Ogólne zasady
pobierania i
przygotowywania
próbek do
mikrobiologicznych
metod badawczych
Wykład 17
Ogólne zasady
pobierania i
przygotowywania
próbek do
mikrobiologicznych
metod badawczych
Wykład 17
!!! Według danych epidemiologicznych 1:10
osób rocznie przechodzi zatrucie
pokarmowe
Przyczyny wzrostu częstotliwości zatruć (1) :
•
okoliczności związane z pojawieniem się
nowych czynników zakaźnych takich jak np.:
Listeria monocytogenes; Campylobacter
jejeuni; Escherichia coli 0157:H7
•
zmiany adaptacyjne w znanych patogenach,
prowadzące do powstania szczepów
lekoopornych
•
zmiany demograficzne związane ze starzeniem
się populacji oraz wzrostem populacji o
obniżonej odporności na zakażenia
Przyczyny wzrostu częstotliwości zatruć (2) :
•
zmiany w przemyśle i technologii produkcji
oraz dystrybucji żywności
•
zmiany nawyków żywieniowych:
– spożywanie coraz większej liczby posiłków poza
domem
– powrotem do żywności naturalnej (przetworzonej
w minimalnym stopniu/ gotowej do spożycia)
Spada zainteresowanie konsumentów
żywnością stosunków trwałą
taką jak: susze/
konserwy/ koncentraty na korzyść żywności
przetworzonej w niewielkim stopniu, często
o wysokim stopniu mikrobiologicznego
zagrożenia
Przyczyny wzrostu częstotliwości zatruć (3) :
Nacisk na naturalność prowadzi do:
•
unikania konserwantów
•
obniżenia zawartości soli kuchennej i cukru
•
stosowanie minimalnej dawki cieplnej
•
unikanie temperatur zamrażalniczych
(skutecznie hamujących rozwój drobnoustrojów,
jednakże uszkadzających strukturę produktu)
======================================================================
==============================
!!! Żywność jest doskonałym
środowiskiem do rozwoju
mikroorganizmów
•
Ilość i rodzaj mikroorganizmów w
żywności zależy od warunków jej
pozyskiwania/ przetwarzania/
magazynowania/ dystrybucji
•
Zależnie od ww. czynników w żywności
występują/ mogą się namnażać/ mogą
być przenoszone przez żywność
różne
grupy mikroorganizmów:
•
BAKTERIE
•
DROŻDŻE
•
PLEŚNIE
•
WIRUSY
Źródła zanieczyszczeń, które rzutują na
stan mikrobiologiczny gotowych
artykułów żywnościowych:
•
Surowce pochodzenia roślinnego i
zwierzęcego
(warzywa/ owoce/ mięso różnych zwierząt/
mleko)
•
Woda
•
Stan higieniczny produkcji
(aparatura/ inne
urządzenia)
•
Personel
W trakcie przetwarzania surowca i procesu
technologicznego następuje redukcja lub
wzrost mikroorganizmów w produkcie:
•
Celem przetwórstwa jest taki dobór warunków
przetwarzania, aby znieść lub zahamować
wzrost i aktywność drobnoustrojów
saprofitycznych i chorobotwórczych
- obecność nadmiernej liczby drobnoustrojów
saprofitycznych może prowadzić do zepsucia
produktu
(efekt: zmiana smaku/ zapachu/ konsystencji/
barwy)
- występowanie mikroflory chorobotwórczej
dyskwalifikuje środki spożywcze ze względu na
bezpośrednie zagrożenie zdrowia konsumenta
Drobnoustroje, które mogą znajdować się w
poszczególnych rodzajach żywności i być przyczyną
zatruć pokarmowych :
•
Mięso surowe lub niedogotowane - Salmonella,
Campylobacter
•
Ryby surowe lub niedogotowane - Vibrio, wirusy
•
Żywność gotowana, wtórnie zanieczyszczona w czasie
przygotowań - Staphyloccocus aureus, Salmonella,
Shigella
•
Żywność gotowana, wtórnie zanieczyszczona przez
kontakt z surowcami - odzwierzęce Salmonella,
Campylobacter
•
Żywność gotowana, przechowywana bez chłodzenia -
Clostridium perfringens, Bacillus cereus
•
Żywność gotowana, długo przechowywana w niskiej
temperaturze - Listeria monocytogenes, Yersinia
enterocol.
•
Żywność gotowana, długo przechowywana w warunkach
beztlenowych - Clostridium botulinium
•
Żywność niedosterylizowana - Clostridium botulinium
•
Produkty fermentowane o nieprawidłowej przerwanej
fermentacji - Staphyloccocus aureus
!!! Produkcja żywności bezpiecznej dla
zdrowia wymaga ścisłego przestrzegania:
•
parametrów procesu technologicznego
•
wysokiej higieny produkcji
•
wnikliwej kontroli mikrobiologicznej
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Nadzór nad obrotem żywności w Polsce, a w
szczególności nad jej jakością zdrowotną
opiera się na działaniu dwu podstawowych
systemów kontroli:
•
Systemie kontroli wewnętrznej:
– zależnej od producenta
– prowadzonej w zakładzie
– opartej na systemie normy ISO 9000
– opartej na ocenie zagrożeń wynikających z
krytycznych punktów kontroli (HACCP)
•
Systemie kontroli zewnętrznej:
– system niezależny od producenta
W zakresie zewnętrznego systemu kontroli
ustawowy nadzór nad jakością zdrowotną
żywności w Polsce sprawują:
•
Państwowa Inspekcja Sanitarna
- podległa
Ministrowi Zdrowia - w osobie Głównego
Inspektora Sanitarnego (
działająca na terenie kraju
poprzez Stacje Sanitarno - Epidemiologiczną
)
•
Weterynaryjna Inspekcja Sanitarna
-
podległa Ministerstwu Rolnictwa i Rozwoju
Wsi
Organa Inspekcji Sanitarnej pobierają
próby w ramach:
•
bieżącej kontroli stanu sanitarno-
higienicznego obiektów
•
podejrzenia o niewłaściwą jakość
zdrowotną oraz nieprawidłową deklarację
lub oznakowanie produktu
•
w związku z interwencją konsumenta
•
w celu oceny prawidłowości przebiegów
procesów produkcyjnych
•
w celu oceny jakości zdrowotnej partii
towarów z importu oraz partii towarów
przeznaczonych na eksport
Akty prawne stanowiące podstawę poboru
prób do badań laboratoryjnych
(1)
:
•
Ustawa z dnia 11 maja 2001 r. o warunkach
zdrowotnych żywności i żywienia
(z późniejszymi
zmianami)
– Rozporządzenie Ministra Zdrowia w sprawie
pobierania i przechowywania próbek żywności
przez zakłady żywienia zbiorowego
– Rozporządzenie Ministra Zdrowia
(13 styczeń 2003
r.)
w sprawie maksymalnych poziomów
zanieczyszczeń chemicznych i biologicznych, które
mogą znajdować się w żywności, dozwolonych
substancjach dodatkowych i pomagających w
przetwarzaniu albo na powierzchni żywności -
określa wymogi mikrobiologiczne
, jakie
powinny spełniać produkty żywnościowe
Akty prawne stanowiące podstawę
poboru prób do badań
laboratoryjnych
(2)
:
•
Ustawa z dnia 24 kwietnia 1997 r. o
zwalczaniu chorób zakaźnych zwierząt
rzeźnych i mięsa oraz Inspekcji
Weterynaryjnej
(z późniejszymi zmianami)
– Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i
Rozwoju Wsi w sprawie badań kontrolnych
pozostałości chemicznych, biologicznych,
leków i skażeń promieniotwórczych u
zwierząt żywych, w tkankach lub narządach
zwierząt po uboju i w produktach
spożywczych pochodzenia zwierzęcego
Akty prawne stanowiące podstawę
poboru prób do badań laboratoryjnych
(3)
:
•
Ustawa z dnia 21 grudnia 2000 r. o jakości
handlowej artykułów rolno-spożywczych
(z
późniejszymi zmianami)
– Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju
Wsi w sprawie szczegółowych warunków
pobierania artykułów rolno-spożywczych
– Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju
Wsi w sprawie szczegółowych wymagań
jakości handlowej tusz wieprzowych
– Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju
Wsi w sprawie metod analiz niektórych
przetworów z wieprzowiny
Wymogi mikrobiologiczne, jakie powinny
spełniać produkty żywnościowe:
•
Wyszczególniono środki spożywcze i rodzaje
drobnoustrojów, które mogą w tych
środkach występować i które należy badać
•
Poziom zanieczyszczeń mikrobiologicznych
określono za pomocą dwóch wartości
M
i
m
– M
- oznacza akceptowaną wartość progową,
powyżej której wyniki są dyskwalifikowane
– m
- oznacza wartość równą lub poniżej której
wszystkie wyniki uznawane są za zadawalające
– Określono liczbę próbek (
n
), które należy badać
w danej partii a także liczbę próbek (
c
) z partii
dających wynik pomiędzy
M
i
m
Dyrektywy Unii Europejskiej oraz dokument
Kodeksu Żywnościowego FAO/WHO określają
parametry jakości mikrobiologicznej:
Wyniki badań mikrobiologicznych należy
oceniać następująco:
– stosując trzy kategorie wartości, tzn.:
• do wartości m włącznie
• pomiędzy m i M
• powyżej wartości M
– stosując jedną kategorię wartości zapisaną w
tabelach jako m, od których nie ma odstępstwa,
niezależnie od liczby badanych próbek
– stwierdzenie nieobecności w stosunku do bakterii
z rodzaju Salmonella jest wynikiem
zadawalającym
!!! Zdrowie konsumenta chronione jest
specjalnymi przepisami tzw. NORMAMI
•
Normalizacją metod badawczych, sposobów
pobierania próbek zajmują się zarówno
międzynarodowe jak i regionalne
organizacje normalizacyjne
•
Polski Komitet Normalizacyjny czynnie
uczestniczy w pracach Komitetu
Technicznego
•
PKN na bieżąco wprowadza do zbioru
Polskich Norm normy ISO i EN dotyczące
mikrobiologii żywności i pasz oraz metod
badania skuteczności działania chemicznych
środków dezynfekcyjnych i antyseptycznych
Celem analizy mikrobiologicznej żywności jest:
– ustalenie poziomu ogólnej liczby drobnoustrojów
saprofitycznych
– ocena stanu sanitarnego żywności za pomocą
wskaźnikowych bakterii z grupy coli i Escherichia
coli
– badanie obecności bakterii chorobotwórczych w
celu orzeczenia, czy badana żywność nie zagraża
zdrowiu konsumenta
Analizę mikrobiologiczną poprzedza:
– pobranie próby i opis cech zewnętrznych i
organoleptycznych
– przygotowanie próby do analizy mikrobiologicznej
– ocena mikroflory na podstawie preparatu
mikroskopowego
!!! Podstawowym dokumentem dla wszystkich
laboratoriów badających środki spożywcze
jest norma ISO 7218:1996, wprowadzona do
zbioru Polskich Norm jako PN-ISO
7218:1998 ze zmianą A1:
Mikrobiologia
żywności i pasz - Ogólne zasady badań
mikrobiologicznych
•
Norma podaje ogólne instrukcje
przeprowadzenia badań mikrobiologicznych w
celu zapewnienia jakości badań oraz
ujednolicenia pracy i wdrożenia zasad GLP
(Dobrej Praktyki Laboratoryjnej)
we wszystkich
laboratoriach badania żywności i pasz
•
Norma ta może być wykorzystywana w całości
lub część do akredytacji laboratorium
Pobieranie próbek
(1)
:
•
Pobieranie próbek nie jest częścią ogólnych
zasad mikrobiologicznych
•
Zagadnienia te precyzują odpowiednie
normy odnoszące się do poszczególnych
grup produktów spożywczych
•
Jeżeli laboratorium nie stosuje
znormalizowanych metod pobierania próbek,
to powinna zostać w laboratorium
opracowana i udokumentowana
(opisana)
własna procedura pobierania próbek,
zawierająca tzw.
strategie pobierania
(miejsce/ czas/ liczba/ dobór obiektów/
interpretacja wyników/ itp. )
Pobieranie próbek
(2)
:
•
Parametry techniczne pobierania próbek
(rodzaj
próbnika/ trwałość/ odzysk z matrycy)
powinny być
określone w procesie walidacji danej metody
analitycznej
Cel pobierania i przygotowywania próbek do
badań mikrobiologicznych:
•
otrzymanie reprezentatywnej próbki, której
właściwości mikrobiologiczne będą odpowiadały
właściwościom badanego półproduktu lub
produktu
•
próbki powinny być pobierane losowo w sposób,
który uniemożliwia ich wtórne zanieczyszczenie
(losowy dobór próbek pozwala unikać błędów systematycznych/
zastosowanie rachunku prawdopodobieństwa pozwala oszacować
błąd przypadkowy)
Pobieranie próbek
(3)
:
•
Wszystkie czynności związane z
pobieraniem próbek powinny być wykonane
przez osobę przeszkoloną w zakresie
pobierania próbek do oceny
mikrobiologicznej
•
Przyrządy do pobierania muszą być czyste/
suche/ jałowe
•
Pobieranie próbek powinno być dokonywane
w sposób jałowy (zabezpieczający próbki
przed przypadkowym zanieczyszczeniem
mikrobiologicznym pod wpływem warunków
zewnętrznych)
Pobieranie próbek
(4)
:
Transport próbek do laboratorium:
•
powinien odbywać się w ściśle określonych
warunkach zabezpieczających produkt przed:
– zanieczyszczeniem
– zmianami rodzajów i liczby drobnoustrojów zanim
próbka zostanie poddana badaniu
Istotne jest zachowanie odpowiedniej
temperatury przechowywania produktów:
•
produkty stałe - temperatura pokojowa
•
produkty świeże i chłodzone: 0-4
o
C
•
produkty pasteryzowane i podobne: 0-4
o
C
•
produkty mrożone i nisko mrożone: -18
o
C
Pobieranie próbek
(5)
:
•
Dokumentacja przyjętych próbek
prowadzona w sposób, aby można było
skontrolować cały przebieg analizy
Protokół z pobrania powinien uwzględniać (A) :
•
nazwę i adres jednostki zlecającej badania
•
cel pobrania próbek:
• a) czy na podstawie badania ocenia się partię wyrobu
• b) czy pobiera się próbki, ponieważ partia wyrobu
wydaje się podejrzana
• c) czy znając dostawcę chce się wyrywkowo
potwierdzić deklarowaną jakość
• d) czy pobiera się próbki w trakcie procesu
produkcyjnego celem nadzorowania stanu higieny dla
osiągnięcia i realizowania dobrej praktyki produkcyjnej
Protokół z pobrania powinien uwzględniać (B) :
•
identyfikator próbki
(próbek)
nadany przez
próbkobiorcę lub numer serii wyrobu
•
datę i miejsce pobrania
•
istotne okoliczności pobrania
(z podaniem możliwych
czynników zakłócających późniejsze badanie laboratoryjne)
•
badane czynniki/ składniki próbki
•
nazwisko i podpis osoby pobierającej próbkę,
oraz nazwiska osób współuczestniczących w
pobieraniu próbek,
np. ze strony klienta
•
sposób transportu i przechowywania w
laboratorium
•
datę (godzinę) przyjęcia próbki do
laboratorium
Protokół z pobrania powinien uwzględniać (C) :
•
stan próbki w chwili przyjęcia do
laboratorium
(np. uszkodzenia/ w normie)
•
nazwisko i podpis pracownika przyjmującego
próbkę i wykonującego analizę
•
datę wykonania analizy i metodę badania
•
identyfikator raportu z badań
==================================================================
=======================
Zabezpieczenie próbki oczekującej na
wykonanie badań zabezpieczające przed
zmianą liczby drobnoustrojów:
•
szczególną uwagę należy zwrócić na
temperaturę przechowywania
(j.w.
) i
ostateczny termin badania
•
produkty trwałe: najwcześniej jak to jest
możliwe i przed upływem terminu trwałości
•
produkty świeże i chłodzone: w ciągu 24
godzin od przyjęcia próby do badania
- jeżeli nie można uniknąć dłuższego
przechowywania, próbkę należy zamrozić
jak najszybciej w temperaturze poniżej
-18
o
C, i zaznaczyć to w sprawozdaniu z
badań, ponieważ w pewnych produktach
zamrażanie może zmienić skład mikroflory
•
produkty pasteryzowane i podobne:
najszybciej jak to jest możliwe i przed
upływem terminu trwałości
Przygotowywanie próbek
(1)
:
!!!Ogólne zasady przygotowywania zawiesiny
wyjściowej i rozcieńczeń dziesięciokrotnych
zostały ujęte w normie PN-EN ISO 6887-
1:2000:
Mikrobiologia żywności i pasz -
Przygotowywanie próbek, zawiesiny wyjściowej i
rozcieńczeń dziesięciokrotnych do badań
mikrobiologicznych - Ogólne zasady
przygotowywania zawiesiny wyjściowej i
rozcieńczeń dziesięciokrotnych
•
Większość produktów wymaga, przed
wykonaniem posiewów odpowiedniego
rozcieńczenia, a produkty stałe dodatkowo
rozdrobnienia
(odważanie/ dodanie rozcieńczalnika
(właściwy + jałowy)/ mieszanie/ homogenizacja)
Przygotowywanie próbek
(2)
:
•
Wszystkie czynności wstępne przed wysiewem
powinny być wykonane w warunkach
aseptycznych, zapobiegających zanieczyszczeniu
produktu poprzez sprzęt i otoczenie
Ocena w preparacie mikroskopowym:
•
Do obserwacji mikroskopowych
(w zależności od rodzaju
produktu)
sporządza się:
– preparaty odciskowe barwione (np. ryby/ wędliny)
bezpośrednio z produktu lub z osadu po odwirowaniu
próby (napoje)
– preparaty po homogenizacji
(w preparatach trwałych określa się łącznie komórki żywe i
martwe)
Wykrywanie i oznaczanie
drobnoustrojów
(1)
:
•
W celu jak najszybszej i pełnej identyfikacji
drobnoustrojów konieczne jest stałe
doskonalenie metod ich wykrywania i
ilościowego oznaczania
(stale udoskonala się i
opracowuje nowe metody badawcze)
•
!!! Metody badawcze podlegają
normalizacji
•
Ujednolicenie metod badawczych
umożliwiających wykrycie, identyfikacje i
oznaczenie liczby drobnoustrojów w
określonej ilości próbki środka spożywczego
znajdują się w szczegółowych normach
Wykrywanie i oznaczanie
drobnoustrojów
(2)
:
Opis metody wykonania
(zawarty w odpowiedniej normie):
•
określoną ilość produktu lub jego rozcieńczenia
miesza się z 9-krotną objętością (ml) płynnej
wybiórczej lub selektywnej pożywki płynnej
•
inkubuje się w odpowiedniej temperaturze -
hodowlę płynną przesiewa na podłoże różnicujące
pożywki agarowej
(tak aby otrzymać pojedyncze kolonie)
•
do dalszej identyfikacji wybiera się kilka kolonii
(na ogół 5)
•
zaleca się: stosowanie bulionów odżywczych celem regeneracji
uszkodzonych kolonii/ kilku różnych pożywek wybiórczych lub
selektywnych - płynnych i stałych
Wykrywanie i oznaczanie
drobnoustrojów
(3)
:
•
W zależności od obecności lub nieobecności
poszukiwanych drobnoustrojów
wynik
podaje
się jako : obecne lub nieobecne w
analizowanej ilości
(mililitrach - produkt płynny)
lub (gramach - inne produkty)
!!! Uzyskane wyniki nie można uogólniać na
inne wyższe ilości produktu
•
Tradycyjne, klasyczne metody identyfikacji i
określenia ilości drobnoustrojów oparte są na
metodach:
– bezpośrednich - mikroskopowych
– pośrednich - hodowlanych
Wykrywanie i oznaczanie
drobnoustrojów
(4)
:
•
Tradycyjne metody są pracochłonne i
czasochłonne, gdyż wynik oznaczenia
uzyskiwany jest po ok. tyg.
•
Współcześnie, coraz częściej stosuje się metody,
które pozwalają na skrócenie czasu badania
(czas
analizy nie powinien przekraczać 24 godzin/ preferuje się
metody, w których wynik uzyskuje się po 2-3 godzinach)
Szybkie metody (I) :
– immunologiczne
– molekularne (np. PCR)
– bioluminescencja
– wykrywanie ATP, itp.
Szybkie metody (II) :
Wprowadzenie do rutynowej kontroli
szybkiej metody badań mikrobiologicznych
jest uzależnione od kilku parametrów:
– możliwości uzyskania szybkiego wyniku
(najlepiej
po 30 minutach do 2 godzin)
– wysokiej czułości
(możliwości wykrycia niewielkiej
ilości mikroorganizmów lub ich toksyn)
– poniesienia możliwie niskich kosztów
– możliwości dokonania obiektywnego odczytu
wyniku
(za pomocą odpowiedniej aparatury)
– łatwość procedur
(mała pracochłonności)
– możliwość zautomatyzowania badań
– możliwość eliminacji wyników fałszywie (+) i (-)
Szybkie metody (III) :
•
Zastosowanie nowych metod wymaga
przeprowadzenia wielu badań w celu
lepszego i pełniejszego wykorzystania ich
w mikrobiologii
•
Metody te przeważnie nie są uznawane
urzędowo i są tylko częściowo
znormalizowane
•
W przyszłości szybkie metody
najprawdopodobniej będą stanowić
podstawę szybkiej identyfikacji
czynników etiologicznych zatruć
pokarmowych
Obecne zagrożenia mikrobiologiczne w
produkcji i przechowywaniu żywności to
między innymi :
•
Powstawanie nowego rodzaju żywności
•
Rozpowszechnienie produktów spożywczych z
innych stref klimatycznych
•
Zmiany metabolizmu samych drobnoustrojów
===================================================================================
====================
!!! Konieczne jest
(w celu ochrony zdrowia konsumenta i
zapewnienia bezpieczeństwa żywności)
opracowanie
wspólnych norm w zakresie:
•
specyficznych zasad pobierania próbek i
przygotowywania rozcieńczeń do badań produktów
mięsnych, rybnych i mleczarskich
•
horyzontalnych metod wykrywania i identyfikacji
drobnoustrojów
•