Slajd 1

Elektroforeza

jako technika

separacji

makrocząstecz

Ćwiczenia dla grupy specjalizacyjnej Anna Bzducha

ELEKTROFOREZA - zjawisko elektrokinetyczne,

w którym pod wpływem przyłożonego pola

elektrycznego dochodzi do przemieszczania się

makrocząsteczek obdarzonych ładunkiem

elektrycznym

Prędkość przemieszczania

się naładowanej elektrycznie

makrocząsteczki zależy od:

- ładunku
- rozmiaru makrocząsteczki
(masa)
- kształtu
- oporów środowiska, w którym
makrocząsteczka się porusza

Ćwiczenia dla grupy specjalizacyjnej Anna Bzducha

OBSZARY ZASTOSOWANIA

ELEKTROFOREZY:

biochemia białek i kwasów nukleinowych

biologia molekularna

farmakologia

medycyna sądowa

diagnostyka medyczna

kontrola jakości żywności

Ćwiczenia dla grupy specjalizacyjnej Anna Bzducha

Genomika

Wykorzystanie technik

elektroforetycznych umożliwiło

uzyskanie pełnej sekwencji DNA

człowieka – techniki

sekwencjonowania DNA w

końcowym etapie opierają się

o elektroforezę

Przyłożenie pola elektrycznego do wodnego
roztworu
elektrolitu zawierającego makrocząsteczki
obdarzone ładunkiem elektrycznym (makrojony)
powoduje ruch jonów- zarówno elektrolitu jak i
makrojonów w kierunku elektrody o przeciwnym
ładunku elektrycznym

PODSTAWY TEORETYCZNE

ELEKTORFOREZY

Zarówno jony proste jak i jony makrocząsteczek
w środowisku wodnym występują w postaci uwodnionej –
posiadają otoczkę hydratacyjną (uporządkowany układ
dipoli wodnych związanych z jonem słabymi siłami
elektrostatycznymi). Zasięg tego uporządkowania wpływa na
możliwość ruchu jonów i makrojonów
w otaczającym środowisku. Właściwości otoczki zależą od
rozmiaru jonu, jego ładunku elektrycznego i właściwości
elektrolitu (pH, siła jonowa).

Równocześnie z procesami elektorforezy

(ruchu jonów i makrojonów w polu elektrycznym

zachodzącym w objętości elektrolitu)

zachodzą

procesy elektrolizy – proces zachodzący

przy powierzchni elektrod polegający na

odkładaniu się na elektrodach substancji

pochodzących z elektrolitu pod wpływem

przepływającego prądu.

Siła jonowa-

stężenia funkcja jonów (przy

zbyt wysokim stężeniu jonów następuje

ograniczenie ich ruchliwości i spadek

przewodności elektrycznej. Występuje on

również przy zbyt niskim stężeniu jonów

(niedobór nośników ładunku elektrycznego)

Wartość pH- miara stężenia jonów wodorowych w elektrolicie
– ma szczególne znaczenie w odniesieniu do białek i peptydów
(amfotery), bowiem w zależności od pH środowiska obdarzone
sa wypadkowym ładunkiem dodatnim, ujemnym lub 0 (punkt
izoelektryczny).

Przeważająca większość ładunku elektrycznego białek
pochodzi z zależnej od wartości pH jonizacji bocznych
łańcuchów karboksylowych oraz grup[ aminowych (inaczej w
przypadku kwasów nukleinowych- zawsze mają ładunek
ujemny).

Aby elektroforetyczna separacja białek była skuteczna
konieczne jest utrzymywanie stałej wartości pH elektrolitu. Z
uwagi na zachodzącą w sposób ciągły elektrolizę wody -
generowanie jonów H

(katoda) i OH

- (

anoda) elektrolit musi

być buforowany.

AMINOKWASY i BIAŁKA

Ładunek cząsteczki białka zależy od:

- składu aminokwasów
- pH środowiska

Ładunek może być (+) lub (-)

lub (0)

Rodzaje nośników elektroforetycznych

Rozdziały elektroforetyczne mogą być

prowadzone

bezpośrednio w objętości

elektrolitu

(elektroforeza kapilarna) lub

nośniku elektroforetycznym

wypełnionym

odpowiednim elektrolitem. Nośnik

elektroforetyczny –

bibuła, azotan celulozy,

agaroza, poliakrylamid

stabilizuje elektrolit i

przyczynia się do lepszej separacji cząsteczek na

zasadzie sita molekularnego (agaroza,

poliakryamid)

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym

PAGE

Żel poliakrylamidowy (kolor szary) z „tunelami -
kanalikami” (różnej wielkości czerwone pierścienie z
zacieniowaną na jasno głębią). Należy zauważyć, że w żelu
jest wiele kanalików o różnej wielkości

Elektroforeza PAGE

Żel poliakrylamidowy przygotowany jest z

monomerów akrylamidu i substancji sieciujących

(cross –linkers). Właściwości sieciujące ma

bisakrylamid. Reakcję polimeryzacji inicjuje się,

np. chemicznie (np. nadsiarczyn amonu z

katalizatorem TEMED).

Gęstość usieciowania oraz rozmiary porów w żelu

można modyfikować stężeniami akrylamidu i

bisakrylamidu.

Elektroforeza PAGE

Rzut z góry na

widok dwóch

wybranych

kanalików

(pokazano

tylko dwa, aby diagram

był bardziej czytelny).

Tunele te

rozciągają się

przez całą długość

żelu, nie są to

kanaliki

rozpostarte w linii

prostej (są kręte)

Różna średnica

kanalików.

Rodzaje komór elektroforetycznych

Ze względu na sposób

umieszczenia nośnika

elektroforetycznego

można wyróżnić:

elektroforezę

kapilarną

- elektroforezę

pionową

- elektroforezę

poziomą

Rodzaje elektroforezy

• Elektroforeza strefowa

(stała wartość pH

elektrolitu)

• Izotachoforeza

(nośnik o nieciągłym pH)

• Ognioskowanie izoelektryczne

(pH

zmienia się od wartości najwyższej przy katodzie do

najniższej przy anodzie)

• Elektroforeza natywna

–

makrocząsteczki

pozostają niezdenaturowane

• Elektroforeza w obecności SDS

• Elektroforeza nieciągła

(żele zagęszczający i

rozdzielający)

• Elektroforeza dwukierunkowa (2D)
• Immunoelektroforeza
• Sekwencjonowanie DNA

Elektrof.
strefowa

Elektroforeza SDS- PAGE

Elektroforeza białek "natywnych" jest stosowana bardzo

rzadko

SDS- PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (SDS -
PAGE)

Sól sodowa siarczanu dodecylu = SDS

(Sodium Dodecyl Sulfate = Sodium Lauryl Sulfate)

(CH

)

detergent posiadający w swej cząsteczce region

hydrofobowy = ogon CH

(CH

)

oraz grupy hydrofilowe: SO

co sprawia, że ma właściwości amfifilowe.

Elektroforeza SDS - PAGE

- bardzo silny detergent, który denaturuje białka

poprzez

dołączanie się do szkieletu polipeptydowego

- badania wskazują, że większość białek przyłącza

1.4 g SDS/g białka z kilkoma wyjątkami, np.
białka

błon komórkowych (membran) mogą przyłączyć

więcej

SDS, bo są bardziej hydrofobowe

=> Ładunek kompleksu SDS-białko

determinowany jest przez SDS => (-1) ładunek

dla każdej cząsteczki SDS

- ilość przyłączonego SDS zależy od wielkości białka –
wszystkie micelle białko/SDS są anionami

ładunek jest wprost proporcjonalny do masy

Elektroforeza SDS - PAGE

Mieszanina

zdenaturowanych

białek (różowe linie o

różnej długości), które

rozpoczynają

„wędrówkę” przez żel

poliakrylamidowy

(szary z kanalikami).

Układ znajduje się w
polu elektrycznym (-

+). Ponieważ wszystkie

zedenaturowane SDS-

em białka posiadają

silny ładunek ujemny

poruszają się w

kierunku przyłożonego

ładunku dodatniego

Elektroforeza SDS - PAGE

Schemat żelu poliakrylamidowego
po rozdziale elektroforetycznym
białek:
Linia 1: standard mas molekularnych –

czasteczki o znanej masie

molekularnej
Linia 2: mieszanina trzech białek o
różnej wielkości cząsteczek a –
największe białko,
c najmniejsze

białko

Linia 3: białko a
Linia 4: bialko b
Linia 5: białko c

Należy zauważyć, że każde z białek,
niezależnie czy naniesione na żel
indywidualnie czy w mieszaninie,
przebywa zawsze tę samą drogę
Standard mas molekularnych jest
stosowany w celu pomiaru relatywnej
wielkości nieznanego białka (a, b, i c)

Elektroforeza SDS - PAGE

Po rozdziale frakcje

białek pozostałe na

żelu poddaje się

barwieniu

Document Outline