągnąć tylko wówczas, gdy
składniki podłoża znajdują się w wystarczających ilościach, gdy nie zachodzi limitowanie
wzrostu przez któryś ze składników oraz gdy zapewnione są optymalne warunki pH, temperatury
itp. Mówimy wtedy o warunkach wzrostu ,,nieograniczonego . W hodowli periodycznej
(okresowej) warunki takie mają miejsce tylko w początkowym okresie wzrostu. W następnych
okresach następuje zmniejszenie stężenia składników odżywczych oraz nagromadzenie
produktów metabolizmu tj. kwasów organicznych czy alkoholi, co wpływa na wzrost
drobnoustrojów.
W warunkach hodowli okresowej, gdzie tylko w poczÄ…tkowym okresie ma miejsce wzrost
nieograniczony, wyróżnić możemy charakterystyczne fazy wzrostu: fazę przygotowawczą (lag-
faza), fazę logarytmicznego wzrostu (log-faza), fazę stacjonarną (równowagi) i fazę zamierania
hodowli.
W warunkach wzrostu nieograniczonego, a więc w pierwszej fazie hodowli okresowej,
drobnoustroje dzielą się z jednakową szybkością. Liczba ich wzrasta zgodnie z postępem
geometrycznym: 20, 21, 22, 23.. 2n. Jeśli w jednostce objętości hodowli na początku znajdowało
się N0 komórek, to po n podziałach będzie ich:
N = N0 × 2n
gdzie:
N0 = ilość początkowa komórek (j.t.k) w godzinie t = 0 (t0)
N = ilość komórek (j.t.k) po czasie t1, h
Logarytmując to równanie otrzymamy:
Log N = log N0 + n log 2
Wyliczając z tego równania liczbę podziałów n, otrzymujemy:
log N  log N0
n =
log 2
Wprowadzając pojęcie częstości podziałów v, czyli liczbę podziałów komórek w ciągu czasu t,
możemy zapisać, że:
n log N  log N0
=
v =
t log 2 (t  t0)
gdzie:
t0 - czas w godzinie t = 0, h
t1  czas kolejnego pomiaru, h
Czas niezbędny dla podziału komórki nazywamy wiekiem osobniczym g.
t 1
g = =
n v
1
KATEDRA BIOCHEMII
HODOWLE OKRESOWE PODSTAWY
Wydział Biologii i Ochrony
DROBNOUSTROJÓW BIOTECHNOLOGII
Åšrodowiska
2. Wykonanie.
2A. HODOWLA OKRESOWA
Celem ćwiczenia jest sprawdzenie szybkości rozkładu 2-metylofenolu (2-MF)
w różnych układach hodowlanych przez szczep Acinetobacter sp. w pożywce mineralnej
(g/l: Na2HPO4 × 12H2O, 4; KH2PO4, 0,5; NH4Cl, 0,5; MgSO4 × 7H2O, 0,1; ekstrakt drożdżowy 0,1)
z dodatkiem TMS (ang. Trace Mineral Solution) o skÅ‚adzie: FeSO4 × 7H2O 3,82 g;
CoSO4 × 7H2O 295 mg; MnSO4 × H2O 82 mg; ZnSO4 × 7H2O 141 mg; H3BO3 6 mg;
Na2MoO4 × 2H2O 40 mg; NiSO4 × 7H2O 82 mg; CuSO4 × 5H2O 2,9 mg;
Al2(SO4)3 × 18H2O 148 mg; Na2WO4 × 2H2O 6 mg.
W tym celu należy założyć 4 układy hodowlane o objętości 300 ml, zgodnie z Tabelą I
po jej uprzednim uzupełnieniu:
Tabela I
Objętość Objętość pożywki
Stężenie Objętość Objętość Objętość
pożywki mineralnej użyta do
T, °C 2-MF, 80 mM r-ru TMS, hodowli
mineralnej, uzupełnienia objętości
mM 2-MF, ml ml szczepu, ml
ml hodowli do 300 ml
2,0 0,3 200
30
1,0 0,3 200
2,0 0,3 200
& &
1,0 0,3 200
1. W każdej kolbie określić:
a. gęstość hodowli poprzez pomiar absorbancji przy  = 600 nm
b. stężenie biomasy metodą filtracji
c. wyjściowe stężenie 2-metylofenolu poprzez pomiar metodą z p-nitroaniliną.
2. Wyniki umieścić w Tabeli I.
3. Kolby umieścić na wytrząsarce w temperaturze pokojowej (zmierzyć temperaturę)
lub w 30°C.
4. W odstępach 45-minutowych określać:
a. gęstość hodowli poprzez pomiar absorbancji przy  = 600 nm
b. stężenie 2-MP poprzez oznaczanie metodą z p-nitroaniliną.
5. Wyniki umieszczać na bieżąco w Tabeli I.
6. Na zakończenie prowadzenia hodowli oznaczyć stężenie biomasy metodą filtracji
UWAGA! Zachować sterylne warunki w trakcie pracy!!!
2
KATEDRA BIOCHEMII
HODOWLE OKRESOWE PODSTAWY
Wydział Biologii i Ochrony
DROBNOUSTROJÓW BIOTECHNOLOGII
Åšrodowiska
METODYKA OZNACZEC

Oznaczanie stężenia 2-metylofenolu metodą kolorymetryczną z p-nitroaniliną
1. Pobrać sterylnie 1 ml hodowli i umieścić w probówce typu Eppendorf. Zawartość probówki
wirować przez 5 min przy 12000 rpm w temperaturze 4°C.
2. Do szklanej probówki miarowej wprowadzić 0,5 ml odwirowanej hodowli (supernatant) albo
jej odpowiednie rozcieńczenie, tj. na przykład rozcieńczenie 10-krotne uzyskuje się poprzez
pobranie 50 µl supernatantu i 450 µl wody destylowanej.
3. Dodać 2 ml wody destylowanej.
4. Wprowadzić 0,5 ml zdwuazowanej p-nitroaniliny (otrzymanej poprzez odbarwienie roztworu
p-nitroaniliny o barwie żółtej z użyciem 2% NaNO2)  przygotowywać zawsze na świeżo!!!
5. Dodać 0,25 ml 10% Na2CO3.
6. Wprowadzić 0,5 ml 10% NaOH.
7. Uzupełnić probówkę do objętości 5 ml poprzez wprowadzenie 1,25 ml wody destylowanej.
8. Jednocześnie przygotować próbę ślepą w identyczny sposób, zastępując supernatant
odwirowanej hodowli, wodÄ… destylowanÄ….
9. Po wymieszaniu zmierzyć absorbancję przy  = 550 nm względem próby ślepej.
10. Do przeliczeń stężeń 2-MF stosować równanie krzywej kalibracyjnej A = b * cfenolu, gdzie A to
absorbancja przy  = 550 nm, c2-MF to stężenie 2-metylofenolu w mM, b = współczynnik
kierunkowy krzywej kalibracyjnej.
Wyznaczanie wzrostu bakterii poprzez pomiar absorbancji przy  = 600 nm



Pobrać sterylnie po 1 ml hodowli z każdego układu i zmierzyć absorbancję przy długości
fali  = 600 nm z użyciem spektrofotometru HELIOS wobec próby ślepej, którą stanowi woda
destylowana.
Oznaczanie stężenia biomasy metodą filtracji
Przesączyć 20 ml zawiesiny drobnoustrojów przez uprzednio wysuszony do stałej masy
(s.m.) i zważony filtr membranowy Co-5. Stosować urządzenie do filtracji próżniowej.
Filtr z osadem suszyć w temp. 105°C do staÅ‚ej masy przez 1 godzinÄ™ i ponownie zważyć.
Stężenie biomasy w g/ml obliczyć ze wzoru:
X= (a-b) / V
gdzie:
a - masa filtra z osadem, g
b - masa filtra, g
V - objętość próbki użytej do oznaczenia, ml
X - stężenie biomasy, g/ml
Wyniki umieścić w tabeli III.
3
KATEDRA BIOCHEMII
HODOWLE OKRESOWE PODSTAWY
Wydział Biologii i Ochrony
DROBNOUSTROJÓW BIOTECHNOLOGII
Åšrodowiska
Wyznaczenie krzywej kalibracyjnej do oznaczania stężenia 2-metylofenolu
Krzywą kalibracyjną do oznaczania stężenia 2-metylofenolu wykonać zgodnie z instrukcją
do oznaczania stężenia 2-MF metodą kolorymetryczną z p-nitroaniliną oraz tabelą II. Wyniki
pomiaru absorbancji przy  = 550 nm umieścić w tabeli. Na podstawie uzyskanych wyników
wyznaczyć współczynnik kierunkowy krzywej kalibracyjnej.
Tabela II
V
Stężenie p-nitroanilina 10% 10%
5 mM 2 Woda, Woda, Absorbancja,
L.p. 2-MF, zdwuazowana, Na2CO3, NaOH,
MP, ml ml = 550 nm
mM ml ml ml
ml
1 0,0 0,00 2,50 0,5 0,25 0,5 1,25
2 0,1 0,01 2,49 0,5 0,25 0,5 1,25
3 0,2 0,02 2,48 0,5 0,25 0,5 1,25
4 0,3 0,03 2,47 0,5 0,25 0,5 1,25
5 0,4 0,04 2,46 0,5 0,25 0,5 1,25
6 0,5 0,05 2,45 0,5 0,25 0,5 1,25
7 0,6 0,06 2,44 0,5 0,25 0,5 1,25
8 0,7 0,07 2,43 0,5 0,25 0,5 1,25
9 0,8 0,08 2,42 0,5 0,25 0,5 1,25
10 0,9 0,09 2,41 0,5 0,25 0,5 1,25
11 1,0 0,10 2,4 0,5 0,25 0,5 1,25
Równanie krzywej: & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & .
Tabela III
objętość stężenie
nr masa masa sÄ…czka masa
Hodowla przesÄ…czu, biomasy,
sÄ…czka sÄ…czka, g z bakteriami, g bakterii, g
ml g/ml
2,0
30
1,0
2,0
& &
1,0
4
KATEDRA BIOCHEMII
HODOWLE OKRESOWE PODSTAWY
Wydział Biologii i Ochrony
DROBNOUSTROJÓW BIOTECHNOLOGII
Åšrodowiska
WYTYCZNE DO PRZYGOTOWANIA SPRAWOZDANIA
Z ĆWICZEC
 HODOWLE CI
GA
E I PERIODYCZNE
Sprawozdanie przygotować należy w postaci prezentacji PowerPoint, nie przekraczającej
35 slajdów.
1. Slajd tytułowy: tytuł ćwiczenia, nazwiska i imiona, numery indeksów sprawozdających, grupa
ćwiczeniowa.
2. Cele ćwiczenia.
3. Metodyka pracy i teoretyczne podstawy oznaczeń (z uwzględnieniem krzywej kalibracyjnej
dla kolorymetrycznego oznaczania stężenia substratu aromatycznego).
4. Wyniki należy przedstawić w postaci tabel oraz wykresów. Wykresy powinny mieć opisane
osie, legendę oraz odpowiednią skalę!!! Należy skomentować otrzymane wyniki
i zaproponować wnioski adekwatnie do celów ćwiczenia.
5. Hodowla okresowa:
çÅ‚ Tabele prezentujÄ…ce caÅ‚ość wyników, wartoÅ›ci Å›rednie i odchylenia standardowe
gęstości hodowli i stężenia substratu aromatycznego w czasie;
çÅ‚ Wykresy zmian gÄ™stoÅ›ci hodowli i substratu aromatycznego w czasie dla wartoÅ›ci
uśrednionych dla badanych układów  w tym celu należy wymienić się wynikami z co
najmniej dwoma innymi grupami badawczymi
çÅ‚ Zestawienie na jednym wykresie przyrostów gÄ™stoÅ›ci hodowli w każdym z badanych
układów (w obecności różnych stężeń substratu aromatycznego w danej temperaturze
oraz w obecności tego samego stężenia substratu w różnych temperaturach);
çÅ‚ Porównanie czasu trwania poszczególnych faz wzrostu hodowli w badanych
układach;
çÅ‚ Zestawienie na jednym wykresie zmian stężenia substratu aromatycznego w każdym
z badanych układów (rozkład różnych stężeń substratu aromatycznego w określonej
temperaturze oraz degradacja tego samego stężenia substratu aromatycznego w
różnych temperaturach);
çÅ‚ Wyznaczenie szybkoÅ›ci rozkÅ‚adu substratu aromatycznego w różnych temperaturach;
8. Przedstawienie obliczeń i wyników zadania teoretycznego  Wyznaczanie wzrostu bakterii
metodą płytkową .
9. Przedstawienie obliczeń i wyników zadania teoretycznego  Zakładanie hodowli ciągłej
mikroorganizmów .
10. Samoocena grupy i samoocena poszczególnych studentów w postaci tabeli
z UZASADNIENIEM tej oceny.
5
KATEDRA BIOCHEMII
HODOWLE OKRESOWE PODSTAWY
Wydział Biologii i Ochrony
DROBNOUSTROJÓW BIOTECHNOLOGII
Åšrodowiska
Tabela I
Temperatura: & & .. °C Temperatura: & & .. °C
° °
° °
° °
& & & & & & & & ..mM & & & & & & & & ..mM & & & & & & & & ..mM & & & & & & & & ..mM
Czas,
Pomiar
Rozc. A600 A550 C, mM A600 A550 C, mM A600 A550 C, mM A600 A550 C, mM
00:00
0 :
1 :
2 :
3 :
4 :
5 :
6 :
7 :
8 :
6