A
AC
CUCH TRANSPORTU ELEKTRONÓW W CHLOROPLASTACH
Cele ćwiczenia
a. obserwacja sygnału ERP I w izolowanych chloroplastach oraz w liściach
b. zbadanie powiązań pomiędzy fotosystemami roślin wyższych poprzez
pobudzanie centrów reakcyjnych światłem o różnych długościach fal
c. zbadanie skuteczności inhibitorów działających na różne miejsca łańcucha
transportu elektronów
Zagadnienia do przygotowania
a. skala potencjału oksydo redukcyjnego
b. budowa chloroplastów
c. pojęcie  widma działania
Wprowadzenie
Chloroplasty mogą z łatwością redukować związki o potencjałach sięgających
-0.55 V. Transport elektronów prowadzi do syntezy ATP i do rozkładu wody na tlen
i równoważniki redukcyjne. Sumaryczne równanie ujmujące wszystkie te zjawiska
wygląda następująco:
H20 + AKCEPTOR/-0.55 V/ + ADP + Pi Y 02 + zred. AKCEPTOR + ATP
Równanie to można rozbić na procesy  cząstkowe":
1/2 H20 Y 1/4 O2 + H+ + e- Eo = +0.8 V
ADP + Pi Y ATP Eo = +0.3 V
Z powyższych równań wynika, że do przeprowadzenia wymienionych
procesów potrzeba energii równej co najmniej 1.65 V/e-. Kwant światła czerwonego
dostarcza energii zdolnej teoretycznie przenieść elektron o 1.82 V. Ograniczenia
praktyczne każą założyć jednak co najwyżej 70% wydajność zużycia energii
pochłoniętych kwantów. Z tych oszacowań wynika, że do przeprowadzenia elektronu
przez złożony system transportu elektronów potrzebne są co najmniej dwa fotony.
Bliższe wyjaśnienia dotyczące sposobu wykorzystania energii świetlnej w
pierwszych etapach fotosyntezy pochodzÄ… z pracowni Emersona (USA). Emerson
i Lewis wykryli mianowicie, że fotosynteza staje się stopniowo coraz mniej wydajna,
kiedy oświetlenie roślin jest ograniczone do fal o długościach większych od 680 nm,
mimo że chlorofil wydajnie pochłania fale z tego zakresu (zjawisko to zyskało nazwę
 red drop effect ).
Koncepcja dwóch fotoukładów (skrót angielski PS = photosystem, polski FU
lub FS) przedstawiona na rysunku pozwala dobrze wytłumaczyć to zjawisko, przy
założeniu, że światło dalekiej czerwieni uruchamia jedynie fotoukład I (Rysunek 1).
Spadek wydajności fotosyntezy w doświadczeniach Emersona był spowodowany
brakiem równowagi w wymaganej równej ilości kwantów dostarczanej do obu
fotoukładów, na korzyść FU I. Kolejne zjawisko potwierdzające hipotezę istnienia
dwóch FU to tzw. "efekt wzmocnienia" (enhancement effect). Niska wydajność
kwantowa fotosyntezy przy stosowaniu światła z zakresu dalekiej czerwieni (długości
fal większe od 700 nm) znacznie wzrasta jeśli równocześnie użyć światła
o krótszych falach ( = 650 nm).
Światło czerwone (  = 650 nm) wzbudza FU II, efekt wzmocnienia jest
wynikiem przywrócenia równowagi w ilości kwantów dostarczanej do obu
fotoukładów. Wśród danych doświadczalnych, które doprowadziły do sformułowania
schematu Z (Rysunek 1), na uwagę zasługuje fakt utlenienia składników łańcucha
transportu elektronów (np. cytochromu f, plastochinonów) jako skutek  pompowania
elektronów światłem pochłanianym przez FU I i redukcja tych samych składników
łańcucha transportu elektronów światłem pochłanianym przez FU II.
Składniki łańcucha transportu elektronów
1. Miejsce dostarczania elektronów do FU II (układ rozkładu wody)
Oto niektóre z zaobserwowanych własności centrum P 680:
a. usunięcie jonów chlorkowych silnie obniża wydajność procesów
fotoindukowanego transportu elektronów dla układu z wodą jako
donorem elektronów, nie wpływa natomiast na te procesy przy użyciu
innych donorów elektronów
b. jony manganu odpowiadają za stabilizację jonów OH-. Usunięcie
manganu wyklucza użycie wody jako donora elektronów
c. mutanty roślin niezdolne do syntezy cytochromu b559 są niezdolne do
utleniania wody - reszta łańcucha funkcjonuje normalnie
2. Akceptory elektronów fotoukładu II
Utleniona forma centrum P 680 przekazuje w stanie wzbudzonym elektron do
czÄ…steczki feofityny (chlorofilu pozbawionego atomu Mg) o potencjale E = -
0.6 V. Proces ten jest bardzo szybki.
Następnym etapem jest przekazanie elektronu z feofityny na związany
plastochinon. Dawniej związek ten uważany był za pierwotny akceptor FU II.
Plastochinon zdolny jest do wygaszania fluorescencji fotoukładu II..
Przekazuje on elektron do innego plastochinonu, związanego z białkiem
o ciężarze 32 kD.
3. Plastochinon - jest jedynym ogniwem łańcucha transportu elektronów
obecnym w nadmiarze w stosunku do reszty przenośników elektronów. Fakt
ten tłumaczy niektóre dane kinetyczne związane z przenoszeniem elektronów
między fotoukładami. Pełni rolę "przenośnika" elektronów przez błonę
tylakoidu.
4. Cytochrom f, b6, białka żelazo-siarkowe - cytochrom b6 i białka żelazo-
siarkowe wraz z cytochromem f tworzą kompleks współdziałający z pulą
plastochinonów z jednej strony a plastocyjaniną z drugiej (patrz Rysunek 1).
Kompleks ten oprócz przekazywania elektronów przenosi protony z zewnątrz
tylakoidów do ich stromy.
5. Plastocyjanina - jest białkiem zawierającym jony miedzi. Jej potencjał redoks
wynosi +0.37 V. W liściach jest jej 500-krotnie mniej niż cząsteczek chlorofilu.
6. P 700 - jest to dimer chlorofilu a, absorbujący światło widzialne w zakresie
700 nm. P700 stanowi liczbowo 1/400 całej ilości chlorofilu a obecnego w
liściach. Utlenieniu tej formy chlorofilu towarzyszy zanik absorpcji przy 700
nm. Potencjał redoks P 700 wynosi +0.43 V. Przechodzi on w formę utlenioną
pod wpływem światła oddziałującego na FU I, redukuje się pod wpływem
światła absorbowanego przez FU II.
7. Substancja redukująca ferredoksynę - są dowody pośrednie świadczące
o istnieniu takiego białka. Najprowdobodoniej charakteryzuje się ono
potencjałem redoks o wartości -0.55 V. Niektórzy badacze sugerują istnienie
innych pierwotnych akceptorów FU I.
8. Ferredoksyna - jest białkiem zawierającym połączenia siarki z żelazem.
Posiada niski potencjał redoks (-0.42 V). Jest redukowana przez oświetlone
chloroplasty.
9. Ferredoksyna: NADP+ reduktaza - enzym ten jest flawoproteidem
zawierającym FAD. Uzyskano go w formie oczyszczonej z liści szpinaku.
Enzym jest specyficzny dla ferredoksyny lub NADPH jako donorów
elektronów, mało specyficzny dla akceptorów elektronów (NAD+, cyt. f, PC,
NADP+, żelazicyjanek, DCPIP - wszystkie te związki z powodzeniem
odbierajÄ… elektrony z enzymu).
10. NADP+ - końcowy akceptor elektronów w szlaku fotosyntetycznego łańcucha
transportu elektronów, zapewniający poziomem potencjału redukcyjnego
przekształcenie CO2 w węglowodany na drodze reakcji biochemicznych w
"ciemnym" etapie fotosyntezy.
Specyficzność NADP+ w porównaniu z NAD+ jest zapewniona dzięki
enzymowi - Ferredoksyna: NADP+ reduktaza. Fotoredukcja NADP+
odpowiada kinetycznie zmianom wydajności fotosyntezy w efektach
obserwowanych przez Emersona. Dla zapewnienia maksymalnej szybkości
fotoredukcji NADP+ w układzie doświadczalnym musi być obecna
ferredoksyna i Ferredoksyna: NADP+ reduktaza.
Polecana literatura:
1. L.A. Blumenfeld  Problemy fizyki biologicznej" PWN Warszawa 1978, s. 237-
263
2. "Membrane Biochemistry" pod redakcjÄ…. E.Carafoli, G.Semenza, Springer-
Verlag 1979, strony 144-153
3. F.B. Salisbury, C. Ross "Fizjologia rośln" PWRiL Warszawa 1975, s. 295-314
4. L. Stryer: "Biochemia" PWN Warszawa 1986, s. 462-475
Wykonanie ćwiczenia
Wyposażenie do izolowania chloroplastów:
a. wirówka laboratoryjna
b. homogenizator nożowy
c. gaza
Aparatura
a. spektrometr ERP z wnęką umożliwiająca oświetlanie próbki podczas
pomiarów
b. kiuweta kwarcowa płaskościenna
c. oświetlacz 100 W z uchwytami na filtry - 2 szt.
d. stojak o regulowanej wysokości - 2 szt.
e. filtry interferencyjne: = 700 nm, = 650 nm, = 600 nm
f. filtry neutralne
g. zasłona do zaciemnienia pomieszczenia
h. lampa stołowa lub lampa ciemniowa do oświetlania stanowiska pracy.
i. probówki koniczne
j. pipety automatyczne 5 µl, 0-200 µl, 200-1000 µl + koÅ„cówki.
k. folia aluminiowa lub ciemny papier do owijania probówki z zawiesiną
chloroplastów
l. przesłona do odcinania światła /duży kawałek tektury lub płyty blaszanej/.
Å‚. mikrostrzykawka
m. Å‚az
nia lodowa
n. Å‚az
nia wodna 65 - 70 0
Odczynniki i materiał biologiczny
Roztwory
a. 0.5 M sacharoza, 0.1M KH2PO4, 10 mM EDTA, pH 7.4 = roztwór do
homogenizacji liści
b. 0.4 M sacharoza, 20 mM Tricine-NaOH, 10 mM NaOH, pH 7.8 = bufor do
zawieszania chloroplastów.
c. roztwór DCMU (3-(3',4'-dichlorophenyl-)1,1-dimethylurea) - 2 mM (1 ml)
d. roztwór MV (metylwiologen, ang. methyl viologen) - 2 mM (2 ml)
e. roztwór HgCl2 - 0.1 M (1 ml)
Rośliny (pszenica) powinny być zasiane 10-12 dni przed ćwiczeniami. Część
doświadczeń można wykonać także na całych liściach chińskiej róży (Hibiscus rosa-
chinensis).
Otrzymywanie chloroplastów:
Zebrane liście pszenicy myje się przed homogenizacją zimną wodą i
dokładnie osusza. Dalsze etapy postępowania wykonuje się w temperaturze bliskiej
0oC.
Około 125 g liści homogenizuje się w 250 ml roztworu do homogenizacji przez 30
sekund przy maksymalnych obrotach homogenizatora nożowego. Zielony
homogenat przesącza się przez poczwórną warstwę gazy i wiruje 3 minuty przy 200
g. Supernatant odwirowuje się następnie przez 15 min przy 600g, osad zawiesza się
w 40 ml buforu do zawieszania chloroplastów i ponownie wiruje przy 600 g przez 15
minut. Osad zawiera oczyszczone chloroplasty, które należy zawiesić w 2-5 ml
roztworu do zawieszania chloroplastów.
Kolejne czynności:
1. Rejestracja sygnału P700 w optymalnych warunkach (kontrola)
światło 700 nm + dodany DCMU + dodany MV.
2. Rejestracja sygnału P700 przy pracującym PS II
światło 650 nm lub białe +dodany MV
2a. Do "2" dodać DCMU
3. Rejestracja sygnału P700 przy świetle długofalowym
700 nm, przy dodanym MV ("red drop effect")
4. Rejestracja sygnału P700 przy braku MV (transport cykliczny), =700 nm
4a. Rejestracja sygnału P700 bez dodania MV i przy długości fali 650 - 680 nm -
transport cykliczny przy pracujÄ…cym PS II.
5. Rejestracja sygnału P700 przy braku MV i przy obecności HgCl2
(zablokowany transport cykliczny).
6. Uszkadzanie PS II przy użyciu wysokiej temperatury (3 min. inkubacji próbki
w 65oC) a potem - jak w punkcie 2.
Opracowanie wyników
1. Na podstawie przeprowadzonych eksperymentów zbadać czy ich rezultaty są
zgodne ze schematem Z.
2. Zaproponować miejsca działania użytych w doświadczeniach inhibitorów
transportu elektronów w chloroplastach.