Oddychanie komórkowe i

fosforylacja oksydacyjna

Mitochondrialny łańcuch oddechowy

Reakcje przenoszenia wodoru na tlen cząsteczkowy, którym

towarzyszy magazynowanie energii pod postacią związków

wysokoenergetycznych, zachodzą w mitochondriach. Obecne w

mitochondriach biologiczne układy oksydacyjno-redukcyjne

wiążą atomy wodoru z substratów przemian pośrednich, a

następnie przenoszą ich elektrony na cząsteczkę tlenu. W

wyniku tego następuje redukcja tlenu do jonu tlenkowego O2", a

po przyłączeniu protonów - wytworzenie cząsteczki wody.

Kierunek przenoszenia elektronów w łańcuchu oddechowym jest

wyznaczony przez różnice potencjałów oksydoredukcyjnych.

Transport elektronów odbywa się od układów o wyższych

wartościach ujemnych do układów o wyższych wartościach

dodatnich. W przenoszeniu elektronów od substratu do tlenu

uczestniczą dehydrogenazy, współdziałające z nukleotydami

nikotynamidowymi, flawinowymi oraz z liponianem, a poza tym:

flawoproteiny pośredniczące, ubichinon oraz układ

cytochromowy

.

Dehydrogenazy nikotynamidowe

. Współdziałają one

z NAD i NADP. Tego typu dehydrogenaz jest około 200. Enzymy te

przenoszą odwracalnie jeden atom wodoru i jeden elektron na

utlenioną postać NAD+ lub NADP+, z uwolnieniem protonu.

Większość dehydrogenaz działa specyficznie z NAD, inne działają

specyficznie tylko z NADP. Są również takie dehydrogenazy, które

mogą działać z obydwoma koenzymami. Istnieje możliwość

wymiany wodoru i elektronów między dehydrogenazami o

różnych koenzymach. Reakcje tego typu katalizują transhydro-

genazy.

Dehydrogenazy

współdziałające z flawinami. Białka tych

dehydrogenaz są związane z nukleotydami flawinowymi,

niekiedy zawierają także niehemowe żelazo. Do tego typu

dehydrogenaz należy: dehydrogenaza NADH, która jest białkiem

żelazowo-siarkowym, działającym z FMN, ponadto

dehydrogenaza bursztynianowa, cholinowa lub acylo-CoA

współdziałające z FAD.

Dehydrogenazy współdziałające z liponianem. Wchodzą one w

skład kompleksu enzymów oksydacyjnej dekarboksylacji 2-

oksokwasów. Zredukowany liponian jest następnie utleniany

przez dehydrogenazę liponianową, która współdziała z FAD.

FLAWOPROTEINY

POŚREDNICZĄCE (Fp).

Występują one poza wymienionymi już

dehydrogenazami flawinowymi. Fp zawierają

barwniki flawinowe, bardzo często żelazo

niehemowe, siarkę, a niekiedy cynk.

Metaloflawoproteiny uczestniczą m.in. w działaniu

dehydrogenaz NADH, powodując ich utlenienie.

Niektóre dehydrogenazy współdziałające z

nukleotydami flawinowymi, jak np.

dehydrogenaza acylo-CoA, współdziałają także z

flawoproteinami przenoszącymi elektrony (ETF).

Flawoproteiny pośredniczące prawdopodobnie

uczestniczą w przejściu dwu-elektronowych

reakcji utleniania w reakcje jednoelektronowe.

UBICHINON (koenzym Q).

Jest on syntetyzowany w komórkach z tyrozyny. Ubichinon stanowi
ostatnie ogniwo łańcucha oddechowego, do którego dochodzą atomy
wodoru. Dalej przenoszone są już tylko elektrony. Budowa koenzymu
Q jest zbliżona do witamin E i K, przez co może pełnić rolę
antyoksydanta budzącego nadzieję w leczeniu chorób wieku
starczego. W łańcuchu oddechowym występuje on w ilości
proporcjonalnie większej od innych składników. Ubichinon jest
ruchomym elementem łańcucha, zbierającym równoważniki
redukujące z flawoprotein i przekazującym je cytochromom.
CoQ jest także miejscem ich powstawania zgodnie ze schematem
reakcji:

UKŁAD CYTOCHROMOWY

Cytochromy zostały odkryte już w 1866 roku przez McMunna.

Stanowią one układ, w którym każda cząsteczka cytochromu

przenosi jeden elektron na zasadzie zmiany wartościowości żelaza.

Prawdopodobnie pierwszym biorcą elektronów od ubichinonu jest

cytochrom b o masie cząsteczkowej 28 kDa. Może on występować w

postaci polimeru o masie około 4 MDa. Dalszym przenośnikiem jest

cytochrom c1, a następnie cytochrom c.

Cytochrom c1 jest lipoproteiną o masie cząsteczkowej około 360

kDa. Okazało się, że jest to polimer zbudowany z podjednostek o

masie 51 kDa, zawierających po 1 atomie żelaza..

Cytochrom c jest najlepiej poznany ze wszystkich cytochromów.

Masa jego cząsteczki wynosi 13 kDa. Zawiera on 104 reszty

aminokwasowe, znany jest jego skład aminokwasowy oraz struktura

przestrzenna. Cytochrom c jest jedynym cytochromem

rozpuszczalnym i podobnie jak CoQ jest ruchomym składnikiem

łańcucha oddechowego, łączącym jego kompleksy funkcyjne.

Oksydaza cytochromowa

Ostatnie ogniwo łańcucha stanowią cytochromy aa3, nazywane

oksydazą cytochromową. Jest to kompleks 13 podjednostek

polipeptydowych, przy czym właściwości katalityczne są

przypisywane trzem najcięższym podjednostkom kodowanym

przez mitochondrialny DNA. Tym niemniej liczba podjednostek

oksydazy cytochromowej jest zmienna (prokarionty posiadają

ich najmniej). W skład tego enzymu wchodzą dwa układy

żelazoporfiry nowe, z których każdy oprócz żelaza zawiera atom

miedzi. Oksydazą cytochromowa ma duże powinowactwo do

tlenu. Reakcja, którą enzym ten katalizuje, jest nieodwracalna.

W mitochondrialnym łańcuchu oddechowym (rys. 2) w miejscu

działania ubichinonu mogą występować substancje

towarzyszące temu koenzymowi: witaminy K oraz witaminy E.

Od miejsca występowania ubichinonu elektrony są przenoszone

pojedynczo przez układy cytochromów na tlen. Natomiast

protony, uwalniane na etapie koenzymów nukleotydowych oraz

ubichinonu, łączą się bezpośrednio z jonem tlenkowym (O2-),

tworząc cząsteczkę wody.

Fosforylacja oksydacyjna

W procesie fosforylacji oksydacyjnej, związanej bezpośrednio z

łańcuchem oddechowym, zmiany entalpii swobodnej reakcji

przenoszenia elektronów umożliwiają wychwytywanie części

wytwarzanej energii przez cząsteczki ADP, które są ważnymi

składnikami procesu fosforylacji. Dzięki tej energii z ADP przy udziale

fosforanów nieorganicznych jest syntetyzowany ATP.

Przeniesienie 2 elektronów z atomów wodoru na tlen powoduje

wydzielenie 237,6 kJ/mol energii. W warunkach środowiska komórki,

podczas transportu elektronów z NADH na tlen wyzwolona energia

jest równa 220,8 kJ/mol. Z energii tej mogą być wytwarzane

wysokoenergetyczne wiązania ATP przez przyłączanie fosforanów do

cząsteczek ADP. Tego rodzaju wytwarzanie wiązań

wysokoenergetycznych, sprzężone z przenoszeniem w łańcuchu

oddechowym, nosi nazwę fosforylacji oksydacyjnej. Fosforylacja

oksydacyjna zachodzi tylko w mitochondriach. Poza nimi w komórce

nie ma układu tlenowych fosforylacji, wobec czego procesy

utleniania zachodzące z udziałem tlenu nie są sprzężone z syntezą

ATP. Nie związana w ATP energia wykorzystywana jest jako energia

cieplna na utrzymanie temperatury ciała zwierząt stałocieplnych.

Doświadczenia przeprowadzone na oddychających mitochondriach

wskazują, że podczas przenoszenia elektronów w łańcuchu

oddechowym rozpoczynającym się od dehydrogenaz

współdziałających z NAD, na 1/2 mola O2 są zużywane 3 mole

fosforanów nieorganicznych. Jeśli proces rozpoczyna się od

dehydsogenaz flawopro-teinowych, zużycie fosforanów

nieorganicznych na tę samą ilość tlenu wynosi 2 mole. Wskazuje

to, że gdy łańcuch oddechowy rozpoczyna się od zredukowanego

NAD, przy wykorzystaniu 1/2 cząsteczki O2 są syntetyzowane 3

cząsteczki ATP, natomiast jeśli rozpoczyna się od flawoprotein,

powstają tylko 2 cząsteczki ATP.

Energia związana w powstałym makroergicznym wiązaniu

fosforanowym wynosi około 30,6 kJ/mol. Tego rodzaju wiązania w 3

cząsteczkach ATP magazynują około 91,8 kJ/mol energii, co

stanowi około 40% całkowitej wydajności energetycznej łańcucha

oddechowego.

Mechanizm wytwarzania zarówno wysokoenergetycznych wiązań

ATP w procesie fosforylacji oksydacyjnej, jak i miejsce ich

wytwarzania w łańcuchu oddechowym nie zostały dotychczas

wyjaśnione w sposób jednoznaczny. Istnieje wiele teorii, które

usiłują tłumaczyć te zagadnienia.

Najbardziej znane są 3 hipotezy, których założenia zostaną w

skrócie przedstawione, a mianowicie: hipoteza chemiczna,

hipoteza chemiosmotyczna i hipoteza konformacyjna.

 

Hipoteza chemiczna jest znana jako teoria Slatera.

Według tej teorii w procesie tworzenia

wysokoenergetycznego wiązania ATP bierze udział

przenośnik X o nieznanej budowie oraz nośnik A, którym

może być jeden z układów oksydacyjno-re-dukcyjnych

łańcucha oddechowego. Przenośnik reaguje najpierw ze

zredukowanym nośnikiem, tworząc makroergiczny

kompleks A ~ X, a następnie z ortofosforanem, przenosząc

energię i tworząc kompleks przenośnika z fosforanem X

~(P). W ostatnim etapie następuje przeniesienie

wysokoenergetycznego wiązania fosforanu na ADP i

wytworzenie ATP:

A + X     A~X

A~X+(P)    X~(P)+A
X~(P) + ADP     ATP + X

Zakłada się, że w tym mechanizmie bierze udział także enzym

wytwarzający ATP. Nie udało się jednak dotychczas wydzielić

żadnych intermediantów wysokoenergetycznych tego procesu ani

przenośnika X.

Hipoteza chemiczna sprzęga fosforylację tlenową z określonymi

reakcjami łańcucha oddechowego. Według tej hipotezy fosforylacja

zachodzi w tych miejscach łańcucha oddechowego, gdzie

występuje znaczna różnica potencjałów oksydoredu-kcyjnych

między układami. Im większa jest różnica potencjałów, tym

wydziela się więcej energii. Część tej energii ulega rozproszeniu i

wydziela się w postaci ciepła, część zaś zostaje zmagazynowana w

postaci ATP. Magazynowanie energii chemicznej odbywa się w tych

miejscach łańcucha oddechowego, gdzie różnica potencjałów

wynosi około 160 mV.

Przypuszcza się, że jeśli łańcuch oddechowy rozpoczyna się od

NADH, powstają 3 cząsteczki ATP w następujących miejscach:

- przy przeniesieniu elektronów z koenzymów nikotynamidowych na

flawopro-teiny;

- przy przeniesieniu elektronów z ubichinonu lub z flawoprotein na

cytochro-my c;

- przy przeniesieniu elektronów z oksydazy cytochromowej

(cytochromu a+a3) na tlen.

Na tym ostatnim etapie jest największa różnica potencjałów i

wyzwala się największa ilość energii.

Wiele hipotez uważa błonę mitochondrialną za ważny czynnik

sprzężenia energetycznego. Należy do nich hipoteza

chemiosmotyczna Mitchella, wykluczająca udział pośredników.

Hipoteza ta jest obecnie uznawana za najbardziej zgodną z

różnymi danymi doświadczalnymi i najlepiej tłumaczącą wiele

zagadnień dotyczących fosforylacji tlenowej. Istotną rolę

według tej hipotezy spełnia rozdział ładunków elektrycznych po

obydwu stronach błony mitochondrium. Szczególne znaczenie

ma różnica stężeń protonów w poprzek błony oraz ich wymiana

przez błonę (rys. 1). Wymiana ta odbywa się za pośrednictwem

mechanizmu określonego jako "pompa protonowa" (rys.2).

Według hipotezy chemiosmotycznej łańcuch oddechowy jest

wewnątrz błony mitochondrium zwinięty w 3 pętle

odpowiadające 3 miejscom syntezy ATP (które zakłada

hipoteza chemiczna). 2 elektrony transportowane przez

łańcuch oddechowy

ze zredukowanego NAD na tlen powodują przemieszczenie 6

protonów od wewnętrznej strony błony mitochondrialnej na jej

stronę zewnętrzną, czyli ze środowiska matriks do środowiska

cytosolu.

 

Schemat hipotetycznego ułożenia pętli łańcucha
oddechowego oraz przemieszczania protonów przez błonę mitochondrium.

Schemat działania "pompy protonowej"; * syntaza ATP

transportująca H+

Cały proces rozpoczyna się po wewnętrznej stronie błony. Zredukowany NAD

przekazuje 2 elektrony oraz proton znajdującym się wewnątrz błony

flawoprotei-nom zawierającym FMN. Po dołączeniu jeszcze jednego protonu

ze środowiska, FMN ulega przejściu w FMNH2. Kompleks białkowy zawierający

FMNjest tak duży, że styka się z zewnętrzną stroną błony mitochondrium.

Istnieje zatem możliwość uwolnienia do cytosolu pary protonów. Natomiast

elektrony redukują 2 cząsteczki białek żelazowo-siarkowych i dzięki nim

przedostają się do wewnętrznej strony błony, skąd pobiera je cząsteczka

ubichinonu. Po dołączeniu dwóch protonów od strony matriks powstaje QH2,

który jako dobrze rozpuszczalny w tłuszczach łatwo przemieszcza się do

zewnętrznej strony błony. Odłącza do cytosolu 2 protony, natomiast 2

elektrony oddaje 2 cząsteczkom cytochromu b, które przenoszą je na stronę

wewnętrzną błony. Tu następuje przekazanie ich następnej cząsteczce

ubichinonu, który po przyjęciu pary protonów przechodzi w formę QH2,

wędrującą do zewnętrznej strony błony. Po uwolnieniu protonów do cytosolu

następuje przekazanie elektronów 2 cząsteczkom cytochromu c, znajdującym

się w pobliżu strony zewnętrznej błony, skąd przez dalsze ogniwa łańcucha są

przenoszone na wewnętrzną stronę błony do 2 cząsteczek cytochromu a3,

wchodzących w skład 2 cząsteczek oksydazy cytochromowej. Następuje

przekazanie elektronów na atom tlenu, po czym jon tlenkowy, łącząc się z 2

protonami ze środowiska matriks, tworzy cząsteczkę wody.

Wszystkie składniki łańcucha oddechowego znajdują się w wewnętrznej

błonie mitochondrialnej. Z wyjątkiem CoQ, który występuje w pewnym

nadmiarze, pozostałe składniki łańcucha mają zachowane proporcje

molowe. Zgodnie ze współczesnymi poglądami, wszystkie składniki są

zgrupowane w pięciu kompleksach lipidowo-białkowych w celu

pełnienia określonych funkcji:

- kompleks I: oksydoreduktaza NADH : ubichinon,

- kompleks II: oksydoreduktaza bursztynian : ubichinon,

- kompleks III: oksydoreduktaza ubichinon : utleniony cytochrom c,

- kompleks IV: oksydoreduktaza zredukowany cytochrom c : tlen.

Według hipotezy Mitchella, utlenianie przenośników redukujących

powoduje uwalnianie protonów (H+). Od CoQ przez dalsze ogniwa

łańcucha oddechowego biegną już dalej tylko elektrony. Protony, które

na skutek działania łańcucha oddechowego wydostały się na zewnątrz

mitochondrium, wywierają wpływ na wytworzenie różnicy potencjałów

elektrochemicznych po obydwu stronach błony. Różnica ta jest siłą

napędową syntezy ATP. Na powstanie tejże siły napędowej oprócz

protonów wpływają także potencjał błonowy oraz gradient pH po

obydwu stronach błony. Błona mitochondrialna jest nieprzepuszczalna

dla protonów. Za usuwanie protonów na zewnątrz mitochondrium jest

odpowiedzialna pierwotna pompa protonowa. Jako pierwotna pompa

protonowa działają kompleksy: I, III i IV, przemieszczające H+ na

zewnętrzną powierzchnię błony. Wykorzystanie potencjału

elektrochemicznego transmembranowego umożliwia powrót H+ do

mitochondrium, związany z syntezą ATP. Umożliwia to:

 

- kompleks V: syntaza ATP transportująca H+ (Fl5 Fo).

Funkcja kompleksu V

polega na syntezie ATP z ADP i Pnjeora o Fosforylację

warunkują 2 czynniki białkowe Fj i Fo. Syntaza ATP, transportująca H+, działa jako

wtórna pompa protonowa, przemieszczająca protony (H+) w kierunku odwrotnym

do działania pompy pierwotnej, tj. do wewnątrz mitochondrium.

Oprócz hipotezy chemicznej i najbardziej powszechnej hipotezy

chemiosmotycznej istnieje jeszcze hipoteza konformacyjna. Według tej teorii,

energia pochodząca z utleniania zostaje przekształcona w energię

przechowywaną w stanach konformacyjnych białek mitochondrialnych. Bogaty w

energię stan konformacji może ulegać zmianom, które wyzwalają energię na

potrzeby syntezy ATP.

Błona mitochondrialna oddziela wnętrze mitochondrium od cytoplazmy.

Wewnątrz mitochondrium, oprócz łańcucha oddechowego, zachodzą również

reakcje cyklu Krebsa i beta-oksydacji kwasów tłuszczowych. Wszystkie te procesy

są uzależnione od przepuszczalności błony mitochondrialnej. Błona zewnętrzna

mitochondrium jest przepuszczalna dla większości metabolitów, natomiast

przepuszczalność błony wewnętrznej jest bardzo ograniczona. Dehydrogenazy,

dla których akceptorem atomów wodoru jest FAD, jak np. dehydrogenaza

bursztynianowa - znajdująca się po wewnętrznej stronie błony mitochondrialnej -

może bez przeszkód oddać atomy wodoru na ubichinon, z pominięciem

kompleksu I.

Błona mitochondrialna jest nieprzepuszczalna dla zredukowanego NAD. Może on

być wytwarzany podczas glikolizy zachodzącej w cytozolu. Istnieje sposób

przekazywania równoważników redukcyjnych za pomocą tzw. mostków

substratowych:

Po obydwu stronach błony występuje taka sama para substratów, która może

przyjąć lub oddać atomy wodom, oraz enzym dehydrogenaza. Przez błonę
mitochondrialną mogą przenikać cząsteczki zredukowanego przez NADH
substratu i wewnątrz mitochondrium przekazać atomy wodoru na FAD.
Powoduje to stratę jednej cząsteczki ATP, ale są inne korzyści metaboliczne.
Parę substratów i enzym mogą stanowić np. glicerolo-3-fosforan i
dihydroksyacetonofosforan oraz enzym dehydrogenaza glicerolo-3-
fosforanowa.