Badanie genu na poziomie molekularnym
(ustalenie sekwencji, struktury egzonowo-
intronowej, elementów promotora, miejsc
inicjacji i terminacji transkrypcji itp.) wymagało
przed wynalezieniem techniki PCR ok. 1 mg DNA
tego genu.

Dla uzyskania takiej ilości DNA ludzkiego genu
(stanowi on jedną milionową część genomu
człowieka) trzeba byłoby wyjść z 1 kg ludzkiego
DNA, a następnie z całego wielokrotnie
powtórzonego genomu oddzielić DNA badanego
genu. Rozwiązaniem jest

klonowanie genów.

Klon - grupa

identycznych pod względem

genetycznym

organizmów

wywodzących się od

wspólnego przodka

.

Klonowanie genów

-

(i)

utworzenie

zrekombinowanego DNA

[połączenie

wybranego (klonowanego) fragmentu DNA z
małym

DNA nośnika/wektora],

(ii)

wprowadzenie go do komórek

gospodarza

(bakterie, drożdże)

(iii)

hodowla klonów zawierających

zrekombinowane DNA

by uzyskać

jednorodny materiał do izolacji DNA

klonowanego genu.

Naturalne klony - kolonie bakterii czy drożdży
wyrosłe z pojedynczej komórki, bliźnięta i
wieloraczki 1-jajowe. Niektóre rośliny można
klonować przez podział na części (bulwy
ziemniaka, pędy begonii) lub regenerację
pojedynczych protoplastów.

Etapy klonowania

genów

Ia. wybór
wektora

Ib. wybór DNA do
klonowania

II. przygotowanie zgodnych
końców

III. połączenie (ligacja) wektora z klonowanym
DNA

IV. wprowadzenie zrekombinowanego DNA do
komórek

gospodarza (transformacja)

V. selekcja poszukiwanego
klonu

(VI.) analiza sklonowanego DNA

Wektor

- mała cząsteczka DNA umożliwiająca jako

nośnik wprowadzenie do organizmu fragmentu
obcego DNA.

Wektor

musi

posiadać:

*

znacznik

(marker) - umożliwia selekcję GMO

* dogodne

miejsce/a do klonowania

*

miejsce/a startu replikacji

(ori i/lub ars) -

zapewnia
namnażanie wektora wraz ze sklonowanym

fragmentem

może

posiadać dodatkowe sekwencje ułatwiające

selekcję
lub analizę sklonowanego fragmentu

plazmid

phagemid

Wektory

wlk. wstawki

plazmidowe, fagemidowe

0-10 kb

lambdowe insercyjne

0-10 kb

substytucyjne

9-23 kb

kosmidy (plazmid z sekwencjami cos z faga λ)

30-

44 kb
fosmidy (ori plazmidu F + sekwencja cos z faga λ) ~
40 kb
pochodne bakteriofaga P1

70-100

kb
sztuczne chromosomy fagowe PAC (pochodne P1)
100-300 kb
sztuczne chromosomy bakteryjne BAC (pochodne F)
75-350 kb
sztuczne chromosomy drożdżowe YAC

0,2-

2 Mb
wektory roślinne (T-DNA)

nie istnieje wektor
uniwersalny

wektory

lambdowe

insercyjne

ograniczenie wlk. wstawki do 0 - 10 kb – z powodu ograniczenia

wlk. genomu, który może być zapakowany do główki fagowej
(75% - 105% dł. genomu dzikiego typu = 50 kb)

wektory

lambdowe

substytucyjne

wektor stanowi 60% dł. zrekombinowanego

genomu, wstawka ≤40-45% (9-23 kb)

Kosmidy

- zrekombinowane plazmidy wielkości ok.

5 kpz zawierające sekwencje

cos

z DNA faga ,

dzięki którym mo

ż

liwe jest pakowanie

zrekombinowanego DNA o odpowiedniej
wielkości (38-52 kpz) do główek fagowych i
tworzenie infekcyjnych cząstek; w zainfekowanej
komórce bakteryjnej sekwencje

cos

umo

ż

liwiają

utworzenie kolistej struktury kosmidu, który dzięki
plazmidowemu ori replikuje jak plazmid.

http://www.personal.psu.edu/rch8/workmg/Isolat_analyz_genes_Chpt3.htm

Figure 3.12.

wektory drożdżowe

*

plazmidy wahadłowe

zawierają sekwencje

umożliwiające:

(i) replikację zarówno w bakteriach (ori) i drożdżach
(ARS)

(ii) selekcję stransformowanych komórek zarówno
bakteryj-

nych (np. marker amp) jak i drożdżowych (np. ura3)

*

YAC

i (yeast artificial chromosome) zawierają:

(i) ori + ARS

(ii) sekwencje telomerowe

(iii) sekwencję centromerową

(iv) markery selekcyjne obu ramion chromosomu,
marker

bakteryjny

wektory pochodne
P1

Strachan & Read 1999 Human molecular genetics 2 Garland Science
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.figgrp.426

Transformacja roślin

z udziałem Agrobacterium tumefaciens bakterii
naturalnie infekującej (najczęściej w miejscu
zranienia) ponad 160 gatunków roślin i
powodującej guzowatość

odkrycie transformacji roślin by A.tumefaciens
* oprócz pierwotnych guzów można izolować guzy
wtórne - z nich nie otrzymuje się kultur
bakterii, przeszczepione na zdrową roślinę
powodują powstanie dużych guzów pozbawionych
bakterii
* tkanki guza rosną w kulturach bez dodatku
auksyn i cytokinin
* żeby bakteria była onkogenna musi zawierać

plazmid Ti

(ang.

T

umor

i

nducing).

Fragment plazmidu Ti przenoszony jest do komórki

roślinnej i stabilnie integruje w genom. Zawarte w tym
fragmencie geny ulegają ekspresji w komórce roślinnej.

Integrujący fragment

nazwano

T-DNA

(

T

ransferred

DNA

).

Analiza genetyczna wykazała, że

dwa regiony

plazmidu

Ti

są niezbędne do powstania guza

:

T-DNA

i

region vir

(virulence). (Mutacje we

fragmencie T-DNA zmieniają

morfologię guza, natomiast mutacje w regionie vir
zaburzają jego powstanie.)

T-DNA

zawiera geny związane z

produkcją fitohormonów

(auksyn, cytokinin, kwasu indolilooctowego).
Nadprodukcja tych hormonów podwyższa tempo
podziału komórki, zapobiega różnicowaniu i w
rezultacie powoduje powstanie guza.

Inne geny T-DNA odpowiedzialne są za

syntezę

aminokwasów

i

pochodnych cukrowych

zwanych

opinami

, oraz za ich wydzielanie z komórki roślinnej.

Transformacja T-DNA jest formą pasożytnictwa,
bakteria zmusza roślinę do syntezy opin, które są dla
niej źródłem węgla.

plazmid Ti zawiera geny niezbędne do tego procesu:

* geny mobilizacji T-DNA
* geny syntezy opin
* geny katabolizmu opin

Wiadomo, że

odwrócone powtórzenia sekwencji

o długości 25 bp

tworzące granice T-DNA (23

kb) są niezbędne, ale i wystarczające aby
region ten stabilnie integrował w genom
roślinny. DNA zawarty między granicznymi
sekwencjami przenoszony jest do komórki
roślinnej z pomocą białek kodowanych przez
geny znajdujące się w regionie vir (który jest
aktywny nawet gdy znajduje się w innym
replikonie), a następnie integruje w genom
roślinny. Odkrycie mechanizmu tego zjawiska
umożliwiło skonstruowanie wektorów
używanych obecnie do transformacji komórek
roślinnych z wykorzystaniem Agrobacterium.
Geny wklonowane in vitro w region T-DNA
plazmidu Ti mogą integrować do genomu
rośliny razem z T-DNA, tworząc rośliny
transgeniczne.

mechanizm transformacji:

a) (w naturze) zranienie - wniknięcie do przestrzeni

miedzykomórkowej, by wyzwolić mechanizm

transformacji

potrzebne są bodźce indukowane

zranieniem
b) przyczepienie się bakterii
c) odebranie sygnału zranienia (acetosyringone) -
produkt genu

VirA jest receptorem wykrywającym

roślinny sygnał zranienia i wysyłającym
wewnątrzkomórkowy sygnał aktywujący białko VirG
d) indukcja genów vir - Vir G jest transkrypcyjnym
aktywatorem, który włącza inne geny regionu vir
plazmidu Ti
e) wycięcie, transfer i integracja T-DNA
f) ekspresja T-DNA - produkcja auksyn i cytokinin
promujących

podział komórek, produkcja opin

[różne szczepy A.

tumefaciens

mają geny do

produkcji różnych opin (np. nopaliny, oktopiny)]

Plazmid Ti nie
może być
bezpośrednio
użyty do
klonowania:
musi zostać “roz-
brojony” przez
uszkodzenie
genów produkcji
fitohor-monów by
umożliwić
regenerację

nor-

malnych roślin
naturalny plazmid
Ti jest zbyt duży
(~200kb) (trudno
znaleźć unikalne
miejsce do klono-
wania , trudno
wyizolować DNA
całego plazmidu)

pBI121 (Clontech Inc.) - wahadłowy
wektor E.coli/A.tumefaciens,
zaprojektowany tak, że wstawka T-
DNA wycina się przy użyciu funkcji
vir dostarczanej in-trans przez
rozbrojony plazmid Ti

T-DNA:

RB, LB

-elementy

graniczne

NOS-NPTII-NOS

-

chimeryczny gen
oporności na
kanamycynę

35S/GUS

CDS

- CDS genu

reporterowego β-
glukuronidazy E. coli
pod konstytutywnym
promotorem 35S CaMV

multiple cloning

site

poza T-DNA

:

ori z pUC

RK2 oriV

- ori

plazmidu RK2, dla
replikacji w
Agrobacterium

NPTIII5', NPTIII CDS

-

gen fosfotransferazy
neomycyny pod proka-
riotycznym promotorem
(nadaje E. coli and A.
tumefaciens kan

r

)