28

BIOLOGICZNE MECHANIZMY OCZYSZCZANIA SKA¯EÑ

ORGANICZNYCH W GLEBIE

Henryk Ko³oczek, Pawe³ Kaszycki

W dobie burzliwego rozwoju ró¿nych ga³êzi przemys³u, w tym

samochodowego i chemicznego oraz rozwoju miast i infrastruktury, dochodzi

czêsto do wzrostu zanieczyszczenia œrodowiska naturalnego ró¿norakimi

szkodliwymi substancjami. Takie obce substancje, niespotykane naturalnie

i zanieczyszczaj¹ce przyrodê nazywamy ksenobiotykami. Istnieje pilna

koniecznoœæ eliminacji ska¿eñ œrodowiskowych, poniewa¿ stanowi¹ ogromne

zagro¿enie dla roœlin, zwierz¹t i ludzi, wywo³uj¹c niejednokrotnie niebezpieczne

choroby i zak³ócenie równowagi biologicznej. W ostatnich latach du¿e znaczenie

w usuwaniu ksenobiotyków ze œrodowiska naturalnego uzyskuj¹ metody

biologiczne, które likwiduj¹ zagro¿enia w sposób ostateczny, a jednoczeœnie nie

wymagaj¹ du¿ych nak³adów finansowych. Rozwój nauki i g³êbsze poznanie

biologicznych mechanizmów zwi¹zanych z unieszkodliwianiem organicznych

odpadów przemys³owych przez ró¿ne drobnoustroje umo¿liwi³y zastosowanie

wyspecjalizowanych bakterii, grzybów i roœlin do walki z odpadami. Procesy

eliminacji lub zmniejszenia toksycznoœci odpadów za pomoc¹ mikroorganizmów

nazywamy bioremediacj¹. Oprócz tej metody, w walce z odpadami znajduj¹

zastosowanie roœliny (fitoremediacja).

Szerokie wykorzystanie metod biologicznych w walce z zanieczyszczeniami

w œrodowisku naturalnym (w wodach, glebach i powietrzu) wi¹¿e siê z wieloma

korzystnymi czynnikami, z których najistotniejsze s¹:

– bezpoœrednia degradacja zanieczyszczenia – ksenobiotyku, a nie jego trans-

fer pomiêdzy ró¿nymi mediami, jak to czêsto siê dzieje w przypadku metod

fizykochemicznych;

– wykorzystanie szlaków i cykli metabolicznych mikroorganizmów

prowadz¹cych do koñcowych produktów przemian ksenobiotyku, tj. do H

2

O

i CO

2

;

– Ÿród³em energii potrzebnej do unieszkodliwienia zanieczyszczeñ s¹ w³aœnie

zanieczyszczenia;

– zastosowanie metody bioremediacji zanieczyszczeñ in situ nie prowadzi do

dewastacji krajobrazu;

– ni¿szy koszt oczyszczania w porównaniu do innych metod.

Z tych w³aœnie przyczyn metody biologiczne, a szczególnie bioremediacja,

ciesz¹ siê du¿¹ popularnoœci¹. Dowodem jest ogromny wzrost nak³adów

poniesionych przez amerykañsk¹ Agencjê Ochrony Œrodowiska (EPA) na badania

29

i wdro¿enie metod bioremediacji na terenie USA. Od po³owy lat osiemdziesi¹tych

ubieg³ego wieku do roku 2000 liczba projektów zwi¹zanych z usuwaniem

zanieczyszczeñ organicznych wzros³a od kilku do kilkuset [http://cfpub.epa.gov].

W ostatnich latach, dziêki zastosowaniu nowoczesnych metod genomiki

i proteomiki, nast¹pi³ dalszy postêp w zrozumieniu mechanizmów biochemicznych

i mikrobiologicznych, prowadz¹cych do degradacji zanieczyszczeñ, i jest to

powodem gwa³townego wzrostu liczby i jakoœci projektów zwi¹zanych

z oczyszczaniem œrodowiska metod¹ bioremediacji. Opublikowany w koñcu lat

dziewiêædziesi¹tych raport EPA przewiduje, ¿e wydatki w USA na oczyszczanie

gleby zawieraj¹cej same tylko chlorowcopochodne zwi¹zków aromatycznych

i alifatycznych (m.in. zanieczyszczenia przemys³u rafineryjnego i chemicznego)

poch³on¹ ok. 45 mld dolarów w nastêpnej dekadzie. Kwota ta ilustruje znaczenie

technologii wykorzystuj¹cych procesy bioremediacji i wyznacza nowe kierunki

prac badawczych i technologicznych w ochronie œrodowiska naturalnego na

nastêpne lata w USA, a poprzez ogromny potencja³ naukowy tego kraju równie¿

na œwiecie. Nale¿y podkreœliæ, ¿e tak¿e w pañstwach Unii Europejskiej nastêpuje

wzrost nak³adów na badania w zakresie bioremediacji ska¿eñ organicznych.

Zastosowanie biologicznych metod oczyszczania gruntów i wód ska¿onych

produktami naftowymi i innymi toksycznymi zwi¹zkami organicznymi,

praktykowane jest z dobrym skutkiem od kilkunastu lat w Polsce. Jednym

z pionierów oczyszczania gruntów zanieczyszczonych odpadami organicznymi

(w tym wyciekami oleju napêdowego) w Polsce jest prof. J. Siuta z Instytutu

Ochrony Œrodowiska w Warszawie, którego grupa zastosowa³a metody

biotechnologiczne likwidacji zanieczyszczeñ ropopochodnych w P³ocku w latach

80. i 90. ubieg³ego wieku [1]. W pierwszej po³owie lat 90. wiele innych oœrodków

naukowych i firm komercyjnych rozwinê³o metody biologiczne likwidacji ska¿eñ

rafineryjnych w glebie i wodach powierzchniowych [1-4].

W naszym kraju najwiêksze zagro¿enie dla œrodowiska naturalnego stanowi¹

ró¿norodne, przewa¿nie ma³e, ale powszechnie wystêpuj¹ce Ÿród³a emisji

zwi¹zków ropopochodnych do ziemi, wód powierzchniowych i kanalizacji.

Górnicza eksploatacja, a tak¿e transport, przerób i dystrybucja ropy i jej

pochodnych, eksploatacja maszyn, mechanizacja rolnictwa i leœnictwa stanowi¹

g³ówne Ÿród³a punktowego i obszarowego zaolejenia ziemi i wód podziemnych [1].

30

1. Wp³yw zanieczyszczeñ przemys³u rafineryjnego na w³aœciwoœci gleby

Ropa naftowa i jej pochodne zmieniaj¹ fizyczne, chemiczne i biologiczne

w³aœciwoœci gleby. Wyró¿nia siê kilka istotnych zaburzeñ, maj¹cych wp³yw na

charakterystykê gleby:

– drastyczna zmiana w iloœci i sk³adzie chemicznym substancji organicznych

gleby,

– obni¿enie pojemnoœci wodnej gleby i utrudnienie wymiany powietrznej na

skutek zape³nienia porów glebowych przy jednoczesnym wzroœcie

zapotrzebowania na tlen,

– zaburzenie stosunku zawartoœci wêgla organicznego do zawartoœci azotu

i fosforu, uniemo¿liwiaj¹cy prawid³owy rozwój ¿ycia biologicznego,

– zaburzenie w³aœciwoœci koloidów glebowych, w tym wymiany jonowej i pH

(g³ównie zakwaszenie gleby).

W g³êbszych warstwach gleby naturalna zawartoœæ zwi¹zków organicznych

jest niska, dlatego nawet niewielkie ³adunki zanieczyszczeñ ropopochodnych

znacz¹co podwy¿szaj¹ stê¿enie substancji organicznej w tych warstwach,

wydatnie pogarszaj¹c warunki wodne i tlenowe. Zaburzona struktura i w³aœciwoœci

gleby prowadz¹ do zahamowania ¿ycia biologicznego, a naturalna rekultywacja

gruntu, w skrajnych przypadkach, mo¿e trwaæ od kilku do kilkuset lat.

Zastosowanie nowoczesnych metod biotechnologicznych, opartych na

wyselekcjonowanych biocenozach, pozwala skróciæ czas rekultywacji do kilku

miesiêcy (por. kolejny artyku³ autorów w niniejszej monografii).

2. Biologiczne mechanizmy remediacji zanieczyszczeñ ropopochodnych

Zwi¹zki wêglowodorowe wystêpuj¹ce w ropie naftowej mo¿na podzieliæ na

cztery grupy: wêglowodory nasycone, aromatyczne, asfalteny (fenole, kwasy

t³uszczowe, ketony, estry i porfiryny) oraz ¿ywice (pirydyny, chinoliny, karbazole,

sulfotlenki, amidy) [5].

Mikroorganizmy wystêpuj¹ce w œrodowisku przyrodniczym posiadaj¹

zdolnoœæ degradacji prawie wszystkich naturalnie wystêpuj¹cych substancji,

aczkolwiek zwi¹zki wêglowodorowe charakteryzuj¹ siê ró¿n¹ podatnoœci¹ na

atak katalityczny drobnoustrojów. Zdolnoœæ do biodegradacji wêglowodorów

mo¿na uporz¹dkowaæ w nastêpuj¹cy malej¹cy sposób: n-alkany > alkany

rozga³êzione > zwi¹zki aromatyczne o niskiej masie cz¹steczkowej > zwi¹zki

aromatyczne wielopierœcieniowe (WWA) [6]. W efekcie, kinetyka biodegradacji

jest najszybsza dla nasyconych alkanów, a najwolniejsza dla WWA. Ekstremalnie

31

woln¹ degradacjê stwierdzono dla polarnych wielopierœcieniowych

chlorowcopochodnych [7]. Jednoczeœnie w ostatnich latach zauwa¿ono, ¿e

nastêpuje szybszy proces degradacji niektórych zwi¹zków organicznych

w obecnoœci innych zanieczyszczeñ. Jest to tzw. efekt ko-metabolizmu, gdzie

mikroorganizmy wykorzystuj¹ jedno zanieczyszczenie jako donor elektronów

w procesie redukcji drugiego [8]. Przyk³ad ten ilustruje ogromn¹ plastycznoœæ

biochemiczn¹ drobnoustrojów w procesach wykorzystania zanieczyszczeñ jako

Ÿród³a wêgla i energii.

Sprawny proces rozk³adu zanieczyszczeñ organicznych zachodzi tylko

w przypadku, gdy istniej¹ sprzyjaj¹ce warunki œrodowiskowe (odpowiednia

wilgotnoϾ, temperatura, pH, obecnoϾ dodatkowych substancji troficznych,

obecnoœæ tlenu w przemianach aerobowych lub odpowiednich donorów

i akceptorów elektronów w warunkach beztlenowych). Proces biodegradacji

czêsto koñczy siê niepowodzeniem, w przypadku gdy stê¿enie odpadów

organicznych jest zbyt du¿e i powoduje toksyfikacjê mikroorganizmów, lub te¿

w przypadku braku odpowiedniego aparatu enzymatycznego, rozk³adaj¹cego

przejœciowe produkty (intermediaty) degradacji. Bardzo czêsto produkty

pierwszych etapów biodegradacji wykazuj¹ o wiele silniejszy efekt toksycznoœci

ni¿ zanieczyszczenie wyjœciowe [9]. Stwarza to koniecznoœæ monitoringu i kontroli

biologicznej dekompozycji zanieczyszczeñ, z mo¿liwoœci¹ mikrobiologicznej

i biochemicznej interwencji, w celu wprowadzenia dodatkowych szczepów

mikroorganizmów o po¿¹danej aktywnoœci biologicznej.

Powy¿sze fakty dowodz¹, ¿e biologiczny rozk³ad substancji organicznych

jest procesem skomplikowanym i wieloetapowym. W zanieczyszczonej glebie

rozk³ad mo¿e zachodziæ w warunkach tlenowych, jak równie¿ beztlenowych,

pod warunkiem obecnoœci akceptorów i donorów elektronów (rys.1 A i B).

Drogi i strategia biochemicznej transformacji zwi¹zków ropopochodnych

zale¿¹ od charakteru chemicznego rozk³adanego ksenobiotyku, od dostêpnoœci

akceptora elektronów i oczywiœcie od szczepów drobnoustrojów bior¹cych

udzia³ w remediacji [10, 11]. W warunkach tlenowych, gdy akceptorem

elektronów jest tlen, stosunkowo szybkiej degradacji podlegaj¹ zawarte w ropie

naftowej n-alkany. Produktami przemian s¹ alkohole i kwasy t³uszczowe, w³¹czane

nastêpnie w szlaki metaboliczne mikroorganizmów (np. cykl Krebsa,

(ß-oksydacja), a koñcowym produktem jest dwutlenek wêgla i woda [9, 18].

W warunkach utrudnionego dostêpu tlenu efektywnoœæ procesu biodegradacji

zale¿y od mo¿liwoœci wykorzystania innych akceptorów elektronów. Energiê

uzyskan¹ przez mikroorganizmy utleniaj¹ce zwi¹zki organiczne, w zale¿noœci od

dostêpnego akceptora elektronów, przedstawia schemat na rys.2. Najwiêkszy

zysk energetyczny mikroorganizmy uzyskuj¹ w wyniku utleniania substancji

32

organicznej, gdy akceptorem jest tlen (ok. 120 kJ mol

-1

elektronów), a najni¿szy

w warunkach beztlenowych, gdy akceptorem jest dwutlenek wêgla [11].

Rys.1. Schemat biodegradacji olejowych zanieczyszczeñ w warunkach tlenowych (A) i
beztlenowych (B).

Ze schematu p³ynie wniosek, ¿e brak tlenu powoduje, i¿ proces degradacji

podejmuj¹ bakterie beztlenowe korzystaj¹ce z dostêpnego akceptora elektronów

daj¹cego najwy¿szy zysk energetyczny, a po jego wyczerpaniu nastêpna grupa

mikroorganizmów prowadzi degradacjê z udzia³em kolejnego dostêpnego

akceptora [10, 11, 12].

33

Rys. 2. Energia dostêpna dla mikroorganizmów wykorzystuj¹cych ró¿ne akceptory elektronów
w procesie degradacji zwi¹zków organicznych.

Porównanie efektywnoœci i czasu rozk³adu zwi¹zków ropopochodnych

w gruncie, w warunkach tlenowych i beztlenowych przedstawia tabela 1, z której

wynika, ¿e obecnoœæ tlenu skraca czas oczyszczania zaolejonego gruntu.

W przypadku obecnych w zanieczyszczeniach rafineryjnych

wielopierœcieniowych wêglowodorów aromatycznych (WWA), proces

bioremediacji jest wieloetapowy i zachodzi na drodze tzw. ko-metabolizmu

realizowanego przez konsorcja mikroorganizmów. Przyk³adem mo¿e byæ proces

degradacji chlorowcopochodnych jedno- i wielopierœcieniowych zwi¹zków

aromatycznych (rys. 3.) [9, 10, 14, 15, 16].

Tab.1. Porównanie efektywności bioremediacji gruntu zanieczyszczonego olejem

mineralnym, mierzonej w warunkach laboratoryjnych w obecności i nieobecności
tlenu (kompilacja wyników pracy Salminena i wsp. (2004), [13])

Początkowe stężenie

oleju mineralnego

[mg kg

-1

s.m.]

Czas trwania

procesu

[w miesiącach]

% usunięcia oleju

mineralnego po

zakończeniu

inkubacji

Czas potrzebny

do usunięcia 1000

mg kg

-1

s.m. oleju

mineralnego

[w miesiącach]

Warunki

beztlenowe

2400
5000

16400

12
12
12

42
64
34

11.9
3.75
2.15

Warunki

tlenowe

1300
5100

14900

3
3
3

58
22
31

3.9
2.1
0.6

34

Rys.3. Uproszczony schemat biochemicznych szlaków degradacji chlorowcopochodnych
zwi¹zków aromatycznych.

W procesie takiej degradacji uczestniczy wiele mikroorganizmów, najczêœciej

z rodzaju Pseudomonas, Sphingomonas, Acinetobacter, Flavobacterium,

Mycobacterium, Rhodococcus i wiele innych [17, 18].

35

W pierwszej fazie przemian metabolicznych pochodnych WWA nastêpuje

przekszta³cenie podstawników, ³añcuchów bocznych lub ca³ych pierœcieni

aromatycznych do pochodnych chlorokatechiny. W drugiej fazie, zwanej

zmodyfikowanym szlakiem orto, nastêpuje sekwencja skomplikowanych reakcji

biochemicznych prowadz¹cych do degradacji pochodnych chlorokatechiny [17].

Dla przyk³adu, w fazie I zwi¹zki mono- i bi-aromatyczne pozbawione grup

hydroksylowych s¹ aktywowane przez wielopodjednostkowe dioksygenazy, np.

dioksygenazê benzenow¹ czy 2,3-dioksygenazê bifenylow¹ w obecnoœci tlenu

cz¹steczkowego. Powsta³e pochodne cis-hydrodiolowe podlegaj¹ dzia³aniu

dehydrogenazy i zostaj¹ przekszta³cone do pochodnych 1,2-difenolowych, które

s¹ substratem w kolejnej reakcji enzymatycznego rozszczepiania, prowadz¹cej

do rozbicia pierœcienia aromatycznego. Reakcje te wymagaj¹ obecnoœci tlenu.

Nale¿y podkreœliæ, ¿e biodegradacja niektórych grup WWA wykazuje pewn¹

specyfikê biochemiczn¹, np. w przypadku pochodnych aniliny powstawanie

difenolu zachodzi w reakcji dioksygenazy aniliny z jednoczesnym uwolnieniem

amoniaku [17, 19].

Faza I prowadzi do powstania katechiny i jej analogów, które stanowi¹ substrat

w II fazie przemian. W fazie tej pochodne katechiny s¹ degradowane przez

szereg enzymów (dioksygenazy, cykloizomerazy, hydrolazy i reduktazy)

w sekwencyjnych reakcjach biochemicznych, prowadz¹cych do powstania

intermediatów w³¹czanych do cyklu Krebsa, glukoneogenezy czy (ß-oksydacji

[9, 18]. Obszerny przegl¹d poznanych dot¹d mechanizmów enzymatycznej

degradacji WWA i ich chlorowcopochodnych jest opisany w kilku publikacjach

wraz z subtelnymi osobliwoœciami, wynikaj¹cymi z heterogenicznoœci tej klasy

zwi¹zków [9, 16, 18].

Warto zaznaczyæ, ¿e zupe³nie nie jest znana rola szeregu enzymów

uczestnicz¹cych w dekompozycji WWA, takich jak np. transferazy bursztynylo-

CoA, tiolazy 3-oksoadypilo-CoA i innych, w koñcowych etapach szlaku

degradacji.

Enzymy mikroorganizmów uczestnicz¹ce w przemianach fazy I i II

charakteryzuj¹ siê ró¿n¹ specyficznoœci¹ i nie wszystkie, konieczne do pe³nej

degradacji ksenobiotyków, s¹ obecne w jednym szczepie. Przyk³adem jest analiza

aktywnoœci dioksygenazy chlorobenzoesanu wystêpuj¹cej w Ralstonia eutropha

– szczepie degraduj¹cym benzoesan, oraz Pseudomonas sp. B13– degraduj¹cym

3-chlorobenzoesan (3-CB). Szczepy te posiadaj¹ podobn¹ aktywnoœæ 1,2

dioksygenazy o du¿ej specyficznoœci [19] w stosunku do 3-CB, ale nie s¹, lub

s¹ degradowane z niewielk¹ szybkoœci¹, inne pochodne tego kwasu. Z kolei

enzym 1,2 dioksygenaza metylobenzoesowa, obecny w Pseudomonas putida

PaW1, degraduje wszystkie pochodne benzoesanu, ze szczególn¹ preferencj¹

36

4-CB, natomiast degradacji nie podlega analog 2-CB. Odpowiedni enzym

rozk³adaj¹cy ten analog obecny jest w Burkholderia cepacia. Wykorzystuj¹c

w³aœciwoœci biochemiczne tych szczepów mo¿na skonstruowaæ konsorcjum

efektywnie degraduj¹ce wszystkie pochodne benzoesanu.

Oprócz specyficznoœci katalizy enzymatycznej pojawia siê nastêpny prob-

lem. Zwi¹zki WWA s¹ w ograniczonym stopniu dostêpne dla mikroorganizmów

ze wzglêdu na ich hydrofobowy charakter. Bioremediacja tych zwi¹zków

nastêpuje na granicy faz utworzonej przez emulgatory produkowane przez

bakterie i wodê. Efektywnym mikroorganizmem produkuj¹cym polisacharydy

egzogenne jest Halomonas eurihalina [20, 21]. ObecnoϾ bakterii

produkuj¹cych bioemulgatory w sposób znacz¹cy wp³ywa na szybkoœæ

biodegradacji omawianych zwi¹zków. Istnieje jednak niebezpieczeñstwo zwi¹zane

z nadmiarem substancji emulguj¹cych, czy to produkowanych przez konsorcjum,

czy to dodawanych do mediów podlegaj¹cych dekontaminacji, np.

degradowalnych detergentów. Dodawanie detergentów syntetycznych lub

naturalnych niesie niebezpieczeñstwo powstania toksycznych intermediatów,

zanieczyszczaj¹cych wody gruntowe i glebê w jeszcze wiêkszym stopniu ni¿

substancje pierwotne [21]. Z kolei dodanie surfaktantów pochodzenia roœlinnego

(saponiny lecytyny) mo¿e spowodowaæ solubilizacjê WWA i pochodnych

w nadmiernym stopniu, tak ¿e bakterie prowadz¹ce proces oczyszczania ulegn¹

toksyfikacji [20]. Dlatego zewnêtrzne dodawanie substancji wp³ywaj¹cych na

solubilizacjê hydrofobowych zanieczyszczeñ musi podlegaæ kontroli.

Kolejnym zagadnieniem w procesie biodegradacji zwi¹zków ropopochodnych

jest problem zwi¹zany z dostêpnoœci¹ efektywnego akceptora elektronów.

Procesy utleniania WWA i pochodnych przebiegaj¹ najczêœciej w warunkach

aerobowych, gdzie akceptorem elektronów jest tlen. Jednak czasami dostêpnoœæ

tlenu do wód gruntowych czy g³êbszych warstw gleby jest utrudniona. Dlatego

wykorzystanie innych akceptorów elektronów, takich jak azotany, siarczany czy

Fe

3+

staje siê konieczne w warunkach œrodowiskowych [22]. Analiza konsumpcji

akceptorów elektronów wykaza³a, ¿e biodegradacja toluenu i naftalenu by³a

faworyzowana w obecnoœci od 1.5 do 2.0 mg tlenu/l, oraz ¿e tlen i azotan by³y

wykorzystywane jako akceptory elektronów w taki sposób, i¿ spadek stê¿enia

tlenu powodowa³ wiêksze wykorzystanie azotanu w badanym przedziale stê¿eñ

tlenu. Jednoczeœnie doœwiadczalnie wykazano, ¿e w przypadku mniejszych stê¿eñ

tlenu (0.5 do 1.0 mg O

2

/l), biodegradacja toluenu i etylobenzenu przebiega³a

efektywniej. Nie s¹ znane mechanizmy tych reakcji przy ró¿nych stê¿eniach tlenu,

a tylko sugeruje siê ich odrêbnoœæ [14]. W³aœciwoœæ ta mo¿ne zostaæ

wykorzystana w warunkach œrodowiskowych w przypadku degradacji

zanieczyszczonych gleb i wód zwi¹zkami BTEX (benzen, toluen, etylobenzen,

ksylen).

37

Wyniki prezentowanych powy¿ej prac [11, 12, 14, 23] otwieraj¹ ogromne

mo¿liwoœci w procesie sterowania bioremediacj¹ w zale¿noœci od stopnia ska¿enia

medium toluenem i naftalenem, jak równie¿ toluenem i etylobenzenem. Bardzo

czêsto stwierdza siê obecnoœæ tych zwi¹zków w ska¿onych gruntach, dlatego

znajomoœæ kinetyki degradacji i jej zale¿noœci od warunków tlenowych oraz

dostêpnoœci innych akceptorów elektronów mo¿e byæ wykorzystana

w optymalizacji procesu oczyszczania.

Dzia³anie enzymów rozk³adaj¹cych WWA oraz regulacja ich ekspresji zosta³y

najlepiej poznane w przypadku szczepów Pseudomonas i Sphingomonas [24,

25]. Inne szczepy z rodzaju Mycobacterium, Rhodococcus, Nocardioides,

równie¿ posiadaj¹ce enzymy katabolizuj¹ce WWA, s¹ poznane w niewielkim

stopniu pod k¹tem ich aktywnoœci enzymatycznej [26]. W procesach

oczyszczania gruntów i wód najbardziej po¿¹dane s¹ aktywnoœci mono-

i dioksygenaz – enzymów rozbijaj¹cych pierœcienie aromatyczne. Bia³ka te s¹

najczêœciej kodowane w sekwencjach plazmidowego DNA. Oko³o 70% znanych

szczepów degraduj¹cych WWA i ich pochodne to szczepy Pseudomonas,

w tym oko³o 50% to izolanty P. putida. W literaturze opisano plazmidy koduj¹ce

enzymy I i II fazy oraz ich w³aœciwoœci i drogi genetycznego transferu [27, 28].

W niektórych przypadkach interesuj¹ce sekwencje genetyczne zlokalizowane

s¹ w chromosomie bakteryjnym. Przyk³adem s¹ geny koduj¹ce bia³ka

odpowiedzialne za degradacjê toluenu/benzenu w szczepie P. putida F1, czy

geny koduj¹ce degradacjê bifenyli w przypadku szczepu P. pseudoalcaligenes

KF707 [28]. Istnieje zatem mo¿liwoœæ transferu po¿¹danej aktywnoœci

katabolicznej do szczepu, który wykazuje upoœledzon¹ aktywnoœæ intermediatu

stanowi¹cego tzw. w¹skie gard³o szlaku (bottle-neck). Wiadomo równie¿, ¿e

ekspresja klasteru genów zwi¹zanych z degradacj¹ bifenyli nastêpuje w postaci

jednego transkryptu [28]. Oznacza to, ¿e kilka enzymów i ich podjednostek jest

kodowanych w jednej cz¹steczce mRNA, w której mo¿na stosunkowo ³atwo

oznaczyæ i zidentyfikowaæ sekwencje nukleotydowe kilku wa¿nych oksygenaz.

Stwarza to pewn¹ ³atwoœæ identyfikacji szczepów bakteryjnych o najwiêkszej

aktywnoœci degradacji WWA i ewentualnej konstrukcji (doboru) kilku lub

kilkunastu szczepów, szybko i efektywnie rozk³adaj¹cych uci¹¿liwe

zanieczyszczenia œrodowiskowe. Nale¿y zaznaczyæ, ¿e zdolnoœæ katabolizmu

wêglowodorów aromatycznych posiadaj¹ równie¿ dro¿d¿e z rodzaju Candida,

Cryptococcus, Pichia, Rhodotorula czy Yarrowia [4, 29].

W kolekcji drobnoustrojów pro- i eukariotycznych Zak³adu Biochemii AR

w Krakowie zgromadzono dotychczas wiele szczepów bakteryjnych

i dro¿d¿owych, które s¹ wykorzystywane do konstrukcji mieszanych biocenoz,

rozk³adaj¹cych uci¹¿liwe zanieczyszczenia ropopochodne w gruncie. Miêdzy

38

innymi zastosowano œrodowiskowe izolanty dro¿d¿owe do biodegradacji ska¿eñ

wystêpuj¹cych w zaolejonej ziemi, zawieraj¹cej WWA [30]. Bank

mikroorganizmów Zak³adu Biochemii zosta³ utworzony ze szczepów

wyizolowanych z wielu ró¿nych Ÿróde³ zanieczyszczonych wód i gleb,

wystêpuj¹cych na terenie ca³ej Polski. Bank ten jest obecnie podstaw¹ do

dalszych badañ zwi¹zanych z opracowaniem sk³adu specyficznych biocenoz,

przeznaczonych do degradacji uci¹¿liwych ksenobiotyków, ze szczególnym

uwzglêdnieniem zwi¹zków z grupy WWA oraz ich chlorowcopochodnych (jak

np. polichlorowane bifenyle, PCB) [30, 31], nale¿¹cych do zwi¹zków najtrudniej

podlegaj¹cych bioremediacji, o najwiêkszej geno- i cytotoksycznoœci dla

organizmów ¿ywych. Konstruowane konsorcja drobnoustrojów wykazuj¹

równie¿ wysok¹ efektywnoœæ pod wzglêdem biodegradacji szeregu innych

toksycznych substancji, takich jak: detergentów, metanolu, formaldehydu i jego

po³¹czeñ chemicznych, ¿ywic, klejów oraz wielu innych.

Z powodzeniem powy¿sze techniki konstrukcji konsorcjów mikroorganizmów

wykorzystano do oczyszczania gleby w wielu œrodowiskowych projektach

rekultywacji. Prace te opisano w nastêpnym artykule.

Piœmiennictwo

[1] Siuta J., 1997. Podstawy biodegradacji ropopochodnych sk³adników

w glebach i w odpadach. „Technologie odolejania gruntów, odpadów,

œcieków.” Wyd. Ekoin¿ynieria, 119-130.

[2] £ebkowska M., Muszyñski A., Sztompka E., Karwowska E., Miaœkiewicz

E., 1997. Mikrobiologiczne oczyszczanie gruntów ze sk³adników

ropopochodnych. „Technologie odolejania gruntów, odpadów, œcieków.”

Wyd. Ekoin¿ynieria, 115-118.

[3] Siuta J., £¹cka-Pilaszek B., Królikowski K., Turowski P., 1997. Wapnohum

produktem utylizacji osadów Petrochemii P³ock S.A. „Technologie odolejania

gruntów, odpadów, œcieków.” Wyd. Ekoin¿ynieria, 150-161.

[4] Kaszycki P., Solecki T., Krawczyk A., Ko³oczek H., 2000. Optymalizacja metod

biologicznego oczyszczania zaolejonych gruntów. In¿ynieria Ekologiczna, 2: 40-47.

[5] Leahy J.G., Colwell R.R., 1990. Microbial Degradation of hydrocarbons in

the environment. Microbiol. Rev., 54: 305-315.

[6] Hamme van J.D., Singh A., Ward O.P., 2003. Recent advances in petroleum

microbiology. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 67: 503-549.

[7] Bregnard T.P., Hohener P., Haner A., Zeyer J., 1996. Degradation of weath-

ered diesel fuel by microorganisms from a contaminated aquifer in aerobic

and anaerobic microcosms. Environ. Toxicol. Chem., 15: 299-307.

39

[8] Cooney J.J., Silver S.A., Beck E.A., 1985. Factors influencing hydrocarbon

degradation in three freshwater lakes. Microbial Ecol., 11: 127-137.

[9] Reineke W., 1998. Development of hybrid strains for the mineralization of

chloroaromatics by patchwork assembly. Annu. Rev. Microbiol., 52: 287-331.

[10] Bayly R.C., Wigmore G.J., 1973. Metabolism of phenol and cresols by

mutants of Pseudomonas putida. J. Bacteriol., 113: 1112-20.

[11] Ottow J.C.G., Fabig W., 1985. Influence of oxygen aeration on denitrifica-

tion and redox level in different batch cultures. W: Caldwell D.E., Brierly

J.A., eds. Planetary Ecology, New York, Van Nostrad Reinhold, pp. 427-40.

[12] Phelps C.D., Young L.Y., 2001. Biodegradation of BTEX under anaerobic

conditions: a review. Adv. Agron., 70: 329-357.

[13] Salminen J.M., Tuomi P.M., Suortti A-M., Jorgensen K.S., 2004. Potential

for aerobic and anaerobic biodegradation of petroleum hydrocarbons in bo-

real subsurface. Biodegradation, 15: 29-39.

[14] Kuhn E.P., Zeyer J., Eichner P., Schwarzenbach R.P., 1988. Anaerobic

degradation of alkylated benzenesin denitrificating laboratory columns. Appl.

Environ Microbiol., 54: 490-496.

[15] Wittich R.M., Wilkes H., Sinnwell V., Francke W., Fortnagel P., 1991.

Metabolism of dibenzo-p-dioxin by Sphingomonas sp., strain RW1. Appl.

Environ. Microbiol., 58: 1005-10.

[16] Worssey M.J., Williams P.A., 1975. Metabolism of toluene and xylenes by

Pseudomonas putida (arvilla) mt-2: evidence for a new function of the TOL

plasmid. J. Bacteriol., 124: 7-13.

[17] Bachofer R., Lingens F., 1975. Conversion of aniline into pyrocatechol by

a Nocardia sp., incorporation of oxygen – 18. FEBS Lett., 50: 288-90.

[18] Gibson J., Harwood C.S., 2002. Metabolism diversity in aromatic

compound utilization by anaerobic microbes. Annu. Rev. Microbiol., 56: 345-69.

[19] Engelberts K., Schmidt E., Reineke W., 1989. Degradation of o-toluate by

Pseudomonas sp., strain WR401. FEMS Microbiol. Lett., 59: 35-38.

[20] Vinas M., Grifoll M., Sabate J., Solanas A.M., 2002. Biodegradation of

a crude oil by three microbial consortia of different origins and metabolic

capabilities. J. Indust. Microbiol. Biotechnol., 28: 252-60.

[21] Calvo C., Martinez-Checa F., Toledo F.L., Porcel J., 2002. Characteris-

tics of bioemulsifiers synthesized in crude oil media by Halomonas eurihalina

and their effectiveness in the isolation of bacteria able to grow in the presence

of hydrocarbons. Appl. Microbiol. Biotechnol., 60: 347-351.

[22] Deziel E., Paquette G., Villemur R., Lepine F., Bisaillon J.G., 1996.

Biosurfactant production by a soil Pseudomonas strain growing on polycy-

clic aromatic hydrocarbons. Appl. Environ. Microbiol., 62: 1908-12.

40

[23] Su J., Kafkewitz D., 1994. Utilization of toluen and xylenes by a nitrate

reducing strain of Pseudomonas maltophilia under low oxygen and anoxic

conditions. FEMS Microbiol. Ecol., 15: 249-58.

[24] Meyer S., Moser R., Neff A., Stahl U., Kampfer P., 1999. Differential

detection of key enzymes of polyaromatic – hydrocarbon- degrading bacte-

ria using PCR and gene probes. Microbiology, 145: 1731-41.

[25] Resnick S. M., Lee K., Gibson D.T., 1996. Diverse reactions catalyzed by

naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. Strain NCIB 9816. J. Ind.

Microbiol., 17: 438-57.

[26] Khan A.A., Wang R-F., Cao W-W., Doerge D., Wennerstorm D., Cerniglia

C.E., 2001. Molecular cloning, nucleotide sequence and expression of genes

encoding a polycyclic aromatic ring dioxygenase from Mycobacterium sp.

Strain PYR-1. Appl. Environ. Microbiol., 67: 3577-85.

[27] Springael D., Van Thor J., Goorissen H., Ryngaert A., de Baere R., 1996.

RP4:Mu3A– mediated in vivo cloning and transfer of a chlorobiphenyl cata-

bolic pathway. Microbiology, 142: 3283-93.

[28] Taira K., Hirose J., Hayashida S., Furukawa K., 1992. Analysis of bph

operon from the polychlorinated biphenyl-degrading strain of Pseudomonas

pseudoalcalgenes KF707. J. Biol. Chem., 267: 4844-53.

[29] Romero M.C., Hammer E., Cazau M.C., Arambarri A., 2001. Selection of

autochthonous yeast strain able to degrade biphenyl. W. J. Microbiol.

Biotechnol. ,17: 591-594.

[30] Koloczek H., Czechowska K., Petryszak P., Kaszycki P., 2004. Biode-

gradation of oil derivatives with methylotrophic yeast isolates. Possible enzy-

matic links between the methylotrophic and hydrocarbon-degrading path-

ways. „Bioremediation of soils contaminated with aromatic compounds: Ef-

fects of rhizosphere, bioavailability, gene regulation and stress adaptation.”

NATO Advanced Research Workshop, 1-3 July 2004, Tartu, Estonia.

[31] Ko³oczek H., Kaszycki P., Jaglarz A., Solecki T., 2003. Opracowanie

procesu biodegradacji zanieczyszczeñ organicznych zawieraj¹cych

polichlorowane bifenyle (PCB) w warunkach zagro¿enia wód. „Technologie

odolejania gruntów, odpadów, œcieków”. In¿ynieria Ekologiczna., 8: 59-70.

dr hab. Henryk Ko³oczek prof. AR

dr Pawe³ Kaszycki

Zak³ad Biochemii

Wydzia³ Ogrodniczy AR w Krakowie

Al. 29 Listopada 54, 31-425 Kraków

e-mail: [e-mail]