MOHSEN HAJHEIDARI1, MOHAMMAD ABDOLLAHIAN-NOGHABI2, HOSSEIN
ASKARI1,
MANZAR HEIDARI1, SEYED Y. SADEGHIAN2, ERIC S. OBER3 AND GHASEM
HOSSEINI SALEKDEH1

PROTEOMICS 2005, 5, 950–960

Proteome analysis of sugar

beet leaves under

drought stress

WSTĘP



Susza

jest głównym czynnikiem hamującym

wydajność upraw buraka cukrowego (Beta vulgaris

L.). Mimo, że rośliny zbożowe są bardziej podatne na

niedobór wody to i tak powoduje poważne szkody w

uprawie buraka cukrowego w Wielkiej Brytanii oraz

Iranie.



Niedobór wody występuje kiedy wskaźnik transpiracji

jest większy od wskaźnika pobierania wody przez

roślinę. Zjawisko to jest dodatkowo potęgowane przez

zasolenie gleby oraz wysoką temperaturę powietrza.

Dochodzi wówczas do obniżenia potencjału wody,

obniżenia zawartości wody w komórce oraz zamykania

komórek szparkowych i zmniejszenia asymilacji CO2.

w konsekwencji roślina magazynuje mniej cukru w

korzeniach



Ekspozycja roślin na czynnik stresowy powoduje

szeroki zakres odpowiedzi w całej roślinie, na poziome

komórkowym oraz molekularnym.



Zmiany dotyczyły białek zaangażowanych w

odpowiedź na stres, detoksykację, zwijanie białek,

degradację białek oraz białek nie powiązanych

bezpośrednio ze stresem.



Głównym celem rośliny odpowiadającej na czynnik

stresowy jest utrzymanie homeostazy, pozbycia się

elementów toksycznych(detoksykacja) oraz

regeneracja.



Wcześniejsze badania prowadzone na ryżu, kukurydzy

czy dzikim arbuzie wykazują, że susza ma wpływ na

szeroką gamę szlaków metabolicznych: poczynając od

fotosyntezy do lignifikacji.

CELE BADANIA

Ilościowo określić zmiany w proteomie liścia buraka

cukrowego porównując grupę kontrolną i rośliny

wyeksponowane na stres suszy

Określić stopień zmian genetycznych w odpowiedzi na suszę na

poziomie molekularnym mierząc ilościowo oraz jakościowo

zmiany w proteomie dwóch genotypów buraka cukrowego

Głównym celem badania była ostateczna identyfikacja

genu dla MAS, aby poprawić tolerancję na suszę oraz

zwiększyć efektywność wykorzystania wody.

MAS

Proces, w którym znacznik (morfologiczny,

biochemiczny lub oparty na zmienności

DNA/RNA) użyty jest do wyszukania

markerów genów powodujących odpowiedź

na zmiany wywołane przez czynnik nas

interesująy(np. wydajność, odporność na

choroby, odporność na stres abiotyczny)

Materiały i metody



Do badań użyto dwóch genotypów buraka

cukrowego: 7112 oraz 7219-P.69 w zagęszczeniu

100 000 roślin na hektar. Nasiona wysiano na

kwadratowych poletkach doświadczalnych w

trzech powtórzeniach



Wszystkie rośliny podlewano do stadium 4 liścia,

następnie podlewano już tylko grupę kontrolną



Próbki do badań zebrano po 157 dniach po

wysianiu



Podczas badań każda roślina w warunkach

kontrolnych oraz w warunkach stresu suszy

otrzymała odpowiedni: 935 i 380 mm wody

Materiał do badań



Do badań użyto 3 próbek;

I próba zawierała: blaszkę wyizolowaną z

ogonka liściowego oraz korony korzeniowe(100

losowo wybranych roślin) wysuszone w w 80◦C

przez 48h aż do uzyskania suchej masy.

II próba zawierała po ¼ liścia(10 losowo

wybranych roślin) niezbędnych do zbadania

względnej zawartości wody

III próba zawierała podobne morfologicznie

liście(10 losowo wybranych roślin), zastosowane

później do badań proteomicznych, które zostały

natychmiast zamrożone w ciekłym azocie

Ekstrakcja białek



Homogenizacja próbek i denaturacja białek:

ciekły azot, 10% TCA, 0,07 %DTT,



Liofilizacja osadu



Zawieszenie proszku w buforze rozpuszczającym

zawierającym 9 M mocznik, 4% CHAPS, 1% DTT ,

związki amfoteryczne, pH 3-10, Tris zasadowy



Określenie całkowitego stężenia białek metodą

ilościowej analizy Bradforda



Wykonanie IEF(ogniskowanie izoelektryczne)

oraz elekroforezy SDS-PAGE, wizualizacja białek

azotanem srebra oraz zabarwienie żelu kumazyną

Analiza obrazu i informacji

Analiza LC-MS/MS



Uzyskany rozdział białek na żelu

zeskanowano używając densytometru



Obróbka obrazu, detekcja „punktów”

białkowych, analiza ilościowa za pomocą
programu Melanie 3



20 białek pokazujących największe zmiany w
roślinie pod wpływem suszy wysłano do
analizy LC-MS/MS



Identyfikacja białek za pomocą programu
Mascot

Wyniki

Po 157 dniach po wysianiu w warunkach stresu suszy w

obu genotypach zaobserwowano mniejszą zawartość wody-
ok. 65% oraz mniejszą masę pędów- ok. 50%. Pod tym
względem rośliny nie różnią się miedzy sobą. Dopiero
analiza proteomiczna wykaże subtelne różnice niewidoczne
podczas badania suchej masy.



Podczas barwienia azotanem srebra
wykryto, powtarzalnie, ponad 500 punktów
białkowych. Z nich 77 wykazało znaczące
zmiany między proteomem obu genotypów a
grupą kontrolną grupy 7112 wywołane
deficytem wody



Porównując oba genotypy – 79 białek uległo

zmianie: stężenie 27 białek zwiększyło się;
stężenie 44 zmniejszyło się; 8 białek wykryto
tylko u roślin pod wpływem suszy

Figure 6. Abundance ratio of 71 individual leaf proteins in drought-stressed and well-

watered plants of 7219-P.69 and 7112 at 157 DAS. The
ratio is expressed as Ln (abundance in stressed plants/abundance in control plants). Abundance

data is from Table 2. Proteins were
grouped according to expression pattern: (a) only detected in 7112 genotype and upregulated

under stress, (b) upregulated in both genotypes,
(c) upregulated in 7219-P.69, (d) upregulated in 7112, (e) down-regulated in 7112, (f)

downregulated in 7219-P.69, (g) downregulated
in both genotypes.

Identyfikacja białek



Z 20 białek wysłanych do badania LC-MS/MS

udało zidentyfikować się 11, z czego:



2 białka wykryte tylko w roślinach poddanych stresowi
suszy: białko szoku cieplnego HSP oraz
przypuszczalna oksyreduktaza



8 białek o stężeniu wyższym : 2-cysteino
peroksyredoksyna( 2-Cys Prx), dysmutaza
ponadtlenkowa (SOD), kinaza nukleotydowo 2-
fosforanowa(NDPK), białko hipotetyczne, cztery
fragmenty Rubisco



1 białko o stężeniu niższym: przypuszczalnie
powstający kompleks białkowy α-NAC



Pozostałe 9 białek poddano interpretacji manualnej: detekcję białek uzyskano
dzięki porównaniu ich sekwencji z homologami innych białek



Opracowanie wyników

HSP- białka szoku cieplnego



Zidentyfikowano 2 rodzaje tych białek



Białko to syntetyzowane we wszystkich

tkankach wegetatywnych w odpowiedzi na
odwodnienie rośliny



HSP spełnia różnorodne funkcje w komórce:

działa jako molekularny chaperon, zmniejsza
wewnątrzkomórkowy poziom tlenu
reaktywnego, chroniąc w ten sposób
fotosystem PSII podczas stresu

Enzymy detoksykacyjne- SOD



Niskie stężenie reaktywnych form tlenu(ROS) wpływa
korzystnie na funkcjonowanie komórki, natomiast
podczas ataku patogenu lub suszy poziom ROS
podnosi się i może degradować lipidy, białka,
terpenoidy, węglowodany czy kwasy nukleinowe. Tym
zjawiskom przeciwdziałają enzymy detoksykacyjne



W komórkach buraka cukrowego obu genotypów
wykryto cytoplazmatyczną dysmutazę
ponadtlenkową( Cu-Zn SOD) o stężeniu dużo wyższym
niż w komórkach roślin kontrolnych, co jest
ewidentnym dowodem na to że ten enzym spełnia
ważna rolę w tolerancji suszy.

Enzymy detoksykacyjne- 2-Cys Prx



2-Cys Prx: 2-cysteino peroksyredoksyna jest

detoksykacyjnym enzymem katalizujacym w
chloroplastach nadtlenek wodoru, który dla
nich jest szczególnie niebezpieczny. Enzym ten
działa zarówno w warunkach normalnych jak i
podczas deficytu wody



W komórkach buraka cukrowego grupie roślin

badanych wykryto podwyższone stężenie tego
enzymu co świadczy o odpowiedzi
metabolicznej rośliny na czynnik stresowy.

Cyklofiliny



Cyklofiliny są białkami katalizującymi izomeryzację

cis/trans wiązania peptydowego. Proces ten odgrywa

ważną rolę w zwijaniu białek de novo i izomeryzacji

natywnych protein w licznych systemach komórkowych

związanych z transportem przez błony komórkowe



Jedną z cyklofilin wykrytych w komórkach buraka

cukrowego była izomeraza peptydylo –

prolinowa(PPIaza). Enzym ten występował tylko w

roślinach poddanym stresowi suszy.



Badania nad sorgo wykazały ,że podwyższony poziom

tego enzymu występuje tylko u roślin odpornych na

suszę, a w roślinach tj. sosna, soja czy winogrono,

które są często wystawione na działanie suszy również

zaobserwowano cyklofiliny. Istnieje więc podejrzenie

że PPIaza bierze czynny udział w tolerancji suszy.

NDPK- kinaza nukleotydowo 2-

fosforanowa



Enzym ten utrzymuje, kosztem ATP

wewnątrzkomórkowe stężenie CTP, UTP i GTP. Spełnia

również ważną rolę w odpowiedzi hormonalnej na

szok cieplny, stres suszy, aktywuje kinazę stymulującą

mitozę, bierze pośredni udział w sygnałowaniu,

wzroście oraz rozwoju rośliny.



Badania nad stresem suszy oraz zasolenia na pszenicy,

sorgo i sośnie potwierdziły ogromny udział tego

enzymu w zwielokrotnieniu tolerancji na czynniki

stresowe



W obu genotypach buraka cukrowego zanotowano

wysoką nadekspresję genu kodującego NDPK, co może

świadczyć o roli tego enzymu nad tolerancją suszy.

α-NAC(polypeptide-associated

complex α-chain)



W przeciwieństwie do powyższych białek, białka
α-NAC jest znacząco mniej w roślinach
badanych



Białko to powiązane jest z rybosomami i
uczestniczy w zapobieganiu złej translokacji nowo
powstających polipeptydów oraz chroni przed
przyłączeniem się nieodpowiednich czynników.



Spadek tego stężenia w komórce może być
odzwierciedleniem nieprawidłowej translacji,
translokacji czy proteolizy białek spowodowanej
stresem suszy

Rubisco



W próbce zidentyfikowano 4 fragmenty dużej

podjednostki Rubisco w stężeniu znacznie
wyższym niż w grupie kontrolnej.
To zjawisko tłumaczy się wyższym stężeniem
reaktywnych form tlenu, które degradują
Rubisco
Jednakże badania nad ryżem wykazały, że
zwiększona zawartość podjednostek Rubisco
służy jako rezerwuar azotu.

Uwagi końcowe



Jest to pierwsza praca na temat reakcji buraka cukrowego

na stres suszy w warunkach naturalnych



Różnice w stężeniach tych samych białek w obu

genotypach buraka cukrowego świadczy o istotnych

zmianach w genach ulegających ekspresji podczas stresu

suszy



Przeważająca część z 11 zidentyfikowanych białek

odgrywa ważną rolę w unieszkodliwianiu reaktywnych

form tlenu. Podkreśla to jak ważne jest pozbywanie się

ROS w utrzymaniu homeostazy i funkcjonalności rośliny



Kolejne rozpoznane białka zaangażowane są w poprawne

zwijanie białek i ich stabilność, co również zakłócane jest

przez ROS pod wpływem stresu suszy



Ta informacja sugeruje że białka lub białka o podobnej

funkcji mogą być głównym czynnikiem usprawniającym

tolerancję na stres suszy.