(12)

TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO

(19) PL

(11)

PL/EP 1757276

(13)

T3

(96)

Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

01.08.2005 05016712.1

RZECZPOSPOLITA

POLSKA

Urząd Patentowy

Rzeczypospolitej

Polskiej

(97)

O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono:

26.09.2007 Europejski Biuletyn Patentowy 2007/39

EP 1757276 B1

(51) Int. Cl.

A61K9/51
A61K9/50

(2006.01)
(2006.01)

(54) Tytuł wynalazku:

Sposób otrzymywania nano-i-mikrokapsułek z białka pajęczego jedwabiu

(30)

Pierwszeństwo:

(43)

Zgłoszenie ogłoszono:

28.02.2007 Europejski Biuletyn Patentowy 2007/09

(45)

O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:

29.02.2008 Wiadomości Urzędu Patentowego 02/2008

(73) Uprawniony z patentu:

Technische Universität München, München, DE

(72) Twórca (y) wynalazku:

Scheibel Thomas, München, DE
Bausch Andreas, München, DE
Huemmerich Daniel, Mintraching, DE
Hermanson Kevin, Cincinnati, US

PL/EP 1757276 T3

(74) Pełnomocnik:

WTS Rzecznicy Patentowi
rzecz. pat. Witek Rafał
53-114 Wrocław
ul. R. Weigla 12

Uwaga:

W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw
dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą
wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

1

Opis

[0001] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania nano- oraz mikrokapsułek z

białek pajęczego jedwabiu. Ponadto, wynalazek związany jest z nano- lub mikrokapsułkami

uzyskiwanymi tym sposobem, jak również zawierającymi je farmaceutycznymi,

kosmetycznymi i żywnościowymi kompozycjami.

[0002] Struktury o małych rozmiarach cieszą się dużym zainteresowaniem jako pęcherzyki

transportowe oraz jako potencjalne bloki budujące w przyszłych zastosowaniach. Jednym z

ich zadań jest możliwość kapsułkowania substancji reagujących lub cząstek o małych

rozmiarach oraz umożliwienie rozpoczęcia uwalniania zakapsułowanej substancji, po

umieszczeniu ich w określonych warunkach. Rozwiązaniem takiego problemu jest

zastosowanie pęcherzyków chemicznych, tak zwanych nano-kapsułek. Nano-kapsułki

zaprojektowane są do uwalniania znajdujących się wewnątrz substancji reagujących pod

wpływem zewnętrznego elementu rozpoczynającego uwalnianie lub bodźca. Z zagadnieniem

tym związanych jest kilka problemów: najważniejszym jest otrzymanie takich nano-kapsułek

w zdefiniowany sposób otaczających, np. chemicznie lub biologicznie aktywne substancje.

[0003] Ostatnio, w odpowiedzi na taką potrzebę, rozwijano „hybrydowe”, odpowiadające na

bodziec nano-kapsułki. Struktury (pęcherzyki, lecz również micele) uzyskano z

samogrupujących się np. diblokowych kopolimerów kwasu amfifilo-polibutadieno (PB)-b-

poli(glutaminowego) (PGA), o konformacji wrażliwej na pH. Wrażliwość na pH może być

wykorzystana do procesu rozładowania pęcherzyków. Kopolimery PB-b-PGA zawierające

usieciowany blok hydrofobowy i hydrofilowy blok peptydowy zsyntetyzowano poprzez

połączenie anionowej i otwierającej pierścień polimeryzacji (Chécot et al., 2003).

Polidyspersyjność kopolimerów jest wystarczająco mała by uzyskać dobrze zdefiniowane,

samogrupujące się agregaty. Na przykład, kopolimer PB40-b-PGA 100 w wodzie tworzy

ścisłe, dwuwarstwowe pęcherzyki zwane polimersomami (Won et al., 1999). Jedną z

właściwości tych pęcherzyków jest to, że odpowiadają zmianą wielkości na przesunięcie pH

środowiska na zewnątrz (Figura 1). Takie przejście pod wpływem zmian pH jest odwracalne i

tylko umiarkowanie wrażliwe na zasolenie, nie bazuje zatem na prostym efekcie

polielektrolitowego zwiększenia objętości, ale na peptydowym charakterze bloku PGA

(Figura 1). Takie pęcherzyki są w stanie służyć nie tylko jako kapsułki dla związków

niskocząsteczkowych (jak cząsteczki rozpuszczalnika, takie jak fluorofory (Chécot et al.,

2003)), lecz również mogą stabilizować większe nanoczasteczki. Wadą takich systemów jest

częściowy brak kompatybilności z układami biologicznymi, które zazwyczaj są bardzo

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

2

wrażliwe na silne zmiany pH, ze względu na to, że takie zmiany pH mogą powodować utratę

aktywności biologicznej kapsułkowanej próbki.

[0004] Na Figurze 1 przedstawiono dla zobrazowania (a) dynamiczne rozproszenie światła

hydrodynamicznego promienia R

H

peptosomu w funkcji stężenia NaCl i pH. (b)

Schematyczne przedstawienie peptosomu i zmian jego wielkości w funkcji pH, z powodu

zwinięcia i przejścia w drugorzędową strukturę

α-helisy części peptydu.

[0005] Inną znaną metodą kapsułkowania jest samogrupowanie się cząstek koloidalnych na

powierzchni styku faz olej/woda. Siła prowadząca proces samogrupowania wynika z

minimalizacji całkowitej energii powierzchniowej – przez co może być użyty szeroki

wachlarz cząstek i rozpuszczalników. Takiego typu stabilizowane emulsje dobrze znane są

jako emulsje Pickering. Stabilizacja lub sieciowanie cząstek prowadzi do mechanicznie

stabilnych jednostek, które następnie mogą być przeniesione do fazy ciągłej. Zaletą tak

zwanych koloidosomów jest kontrola substancji zawartej w środku oraz łatwość regulowania

mechanicznej i chemicznej stabilności zewnętrznej otoczki. Samogrupowanie się cząstek daje

w wyniku strukturę niemal krystaliczną, przez co występują w niej otwory pomiędzy

cząstkami. Otwory te stanowią wybiórczy rozmiarowo filtr, który umożliwia kontrolę

procesu dyfuzji przez membranę (Dinsmore et al., 2000). Cały proces może być

przeprowadzony w sposób biokompatybilny. Jednakże, same cząstki koloidalne nie

koniecznie są biokompatybilne.

[0006] W US 6 303 150 opisano nanokapsułki o ściankach z sieciowanych białek. Białko

musiało wykazywać efekt tworzący film i wybrane było z grupy białek roślinnych lub

zwierzęcych, jak np. jedwab. Czynnik sieciujący był konieczny do otrzymania ścian kapsułek.

[0007] W WO 02/47665 opisano sposób otrzymywania samogrupujących się, wybiórczo

przepuszczalnych, elastycznych, mikroskopowych struktur, odnoszących się do

koloidosomów, które posiadają kontrolowany rozmiar porów, porowatość i korzystne

właściwości mechaniczne. Sposób obejmuje: (a) dostarczenie cząsteczek utworzonych z

materiału biokompatybilnego w pierwszym rozpuszczalniku; (b) utworzenie emulsji poprzez

dodanie pierwszej cieczy do wspomnianego pierwszego rozpuszczalnika, wspomniana

emulsja jest zdefiniowana przez krople wspomnianej pierwszej cieczy otoczone przez

wspomniany pierwszy rozpuszczalnik; (c) opłaszczenie powierzchni wspomnianych kropel

wspomnianymi cząsteczkami; oraz (d) stabilizację wspomnianych cząstek na powierzchni

wspomnianej kropli w celu utworzenia koloidosomów posiadających wytrzymałość na siłę

przynajmniej około 20 Paskali. W WO 02/47665 do produkcji opisywanych koloidosomów

zastosowano biokompatybilne, syntetyczne polimery. Przykładem jest polistyren,

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

3

polimetylometakrylan, polialkileny, krzemionka i ich kombinacje. Cząstki, z których

uzyskiwano koloidosomy stabilizowano na przykład poprzez spiekanie, sieciowanie

chemiczne i tym podobne. Jednakże, sposób otrzymywania wspomnianych koloidosomów

jest współmiernie trudny a stosowane cząstki koloidowe mogą wykazywać szkodliwe

właściwości w zastosowaniach in vivo ze względu na ich syntetyczny i nienaturalny charakter.

Zastosowanie koloidalnych cząstek ogranicza również zakres wielkości otoczek, ponieważ

użycie koloidów ogranicza minimalna wielkość torebki o zdefiniowanych otworach.

[0008] Istnieje zatem, problem przedstawiony w niniejszym wynalazku polegający na

dostarczeniu nano- i mikrokapsułek silnie biokompatybilnych, a zatem odpowiednich do

zastosowań in vivo. Innym problemem związanym z niniejszym wynalazkiem jest uzyskanie

nano- i mikrokapsułek, które są zdolne przyjmować różne rodzaje i zmienne ilości

składników aktywnych lub odżywczych, tj., które pozwalają na kontrolowane uwalnianie

wspomnianych składników aktywnych itp. in vivo, na przykład w zastosowaniach

miejscowych lub układowych.

[0009] Problemy te zostały rozwiązane w niniejszych zastrzeżeniach niezależnych. Korzystne

realizacje przedstawiono w zastrzeżeniach zależnych.

[0010] W niniejszym wynalazku, zaskakująco okazało się, że białka jedwabiu pajęczego

mogą służyć jako podstawa do formowania mikro- i nanokapsułek, które mogą znaleźć różne

zastosowania in vivo. W szczególności, okazało się, że mogą być uzyskane za pomocą

ulepszonego sposobu produkcji wspomnianych kapsułek, który nie wymaga stosowania etapu

łączenia lub stabilizowania cząsteczek, z których tworzone są kapsułki, przez dodatek

odczynników chemicznych, jak czynniki sieciujące lub, które wymóg spiekania, lub innych,

które mogą wywierać szkodliwy wpływ na środki upakowane w środku wspomnianych

mikro- i nanokapsułek.

[0011] Ponieważ najnowsze stosowane techniki kapsułkowania (patrz na przykład WO

02/47665) opierają się na cząsteczkach niebiologicznych lub makromolekułach, Twórcy

rozwinęli nowy, stabilny proces kapsułkowania, oparty na samoskładających się białkach

jedwabiu pajęczego. Inaczej, niż pozostałe techniki kapsułkowania, w niniejszym sposobie

hydrofobowy/hydrofilowy charakter powierzchni emulsji nie tylko został wykorzystany do

zebrania cząsteczek koloidu, ale wykorzystano również siłę prowadzącą do immobilizacji

koloidu poprzez koalescencję i tworzenie sieci polimerowej (stabilizację). Proces ten jest nie

tylko sposobem otrzymywania polimerowych nano- i mikrokapsułek utworzonych z nowej

klasy biokompatybilnych koloidów, ale stanowi również nowe podejście do otrzymywania

sieci polimerowej z zastosowaniem białek. Dużą zaletą nano- i mikrokapsułek utworzonych

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

4

za pomocą niniejszego sposobu jest ich biokompatybilność i funkcjonalność nadana

kapsułkom przez białka. Umożliwia to kontrolę mechanizmu uwalniania za pomocą kilku

środków: zmian pH, zmian temperatury lub aktywności proteaz.

[0012] Na przykład, nano- i mikrokapsułki mogą być zniszczone a ich składniki uwolnione in

vivo chemicznie, fizycznie (na przykład przez siły rozrywające) lub biologicznie (przez

trawienie proteolityczne).

[0013] Samoskładanie białek jedwabiu pajęczego na styku powierzchni osiągnięto poprzez

wprowadzenie białka do fazy wodnej w emulsji woda/olej (patrz Figura 2). Minimalizacja

energii powierzchniowej skierowała białka na styk powierzchni i spowodowała agregację

monomerów, prowadzącą do utworzenia gęstej sieci polimerowej (Figura 3).

[0014] Powstałe w tym procesie torebki/baloniki wypełniane są na przykład zawartością fazy

wodnej i mogą przebywać w rozpuszczalnikach organicznych, alkoholach, jak również w

wodzie (Figura 3). Zatem, wykazują nieoczekiwaną stabilność w znacznie różnych

środowiskach. Istotnie, samo składanie białek na odwrotnej powierzchni emulsji jest również

możliwe – dlatego możliwe jest kapsułkowanie zawartości fazy olejowej (patrz również

poniżej).

[0015] Zadziwiająco, torebki/baloniki mogą zostać wypełnione białkami, odczynnikami

chemicznymi, cząsteczkami o rozmiarach nano- i mikrometrowych, itp., co przykładowo

przedstawiono poprzez wypełnienie cząstek cząsteczkami znakowanego fluorescencyjnie

(FITC) dekstranu (Figura 4).

[0016] Nieprzepuszczalność membrany i mechaniczna stabilność torebek wobec stresu

osmotycznego są, biorąc pod uwagę grubość membrany, względnie wysokie. Obrazy z

mikroskopu elektronowego ujawniają, że grubość ta wynosi między 10 a 70 nm (Figura 5).

[0017] W niniejszym podejściu, w celu osiągnięcia biologicznego zakapsułkowania

składników aktywnych, wykorzystano syntetyczne białka jedwabiu pajęczego, w

szczególności zastosowano syntetyczną sekwencję C

16

(Huemmerich et al., 2004).

[0018] Ogólnie, jedwabie pajęcze są polimerami białkowymi wykazującymi nadzwyczajne

właściwości fizyczne, jednak informacje na temat składu różnych jedwabi produkowanych

przez różne pająki są ograniczone (patrz Scheibel, 2004). Wśród rożnych typów jedwabi

pajęczych, najintensywniejsze badania prowadzone były nad niciami pajęczymi ze złotego

pająka jedwabnego Nephila clavipes oraz z krzyżaka ogrodowego Araneus diadematus.

Jedwabie z białkiem nici pajęczej składają się ogólnie z dwóch głównych białek i pozostaje

niejasnym czy dodatkowe białka odgrywają istotną rolę w wytwarzaniu i końcowej strukturze

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

5

jedwabiu. Dwoma głównymi składnikami białkowymi nici z Araneus diadematus są ADF-3 i

ADF-4 (Araneus Diadematus Fibroin).

[0019] Geny kodujące białka podobne do jedwabiu pajęczego otrzymywano stosując strategię

klonowania, opartą na kombinacji modułów syntetycznego DNA i sekwencji naturalnego

genu, amplifikowanego PCR (Huemmerich et al., 2004). Białka nici jedwabnych ADF-3 i

ADF-4 pochodzące od pająka ogrodowego Araneus diadematus wybrano jako matryce dla

konstruktów syntetycznych. Ciągła strategia klonowania pozwala na kontrolowaną

kombinację różnych modułów syntetycznego DNA, jak również naturalnych fragmentów

genu. Zaprojektowany wektor klonowania zawierał kasetę klonowania z sekwencją

rozdzielającą, przeznaczoną jako miejsce dla syntetycznych genów (Huemmerich et al.,

2004).

[0020] W celu naśladowania sekwencji powtórzeniowej ADF-4, zaprojektowano jednostkę

pojedynczego konserwatywnego powtórzenia, tak aby uzyskać jeden moduł konsensusowy,

określony jako C, który multimeryzowano w celu uzyskania białka powtórzeniowego C

16

,

które zostało wykorzystane w podejściu przedstawionym jako przykład.

[0021] Istnieje wiele możliwych zastosowań przedstawionych torebek/balonów z pajęczego

jedwabiu, poczynając od żywności funkcjonalnej do zastosowań farmaceutycznych i

kosmetycznych. Na przykład, kapsułkowanie w technologii żywności może ochronić pewne

składniki, takie jak witaminy przed utlenieniającym wpływem środowiska. W innym

zastosowaniu w technologii żywności, możliwe jest ukrycie smaku takich składników jak olej

z ryb. W zastosowaniach farmaceutycznych bariera dyfuzyjna otoczki białkowej pozwala na

powolny (kontrolowany) proces uwalniania zakapsułkowanego materiału. Dalsze

zaprojektowanie otoczki białkowej może dać w wyniku opakowanie o zdefiniowanym

uwalnianiu, które uwalnia zawartość jedynie po aktywacji z zastosowaniem określonych

proteaz lub innych czynników uruchomiających proces uwalniania. W kosmetykach, transport

składników aktywnych w wodzie do skóry może być ułatwiony poprzez przedstawione

torebki/balony, po powolnej degradacji otoczki białkowej, np., przez proteazy w skórze.

Ponadto, po nałożeniu na skórę uwolnienie zawartości może być osiągnięte poprzez

mechaniczne rozerwanie.

[0022] Niniejszy wynalazek w szczególności ukierunkowany jest na następujące aspekty i

zastosowania:

[0023] Zgodnie z pierwszym aspektem, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania

nano- i mikrokapsułek, obejmującego następujące etapy:

a) dostarczenie białek pajęczego jedwabiu;

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

6

b) utworzenie roztworu lub zawiesiny wspomnianych białek w odpowiednim

rozpuszczalniku;

c) uzyskanie emulsji o przynajmniej dwóch fazach, wspomniana emulsja zawierająca roztwór

lub zawiesinę utworzoną w punkcie b) jako pierwszą fazę i przynajmniej jedną dodatkową

fazę, która jest zasadniczo niemieszalna ze wspomnianą pierwszą fazą;

d) utworzenie sieci polimerowej białek pajęczego jedwabiu na powierzchni zetknięcia

przynajmniej dwóch faz;

e) wydzielenie sieci polimerowej białek otrzymanych na etapie (d) z emulsji.

[0024] Jak wyjaśniono wyżej, nieoczekiwanie okazało się, że utworzenie sieci polimerowej

na etapie d) nie wymaga dodania kolejnych elementów (na przykład czynników sieciujących)

i nie ma potrzeby zastosowania dodatkowych etapów, jak spiekanie, sieciowanie itp.).

[0025] Wiadomo, że stosowany tu termin „białko pajęczego jedwabiu” nie tylko obejmuje

wszystkie naturalne sekwencje, ale również wszystkie pochodzące z nich sztuczne lub

syntetyczne sekwencje.

[0026] Zgodnie z powyższym, sekwencje jedwabiu pajęczego mogą pochodzić z sekwencji,

nazwanych jako „oryginalne”. Termin ten oznacza, że zastosowane sekwencje kwasu

nukleinowego wyizolowane są ze środowiska naturalnego, bez poddawania istotnym

zmianom ich sekwencji. Jedyną akceptowaną modyfikacją, która może wystąpić jest

zmodyfikowanie oryginalnej sekwencji kwasu nukleinowego w celu przystosowania tej

sekwencji do ekspresji w gospodarzu bez zmiany kodowanej sekwencji aminokwasowej.

Korzystnymi sekwencjami są NR3 (SEQ ID NO: 10; pochodząca z ADF-3) oraz NR4 (SEQ

ID NO: 11; pochodząca z ADF-4). W obu sekwencjach, dla bardziej wydajnej translacji,

kodon AGA (Arg), rzadko ulegający translacji u E.coli poddano mutacji do CGT (Arg) przy

zastosowaniu mutagenezy PCR.

[0027] Oryginalne, niepowtarzające się sekwencje pochodzą korzystnie z amino-końcowego,

nie zawierającego powtórzeń regionu (białka wiciowate, ang. flagelliform) i/lub

karboksylowego końca niepowtarzającego się regionu (białka wiciowate i białka nici ang.

dragline) naturalnie występującego białka jedwabiu pajęczego. Korzystne przykłady tych

białek zostaną wskazane poniżej.

[0028] Zgodnie z kolejną realizacją, oryginalne, nie powtarzające się sekwencje pochodzą z

amino-końcowego, niepowtarzającego się regionu (białka wiciowate) i/lub karboksylowego

końca niepowtarzającego się regionu (białka wiciowate i białka nici) naturalnie

występującego białka jedwabiu pajęczego.

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

7

[0029] Korzystne oryginalne sekwencje białek wiciowatych są sekwencjami

aminokwasowymi i sekwencjami kwasu nukleinowego z FlagN-NR (SEQ ID NO: 31 i 32)

oraz FlagC-NR (SEQ ID NO: 33 i 34).

[0030] Rekombinowane białka jedwabiu pajęczego według wynalazku mogą ogólnie

pochodzić z białek nici pajęczych (ang. dragline) z pajęczego głównego gruczołu przędnego

i/lub z białek pochodzących z gruczołu przędnego wydzielającego białka wiciowate (ang.

flagelliform).

[0031] Zgodnie z realizacją, rekombinowane (syntetyczne/sztuczne) białka jedwabiu

pajęczego, które mogą być zastosowane w niniejszym wynalazku ogólnie pochodzą z białek

nici pajęczych (ang. dragline) z gruczołów przędnych i/lub z białek pochodzących z

gruczołów białek wiciowatych.

[0032] Ogólnie, korzystnie jest wybrać sekwencje białka nici ang. dragline i/lub białka

wiciowatego, ang. flagelliform ze wspomnianych białek pochodzących z kulistych-

pajęczynowych pająków (Araneidae i Araneoids).

[0033] Korzystniej, białka nici i/lub białka wiciowate pochodzą z jednego lub więcej z

następujących pająków: Arachnura higginsi, Araneus circulissparsus, araneus diadematus,

Argiope picta, pająk krzyżakowaty (Argiope trifasciata), Nephila antipodiana, Cyrtophora

beccari, Celaenia excavata, czarno-biały pająk kolczasty (Gasteracantha kuhlii), czarno-żółty

pająk ogrodowy (Argiope aurantia), pająk Bolas (Ordgarius furcatus), Ordgarius magnificus,

Neoscona nautica, Neoscona rufofemorata, Zygiella calyptrata, pospolity pająk ogrodowy

(Parawixia dehaani), Neoscona oxancensis, Gasteracantha cancriformis (elipsoides),

Gasteracantha arcuata, Cyrtophora moluccensis, Cyrtophora parnasia, Dolophones conifera,

Dolophones turrigera, kolczasty pająk Doria (Gasteracantha doriae), Gasteracantha Mamosa,

Cyrtophora exanthematica, Aculeperia ceropegia, Eriophora pustulosa, Anepsion depressium,

Gasteracantha quadrispinosa, Eriophora transmarina, Araneus bicentenarius, baloniasty pająk

Nephila maculata, Gasteracantha hasseltii, Tegenaria atria, Heurodes turrita, Cyclosa insulina,

Astracantha minax, Araneus mitificus, Eriovixia laglaisei, Nephilengys malabarensis, Argiope

versicolor, Herennia omatissima, Argiope aemula, Cyrtophora unicolor, Cyrtophora hirta,

Argiope keyserlingi, Acusilas coccineus, pająk srebrny (Argiope argentata), Gasteracantha

cancriformis, Neoscona domiciliorum, Argiope aetheria, Argiope Keyserlingi, Foltys

illepidus, Arkys clavatus, Arkys lancearius, pająk dwukolczasty (Poecilopachys australasia),

gatunki Nephila, np., Nephila clavipes, Nephila senegalensis, Nephila madagascariensis i

dużo więcej (kolejne gatunki pająków, patrz również poniżej). Najkorzystniej, białka nici

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

8

pajęczej (ang.dragline) pochodzą z Araneus diadematus a białka wiciowate (ang. flagelliform)

pochodzą z Nephila clavipes.

[0034] W kontekście niniejszego wynalazku, powinno być jasne, że rekombinowane białko

jedwabiu pajęczego może zawierać nie tylko sekwencje białka z jednego gatunku, lecz

również sekwencje pochodzące z różnych gatunków pająka. Przykładowo, jedna lub więcej

syntetycznych sekwencji powtórzeniowych białka jedwabiu pajęczego może pochodzić z

jednego gatunku, jedna lub więcej oryginalnych autentycznych niepowtórzeniowych

sekwencji białka jedwabiu pajęczego z innego. Jako kolejny przykład, możliwe jest również

zaprojektowanie rekombinowanego białka jedwabiu pajęczego, które zawiera więcej niż

jeden typ sekwencji powtórzeniowej, przy czym różne typy pochodzą od różnych gatunków.

[0035] Zgodnie z korzystną realizacją, białko nici (ang. dragline) jest dzikim typem ADF-3,

ADF-4, MaSp I, MaSp II a białkiem flagelliny jest FLAG. Termin ADF-3/-4 zastosowano w

kontekście białek MaSp produkowanych przez Araneus diadematus (Araneus diadematus

fibroin-3/-4). Oba białka, ADF-3 i -4 należą do klasy białek MaSp II (białka spidroiny II, ang.

major ampullate spidroin II).

[0036] W kolejnej realizacji, zastosowaną sekwencją kwasu nukleinowego jest ADF-3 (SEQ

ID NO:1) i/lub ADF-4 (SEQ ID NO:2) lub ich wariant.

[0037] Wiadomo, że w wynalazku rozważane są dwa różne rodzaje ADF-3 i ADF-4

sekwencji kodujących oraz białek: po pierwsze, opublikowana już sekwencja ADF-3 i ADF-4

(tutaj: sekwencja „dzikiego typu”) oraz, po drugie, ich wariant, kodowany przez SEQ ID NO:

1 (ADF-3) oraz 2 (ADF-4). Sekwencje dzikiego typu zostały już opublikowane i są dostępne

pod numerem przyjęcia U47855 oraz U47856 (SEQ ID NO: 8 i 9).

[0038] Kolejnymi białkami jedwabiu pajęczego, które mogą być zastosowane w niniejszym

wynalazku (tj. pojedynczo lub w kombinacji z innymi białkami) oraz ich numery przyjęcia w

bazie danych są następujące:

Spidroina 2 [Araneus bicentenarius]gi׀2911272

Główne białko 1 nici jedwabnej gruczołu przędnego, ang. major ampullate gland dragline silk

protein-1 [Araneus ventricosus] gi׀27228957

Główne białko 2 nici jedwabnej gruczołu przędnego, ang. major ampullate gland dragline silk

protein-2 [Araneus ventricosus] gi׀27228959 ampullate spidroin 1 [Nephila

madagascariensis]gi׀13562006

Główne białko spidroiny 1, ang. Major ampullate spidroin 1 [Nephila senegalensis]

gi׀13562010

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

9

Główne białko spidroiny 1, ang. major ampullate spidroin 1 [Latrodectus geometricus

gi׀13561998

Główne białko spidroiny I, ang. major ampullate spidroin I [Argiope trifasciata] gi׀13561984

Główne białko spidroiny I, ang. major ampullate spidroin I [Agriope aurantia] gi׀13561976

Białko niciowe spidroiny 2, ang. dragline silk protein spidroin 2 [Nephila clavata]

gi׀16974791

Główne białko spidroiny 2, ang. major ampullate spidroin 2 [Nephila senegalensis]

gi׀13562012

Główne białko spidroiny 2, ang major ampullate spidroin 2 [Nephila madagascariensis]

gi׀13562008

Główne białko spidroiny 2, ang major ampullate spidroin 2 [Ladrodectus geometricus]

gi׀13562002

[0039] Zgodnie z inną, korzystną realizacją, białkiem typu wiciowatego (ang. flagelliform)

jest SEQ ID NO: 6 (FlagN) oraz/lub SEQ ID NO: 7 (Flag-C) lub ich wariant.

[0040] Jednakże, mogą być zastosowane również znane już i opublikowane sekwencje białek

wiciowatych, w szczególności następujące:

sekwencja białka jedwabiu: Flagelliform silk protein partial cds [Nephila clavipes]gi׀2833646

oraz białka Flagelliform silk protein partial cds [Nephila clavipes]gi׀2833648

[0041] W jednej z korzystnych realizacji, rekombinowane białko jedwabiu pajęczego zawiera

jedną lub więcej syntetycznych sekwencji powtórzeniowych zawierających jedną lub więcej

konsensowych sekwencji zawierających polialaninę. Wspomniane polialaninowe sekwencje

mogą zawierać od 6 do 9 reszt alaninowych. Patrz, na przykład SEQ ID NO: 1, zawierająca

kilka motywów polialaninowych z 6 reszt alaniny.

[0042] Korzystnie, sekwencja konsensusowa zawierająca polialaninę pochodzi z ADF-3 i

posiada sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 3 (moduł A) lub ich wariant. Moduł A

zawiera polialaninę posiadającą 6 reszt alaninowych. Kolejną korzystną sekwencją

konsensusową, zawierającą polialaninę, pochodzącą z ADF-4, jest moduł C (SEQ ID NO: 5),

zawierający 8 reszt alaninowych.

[0043] Zgodnie z kolejną korzystną realizacją, w rekombinowanym białku jedwabiu

pajęczego według wynalazku, syntetyczna sekwencja powtórzeniowa pochodzi z ADF-3 i

zawiera jedno lub więcej powtórzeń sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 4 (moduł Q) lub

ich wariant.

[0044] Ogólniej, syntetyczna sekwencja powtórzeniowa może również zawierać ogólne

motywy: GGX lub GPGXX, tj. regiony bogate w reszty glicyny. Jak wspomniano powyżej,

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

10

regiony te będą zapewniać białku elastyczność, a przez to również powierzchni utworzonej z

rekombinowanego białka jedwabiu pajęczego zawierającego wspomniane motywy.

[0045] Wiadomo, że specyficzne moduły dla syntetycznych jednostek powtórzeniowych do

zastosowania w niniejszym wynalazku mogą być również razem łączone, tj., moduły

(powtarzające się jednostki) łączące A i Q, Q i C itp. są również objęte niniejszym

wynalazkiem. Mimo że liczba modułów, które mogą być wprowadzone do białka pajęczego

jedwabiu nie jest ograniczona, korzystnie jest wykorzystać liczbę modułów syntetycznej

jednostki powtórzeniowej dla każdego rekombinowanego białka, która to liczba należy

korzystnie do przedziału od 5-50 modułów, korzystniej 10-40 i najkorzystniej między 15-35

modułami.

[0046] Syntetyczna sekwencja powtórzeniowa korzystnie zawiera jedną lub więcej (AQ) i/lub

(QAQ) jako jednostki powtórzeniowe. Nawet bardziej korzystnie, syntetyczną sekwencją

powtórzeniową jest (AQ)

12

, (AQ)

24

, (QAQ)

8

lub (QAQ)

16

.

[0047] W przypadku, gdy syntetyczna sekwencja powtórzeniowa pochodzi z ADF-4, może

korzystnie zawierać jedno lub więcej powtórzeń sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:5

(moduł C) lub jego wariant, jak wspomniano powyżej, w którym ogólną całkowitą

syntetyczną sekwencją powtórzeniową jest C

16

lub C

32

.

[0048] Korzystnymi realizacjami dla w pełni rekombinowanych białek jedwabiu pajęczego

według wynalazku są (QAQ)

8

NR3, (QAQ)

16

NR3, (AQ)

12

NR3, (AQ)

24

NR3, C

16

NR4 i

C

32

NR4 tj., białka, które zawierają lub składają się ze wspomnianych sekwencji.

[0049] Należy zauważyć, że powyższa konfiguracja syntetycznej sekwencji powtórzeniowej

(stosując układ A, Q i C), stosuje się również do wszystkich innych jednostek

powtórzeniowych ujawnionych powyżej, na przykład każda sekwencja zawierająca

polialaninę może być wzięta za A i/lub C i wszystkie sekwencje bogate w reszty glicyny

mogą być użyte jako Q.

[0050] Nowe moduły dla sztucznych, powtórzeniowych sekwencji pochodzących z sekwencji

białek wiciowatych są modułami K (SEQ ID NO: 35 i 36), sp (SEQ ID NO: 37 i 38), X (SEQ

ID NO: 39 i 40) oraz Y (SEQ ID NO: 41 i 42).

[0051] Sztuczna powtórzeniowa sekwencja również korzystnie zawiera lub składa się z Y

8

,

Y

16

, X

8

, X

16

, K

8

, K

16

.

[0052] Ponadto, możliwe jest również połączenie tych sekwencji pochodzących z ADF-3 i

ADF-4 oraz Flag w jedną rekombinowaną sekwencję.

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

11

[0053] W niniejszym wynalazku jednakże silnie preferowane jest wykorzystanie białek

jedwabiu pajęczego w etapie a) które zostały wybrane z lub zawierają sekwencje z grupy

sekwencji ADF-4 i ich pochodnych, włączając C

16

, C

16

NR4, C

32

i/lub C

32

NR4.

[0054] Zgodnie z kolejną realizacją, rozpuszczalnik w b) oraz/lub rozpuszczalniki

przynajmniej jednej dodatkowej fazy, wybrane są z grupy obejmującej rozpuszczalniki

hydrofilowe, korzystnie wodę, alkohole jak etanol, glicerol lub rozpuszczalniki lipofilowe,

korzystnie oleje naturalne, takie jak oleje pochodzenia roślinnego lub zwierzęcego, oleje

syntetyczne, takie jak migliol, olej silikonowy, rozpuszczalniki organiczne, takie jak

węglowodory aromatyczne, na przykład toluen, benzen, etc.

[0055] Należy zauważyć, że jedna pojedyncza faza może zawierać również więcej niż jeden

rozpuszczalnik (tj. mieszaninę) tak długo dopóki rozpuszczalniki te są istotnie identyczne.

„Istotnie identyczne” oznacza, że rozpuszczalniki posiadają podobne właściwości

rozpuszczalności, a zatem tworzą jedynie jedną wspólną fazę. W związku z powyższym,

„istotnie identyczne” rozpuszczalniki obejmują rozpuszczalniki, w których nie można

zaobserwować rozdzielonych faz po zmieszaniu rozpuszczalników. Przykładowo, dwa lub

więcej rozpuszczalniki lipofilowe mogą być połączone w jedną fazę, na przykład olej roślinny

(na przykład olej z oliwek i olej rycynowy) oraz migliol i/lub heksadekan. Ponadto, jako

alternatywa, faza hydrofilowa może zawierać dwa lub więcej składników hydrofilowych, na

przykład wodę, glicerol i tym podobne.

[0056] Jak wspomniano powyżej, wymagane jest jedynie aby układ emulsyjny do

otrzymywania nano- i mikrokapsułek według wynalazku posiadał przynajmniej dwie fazy,

przy czym fazy te są zasadniczo istotnie niemieszalne.

[0057] W etapie c) niniejszego wynalazku mogą być wykorzystane dobrze znane typy

emulsji, na przykład rodzaje emulsji W/O, O/W, O/W/O lub W/O/W. Wspomniane typy

emulsji są dobrze znane w dziedzinie, pozostałe informacje znajdują się w podanym tytułem

referencji „Remington’s Pharmaceutical Science”, Mack Publishing Co., Easton, PA, ostatnie

wydanie lub inne dostępne informacje.

[0058] Korzystnym sposobem formowania emulsji według niniejszego wynalazku jest

otrzymywanie miniemulsji. Miniemulsje są układem zdyspergowanym o krytycznej

stabilności kropelek wielkości od 50 do 500 nm, otrzymanymi poprzez naruszenie układu

zawierającego olej, wodę, surfaktant i substancję hydrofobową. Polimeryzacja w takich

miniemulsjach, gdy ostrożnie prowadzona, daje w wyniku cząstki około takiej samej

wielkości jak początkowe kropelki. Oznacza to, że odpowiednie przygotowanie miniemulsji

zahamowuje koalescencję kropelek lub proces dojrzewania Ostwalda. Miniemulsje

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

12

przygotowuje się za pomocą silnie ścinających urządzeń, takie jak homogenizatory

ultradźwiękowe lub wysokociśnieniowe. W ramach odnośników literaturowych poleca się

publikacje K.Landfestera i współpracowników.

[0059] W przypadku emulsji typu W/O, faza W (hydrofilowa) tworzy kropelki emulsji i w

tym przypadku, białka jedwabiu pajęczego zawarte są w fazie W. Faza O jest fazą lipofilową i

tworzy fazę ciągłą.

[0060] W przypadku emulsji typu O/W, faza O (lipofilowa) tworzy kropelki emulsji i w tym

przypadku, białka jedwabiu pajęczego zawarte są w fazie O. Faza W jest fazą hydrofilową i

tworzy fazę ciągłą.

[0061] Surfaktanty zastosowane w powyższych emulsjach mogą być wybrane ze związków,

które specjalista w dziedzinie użyje w oparciu o dostępną wiedzę w dziedzinie farmacji i nauk

pokrewnych. Przykładowym wyborem surfaktantów do zastosowania do otrzymywania

niniejszych emulsji są estry kwasów tłuszczowych gliceroli, sorbitolu i innych alkoholi

wielofunkcyjnych, korzystnie, monostearynianu glicerolu, monolaurynianu sorbotanu lub

monolenianu sorbitanu; poloksaminy; etery polioksyetylenowe i estrypolioksyetylenowe;

triglicerydy etoksylowane; fenole etoksylowane i difenole etoksylowane; sole metali kwasów

tłuszczowych; sole metali siarczanów alkoholi tłuszczowych; sodowy siarczan laurylu oraz

sole metali sulfobursztyniany; polisorbaniany, korzystniej polisorbonian 20, 40, 60 i 80;

poloksamery, glikolepolioksyetylenowe; oraz mieszaniny wspomnianych substancji.

[0062] Jednakże, wyraźnie zauważono, że zastosowanie surfaktantu nie jest zasadniczą cechą

niniejszego wynalazku. Specjalista w dziedzinie posiada wiedzę o układach emulsyjnych,

które nie wymagają surfaktantów.

[0063] W korzystnej realizacji niniejszego wynalazku, rozpuszczalnik użyty w 1b) zawiera

ponadto jeden lub więcej czynników farmaceutycznych, środków kosmetycznych, produktów

spożywczych lub substancji dodawanych do żywności. W takim przypadku, jeden lub więcej

ze składników będzie zakapsułkowanych w sieci polimerowej, utworzonej na zetknięciu faz.

[0064] Jako alternatywa, możliwe jest również dodanie wyżej wymienionych środków do

fazy ciągłej, która nie zawiera białek pajęczego jedwabiu. W tym przypadku, nano- i

mikrokapsułki według wynalazku będą pokryte wspomnianymi środkami.

[0065] Jako kolejna alternatywa, środki mogą być wprowadzone do nano- i mikrokapsułek

według wynalazku po uzyskaniu ich zgodnie z niniejszym sposobem.

[0066] Można tego dokonać poprzez spęcznienie membrany określonymi rozpuszczalnikami i

pozostawienie aby substancja zawarta w kapsułce (środek czynny) uległa dyfuzji do środka.

Spęcznienie może być również osiągnięte poprzez zastosowanie temperatury, ciśnienia lub

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

13

nie tylko rozpuszczalników, ale również innych środków chemicznych (takich jak czynniki

chemiczne, pH i inne).

[0067] Możliwe jest również włączenie substancji zakapsułkowanej do membrany. Takie

podejście może dać zmienione lub polepszone właściwości uwalniania, niż stosowanie

substancji zawartej w środku kapsułki.

[0068] Rodzaj środka dodatkowo włączonego do nano- i mikrokapsułek według wynalazku

nie jest w żaden sposób ograniczony.

[0069] Na przykład, czynnik farmaceutyczny może być wybrany z grupy zawierającej środki

przeciwbólowe; nasenne i uspokajające; leki do leczenia zaburzeń psychiatrycznych, takich

jak depresja i schizofrenia; przeciwpadaczkowe i przeciwdrgawkowe; leki do leczenia

choroby Parkinsona i Huntingtona, chorób związanych z procesem starzenia się i choroby

Alzheimera; leki ukierunkowane na leczenie urazu CNS lub udaru; leki do leczenia

uzależnienia i nadużywania leków; środki chemoterapeutyczne na infekcje pasożytnicze i

choroby wywołane przez mikroorganizmy; środki immunosupresyjne i leki przeciwrakowe;

substancje diagnostyczne o zastosowaniu w medycynie; środki immunoaktywne i

immunoreakcyjne; antybiotyki; środki przeciwspazmatyczne; leki przeciwhistaminowe;

zapobiegające mdłościom; relaksujące; pobudzające; mózgowo rozszerzające;

psychotropowe; rozszerzające i zwierające naczynia; leki przeciwko nadciśnieniu; leki

przeciwmigrenowe; nasenne, leki przeciw hiperglikemii i środki hiperglicemiczne;

przeciwastmowe; środki przeciwwirusowe; oraz ich mieszaniny.

[0070] Produkty spożywcze i substancje dodawane do żywności mogą być wybrane z grupy

obejmującej witaminy (kwas askorbinowy, octan tokoferolu i tym podobne), minerały (na

przykład wapń, magnez, sód), pierwiastki śladowe (selen), ekstrakty pochodzenia

naturalnego, oleje naturalne (olej z ryby) itp.

[0071] Środki kosmetyczne mogą być wybrane na przykład z octanu tokoferolu, olei

pochodzenia naturalnego lub syntetycznego, pantenolu, ekstraktów roślinnych, związków

absorbujących UV, środków dezynfekujących, środków łagodzących podrażnienia, środków

odstraszających owady.

[0072] Należy zauważyć, że środki mogą być obecne w rozpuszczalniku w postaci

rozpuszczonej, zawiesinie lub formie stałej. W ostatnim przypadku, dostarczony jest stały

rdzeń, opłaszczony przez białka jedwabiu pajęczego według niniejszego wynalazku.

[0073] W korzystnej realizacji, rozdzielenie sieci polimerowej na etapie e) dokonane jest za

pomocą wirowania lub poprzez zniszczenie emulsji utworzonej na etapie c) i utworzenie

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

14

roztworu jednofazowego. Jednakże, w celu rozdzielenia nano- i mikrokapsułek według

niniejszego wynalazku z układu emulsji mogą być zastosowane również inne sposoby.

[0074] Temperatura zastosowana w etapie b)-e) wynosi 5-40

°C, korzystnie 10-30 i

korzystniej temperatura pokojowa. Ph zastosowane w etapie b)-e) wynosi 3-9. korzystnie 5-8,

korzystniej 7.

[0075] Wielkość kropelek emulsji i pochodzących z niej nano- i mikrocząsteczek wynosi

korzystnie od 10 nm do 20

µm, korzystnie mieści się w przedziale między 500 nm a 10 µm,

najkorzystniej wynosi około 5

µm. Grubość ścianki otrzymanych nano- i mikrokapsułek

mieści się korzystnie w przedziale 5 do 100 nm, korzystniej między 10 a 70 nm (patrz

przykład Fig.5).

[0076] W drugim aspekcie, niniejszy wynalazek zapewnia nano- i mikrokapsułki uzyskiwane

za pomocą sposobu ujawnionego powyżej.

[0077] Trzeci aspekt niniejszego wynalazku ukierunkowany jest na kompozycję

farmaceutyczną zawierającą nano- i mikrokapsułki, jak zdefiniowano wyżej, oraz jeden lub

więcej z dopuszczalnych farmaceutycznie nośników. Zatem, aktywne składniki według

niniejszego wynalazku są korzystnie stosowane w takich kompozycjach farmaceutycznych w

dawkach wymieszanych z dopuszczalnym nośnikiem lub materiałem nośnikowym, które

pozwalają na leczenie lub przynajmniej złagodzenie schorzenia. Taka kompozycja może

(oprócz składnika aktywnego i nośnika) zawierać materiał wypełniający, sole, bufor,

substancje stabilizujące, środki zwiększające rozpuszczalność i inne materiały znane w stanie

techniki.

[0078] Termin „dopuszczalne farmaceutycznie” zdefiniowano jako materiał nietoksyczny,

który nie koliduje i nie wpływa negatywnie na skuteczność aktywności biologicznej składnika

aktywnego. Wybór nośnika zależy od zastosowania.

[0079] Kompozycja farmaceutyczna może zawierać dodatkowe składniki zwiększające

aktywność aktywnego składnika lub uzupełniające leczenie. Takie dodatkowe składniki i/lub

czynniki mogą stanowić część kompozycji farmaceutycznej, pozwalając na osiągniecie efektu

synergistycznego lub zminimalizowanie efektów ubocznych i niepożądanych skutków

podania kompozycji.

[0080] Techniki formulacji lub przygotowywania i zastosowania/podawania składników

według niniejszego wynalazku opublikowano w „Remington’s Pharmaceutical Science”,

Mack Publishing Co., Easton, PA, najnowsze wydanie (patrz również jak powyżej).

Odpowiednie zastosowanie może obejmować na przykład podanie doustne, doskórne lub

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

15

błony śluzowe i podanie pozajelitowe, włączając zastrzyki domięśniowe, podskórne,

doszpikowe, jak również wstrzyknięcie dooponowe, bezpośrednio dokomorowe, dożylne,

wewnątrzotrzewnowe lub wewnątrznosowe.

[0081] W czwartym aspekcie, niniejszy wynalazek zapewnia produkt kosmetyczny lub

żywnościowy zawierający nano- i mikrokapsułki, zgodnie tym, jak opisano powyżej.

[0082] Wynalazek został zilustrowany następnie towarzyszącymi mu figurami, na których:

Na Figurze 1 przedstawiono (a) dynamiczne rozproszenie światła hydrodynamicznego

promienia peptosomu R

H

w funkcji stężenia NaCl i pH. (b) Schematyczne przedstawienie

peptosomu i zmian jego wielkości w funkcji pH w wyniku spowodowane zwinięciem i

przejściem do drugorzędowej struktury

α-helisy w części peptydu.

Na Figurze 2 przedstawiono schematycznie proces tworzenia torebek/balonów pajęczych. (A)

Wodna zawiesina białka jest emulsyfikowana w toluenie. (B) Białko ulega adsorbcji na

powierzchni styku faz woda-toluen i ulega denaturacji tworząc sieć polimerową (Inset). (C)

Po adsorpcji, sieć białkowa może zostać przeniesiona do wody poprzez odwirowanie.

Ostateczne struktury typu torebki/balony posiadają wodę wewnątrz i wodę po zewnętrznej

stronie. (D) Alternatywnie, po adsorpcji, białkowa sieć może być przeniesiona do

jednofazowego roztworu poprzez dodanie etanolu.

Na Figurze 3 przedstawiono obraz torebek/balonów pajęczych w (A) toluenie/etanolu (50:50)

oraz (B) po przeniesieniu do wody.

Na Figurze 4 przedstawiono obraz torebek/balonów pajęczych wypełnionych znakowanym

FITC dekstranem (MW 500 kDa) po przeniesieniu do ciągłej fazy wodnej: (A) obraz na

jasnym polu. (B) obraz fluorescencyjny.

Na Figurze 5 przedstawiono wysuszone torebki/balony pajęcze na obrazie SEM. Grubość

membrany określono jako mniejszą niż 70 nm.

Przykłady:

Preparacja białka

[0083] Roztwór białka, z którego utworzone były pajęcze balony został otrzymany w wyniku

początkowego rozpuszczenia rekombinowanego białka pajęczych jedwabnych nici (C

16

, patrz

Huemmerich et al., 2004) w stężeniu 10 mg/ml w 6M tiocyjanianie guanidyny. Roztwór

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

16

białka schłodzono do 4

°C i obniżono stężenie tiocyjanianu guanidyny do poniżej 1 mM

poprzez dializę roztworu białka wobec 10 mM buforu Tris, pH 8.0 przez noc z użyciem

worków dializacyjnych z Carl Roth GmbH o rozmiarze cząsteczkowym 14 kDa. Usunięto

poprzez odwirowanie dializowanego roztworu niezdyspergowane białko, przez 30 minut, przy

sile 100.000x g i utrzymywaniu roztworu w temperaturze 4

°C. Końcowe stężenie roztworu

białka określano stosując adsorpcję UV, z wykorzystaniem współczynnika absorpcji

właściwego dla białka 0.859, przy długości fali 276 nm.

Formowanie torebek/balonów

[0084] Torebki/balony pajęczego jedwabiu otrzymywano poprzez emulgowanie 5

µl

dializowanej zawiesiny białka w 300

µl toluenu przez 90 sekund (Figura 2A). Podczas

emulgowania, białko jedwabiu ulega adsorbcji i zmienia konformację swojej struktury na

powierzchni kropel emulsji, co daje w wyniku sieć polimerową, w której zakapsułkowane są

krople emulsji (Figura 2B). Torebki/balony z pajęczego jedwabiu zostały utworzone przy

użyciu zawiesin białka w zakresie stężenia od 1 do 6 mg/ml i tak krótkiego czasu

powstawania emulsji, jak 20 sekund. Wielkość powstałych torebek/balonów zależy od

wielkości kropelek emulsji.

[0085] Po utworzeniu, powłoki białkowe otaczające kropelki emulsji zostały przeniesione z

emulsji dwufazowej do roztworu jednofazowego. W efektywnym przeniesieniu otoczek

białkowych skuteczne są dwa sposoby. W pierwszym sposobie, 300

µl wody dodano do

toluenu w celu utworzenia podwarstwy wodnej. Otoczki białkowe otaczające kropelki wody

odwirowano z warstwy toluenowej do podwarstwy wodnej przy sile 100xg przez 4 minuty

(Figura 2C). W drugim sposobie, w celu rozpuszczenia toluenu i wody, utworzono

jednofazowy roztwór poprzez dodanie 300

µl etanolu do dwuwarstwowej emulsji (Figura

2D). Uzyskane struktury badano pod mikroskopem po zastosowaniu którejkolwiek metody

przeniesienia torebek/balonów do roztworu jednofazowego (Figura 3).

[0086] Integralność poddanej wirowaniu powłoki białkowej o kształcie balonu sprawdzano

poprzez dodanie 0.5 % wag., znakowanych FITC, 500 kDa dekstranu (Sigma-Aldrich) do

roztworu białka przed procesem wytwarzania emulsji. Po uzyskaniu emulsji i odwirowaniu,

powstałe, podobne do balonu struktury, wykazywały cały czas fluorescencję, co wskazywało

na to, że powłoka białkowa tych struktur nie została rozerwana podczas wirowania (Figura 4).

[0087] Chécot F, Lecommandoux S, Gnanou Y, Klok HA (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41,

1339

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

17

Chécot F, Lecommandoux S, Klok HA, Gnanou Y (2003) Euro. Phys. J. E 10, 25

Dinsmore AD, Hsu MF, Nikolaides MG, Marquez M, Bausch AR, Weitz DA. (2002)

Colloidosomes: Selectively permeable capsules composed of colloidal particles. Science

298(5595):1006-1009.

Y.-Y. Won, H. Davis, F. Bates, Science 283, 960 (1999)

Huemmerich D, Helsen CW, Quedzuweit S, Oschmann J, Rudolph R, Scheibel T (2004)

Primary structure elements of spider dragline silks and their contribution to protein solubility.

Biochemistry 43: 13604-12

Scheibel T (2004) Spider silks: recombinant synthesis, assembly, spinning, and engineering of

synthetic proteins, Microbial Cell Factories 3, 14

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

18

WYKAZ SEKWENCJI

[0088]

< 110> Uniwersytet Techniczny, Monachium

<120> Sposób otrzymywania nano- i mikrokapsułek

<130> P19184

<160> 55

<170> PatentIn Wersja 3.1.

<210> 1

<211> 653

<212> PRT

<213> Araneus diadematus

<400> 1

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

19

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

20

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

21

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

22

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

23

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

24

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

25

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

26

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

27

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

28

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

29

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

30

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

31

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

32

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

33

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

34

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

35

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

36

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

37

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

38

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

39

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

40

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

41

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

42

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

43

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

44

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

45

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

46

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

47

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

48

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

49

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

50

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

51

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

52

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

53

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

54

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

55

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

56

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

57

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

58

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

59

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

60

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

61

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

62

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób otrzymywania nano- i mikrokapsułek obejmujący etapy:

a) dostarczenia białek pajęczego jedwabiu;

b) utworzenie roztworu lub zawiesiny wspomnianych białek w odpowiednim

rozpuszczalniku;

c) otrzymanie emulsji o przynajmniej dwóch fazach; przy czym wspomniana emulsja

zawiera roztwór lub zawiesinę uzyskane w b) jako pierwszą fazę i przynajmniej jedną,

kolejną fazę, która jest istotnie niemieszalna ze wspomniana fazą pierwszą;

d) utworzenie sieci polimerowej białek jedwabiu pajęczego na styku powierzchni

przynajmniej dwóch faz;

e) rozdzielenie białkowej sieci polimerowej otrzymanej w (d) od emulsji.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białka jedwabiu pajęczego dostarczone w

a) wybrane są z grupy ADF-4 i ich pochodnych, włączając C16, C16NR4, C32,

C32NR4.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że rozpuszczalnik w b) oraz/albo

rozpuszczalniki przynajmniej jednej dodatkowej fazy wybrane są z grupy obejmującej

rozpuszczalniki hydrofilowe, korzystnie wodę i alkohol albo rozpuszczalniki

lipofilowe, korzystnie oleje naturalne lub oleje syntetyczne.

4. Sposób według jednego lub więcej z poprzednich zastrz., znamienny tym, że emulsja

utworzona w c) jest typu W/O, O/W, O/W/O albo W/O/W.

5. Sposób według jednego lub więcej z poprzednich zastrz., znamienny tym, że

rozpuszczalnik zastosowany w 1b) zawiera ponadto jeden lub więcej czynników

farmaceutycznych, środków kosmetycznych, produktów spożywczych lub dodatków

żywnościowych.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że czynnik farmaceutyczny występuje w

rozpuszczalniku w postaci rozpuszczonej, zawieszonej lub stałej.

7. Sposób według jednego lub więcej z poprzednich zastrz., znamienny tym, że

rozdzielenia sieci polimerowej w etapie e) dokonuje się poprzez zastosowanie

środków wirowania lub poprzez zniszczenie emulsji utworzonej w etapie c) i

uzyskanie roztworu jednofazowego.

8. Sposób według jednego lub więcej z poprzednich zastrz., znamienny tym, że

temperatura zastosowana w etapach b) – e) wynosi 5-40

°C, korzystnie 10-30 i

najkorzystniej jest temperatura pokojową, przy czym pH zastosowane w etapach b) –

e) wynosi 3-9, korzystnie 5-8, korzystniej 7.

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

63

9. Sposób według jednego lub więcej z poprzednich zastrz., znamienny tym, że wielkość

kropelek emulsji i pochodząca z nich nano- i mikrocząsteczek wynosi od 100 nm do

20

µm, korzystnie między 500 nm a 10 µm, najkorzystniej około 5 µm.

10. Sposób według jednego lub więcej z poprzednich zastrz., znamienny tym, że grubość

ścianki uzyskanych nano- i mikrokapsułek wynosi między 5 a 100 nm, korzystnie

miedzy 10 a 70 nm.

11. Nano- i mikrokapsułka uzyskana za pomocą sposobu według jednego lub wiecej

zastrz. od 1 do 10.

12. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca nano- i mikrokapsułki według zastrz. 11

oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

13. Produkt kosmetyczny lub żywnościowy zawierający nano- i mikrokapsułki według

zastrz. 11.

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

64

Figura 1: (a) dynamiczne rozpraszanie światła peptosomu o hydrodynamicznym

promieniu R

H

jako funkcja stężenia NaCl i pH. (b) schematyczne przedstawienie

peptosomu i jego zmian wielkości jako funkcja pH wywoływanych przez skręcanie do

drugorzędowej struktury α-helisy w części peptydu.

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

65

Figura 2: Schematyczne przedstawienie procesu tworzenie torebki / balonu pająka. (A)

wodna zawiesina białek jest emulgowana w toluenie. (B) białko adsorbuje na powierzchni

faz woda-toluen i ulega denaturacji tworząc sieć polimerową (Inset). (C) po adsorpcji sieć

białkowa może być przeniesiona poprzez odwirowanie do wody. Ostateczne struktury

torebki / balonu posiadają wodę w środku i wodę na zewnątrz. (D) alternatywnie, po

adsorpcji, sieć białkowa może być przeniesiona do jednofazowego roztworu poprzez

dodanie etanolu.

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

66

Figura 3: Obraz pajęczych torebek / balonów w (A) toluenie / etanolu (50:50) i (B) po

przeniesieniu do wody

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

67

Figura 4. Obraz pajęczych torebek / balonów wypełnionych dekstranem znakowanym

FITC (MW 500kDa) po przeniesieniu do wodnej fazy ciągłej: (A) obraz na jasnym tle. (B)

obraz fluorescencyjny

PZ/0505/RW

EP 1 757 276 B1

68

Figura 5: Suszone pajęcze torebki / balony zobrazowane w SEM. Grubość błony

określono na mniejszą niż 70nm.