W klasycznym ujęciu marker genetyczny to cecha jakościowa, uwarunkowana
w sposób prosty — tzn. przez jedną parę alleli, przydatna do celów
analizy genetycznej. Przydatność markera zależy od tego, czy jest on
polimorficzny, co zachodzi wówczas, gdy w populacji występują przynajmniej dwa
allele w locus tego markera. Polimorfizm markerów bada się
zazwyczaj za pomocą metod analitycznych, wśród których dominują metody
serologiczne oraz biochemiczne — oparte na elektroforezie.
Metody serologiczne wymagają stosowania surowic testowych, zawierających
przeciwciała skierowane przeciw ściśle określonej postaci białka,
a dokładniej — rozpoznające konkretną determinantę antygenową. W ten
sposób badane są antygeny erytrocytarne (grupy krwi), antygenowe determinanty
białek surowicy krwi (allotypy), antygeny głównego układu
zgodności tkankowej, umiejscowione na niektórych frakcjach leukocytów
(antygeny klasy II) lub innych komórkach mających jądro (antygeny klasy I).
Technikę elektroforezy wykorzystuje się do rozdziału w polu elektrycznym białek
oraz fragmentów DNA. Rozdział elektroforetyczny ujawnia formy różniące się
ruchliwością, która zależy od wielkości i ładunku elektrycznego cząsteczki białka
(lub fragmentu DNA) oraz jej konformacji przestrzennej, a z drugiej strony od
parametrów fizycznych rozdziału (napięcie, temperatura, stężenie nośnika —
żelu itp.). W przypadku DNA rozdział może być poprzedzony trawieniem
wyizolowanego (lub zamplifikowanego metodą PCR) DNA z użyciem
enzymów restrykcyjnych.
Antygeny erytrocytarne (grupy krwi)
Grupy krwi były najwcześniej wykorzystane w analizie genetycznej, np.
dotyczącej kontroli pochodzenia. Do pionierów tych badań należy zaliczyć
m.in. polskiego badacza Ludwika Hirszfelda. Przez grupę krwi należy
rozumieć typ krwi, cechujący się obecnością charakterystycznych białek,
o właściwościach antygenowych, na powierzchni erytrocytów. Identyfikacja
antygenów erytrocytarnych wymaga zastosowania surowic testowych, które
zawierają swoiste przeciwciała skierowane przeciw konkretnemu antygenowi.
Intensywne badania nad polimorfizmem antygenów erytrocytarnych u
zwierząt domowych podjęto na przełomie lat 50. i 60. Ich efektem było
wykrycie wielu układów grupowych. W ich obrębie zidentyfikowano liczne
antygeny i allele je warunkujące. Konkretny układ grupowy krwi jest
warunkowany przez pojedynczy gen (locus),
który w populacji jest re-
prezentowany zazwyczaj przez wiele alleli (seria alleli wielokrotnych).
Białka kodowane przez te geny pełnią różnorodne funkcje biologiczne.
Z badań prowadzonych u człowieka wynika, że mogą one być enzymami,
receptorami, cząsteczkami adhezyjnymi czy białkami strukturalnymi. Wspól-
ną ich właściwością jest to, że są związane z błoną plazmatyczną erytrocytów,
a ich obecność można wykryć metodami serologicznymi. Po dodaniu do
surowicy testowej zawiesiny erytrocytów dochodzi do reakcji anty-gen-
przeciwciało.
Przeciwciała obecne w surowicy testowej wiążą się
z determinantami antygenowymi. W wyniku reakcji antygen-przeciwciało
dochodzi do aglutynacji lub hemolizy krwinek czerwonych. Jeśli białko
ma tylko jedną determinantę antygenową, wówczas jest rozpoznawane
za pomocą jednej surowicy testowej. Jeśli białko ma kilka determinant
antygenowych, to wówczas ta forma białka jest wykrywana po zastosowa-
niu odpowiedniej liczby surowic testowych. Wreszcie może być taka
sytuacja, że białko jest pozbawione determinant wykrywalnych dostępnymi
surowicami testowymi. Występowanie różnych form determinanty antyge-
nowej w danym białku jest skutkiem mutacji punktowych. Mutacja taka
może doprowadzić do zmiany sekwencji aminokwasów, a to z kolei może
wpłynąć na zmianę struktury białka, a w tym jego determinanty anty-
genowej. Struktura białka zależy również od modyfikacji potranslacyjnej
polipeptydu przeprowadzonej przez enzymy kodowane przez inne geny.
Jeśli takie geny mają wiele alleli, może to prowadzić do zróżnicowanej
modyfikacji potranslacyjnej, a przez to do utworzenia (lub zlikwidowania)
nowej determinanty w antygenie erytrocytarnym. Gdyby dla uproszczenia
przyjąć,
że białko ma tylko jedną determinantę antygenową, to wówczas
każda mutacja genu, prowadząca do zmiany budowy białka — rozpozna-
wanej przez surowice testowe — będzie skutkowała powstaniem nowego
allelu (ryć. 11-1). Sytuacja staje się bardziej złożona, gdy białko ma więcej
determinant antygenowych. Wówczas pojedynczy allel jest opisywany za
pomocą kilku surowic testowych. Mówi się wówczas o fenogrupach, czyli
zespole antygenów, które dziedziczą się jak jednostka, a więc są uwarunko-
wane przez jeden allel. W takiej sytuacji mutacja genu zmienia jedną
z determinant, ale nie narusza struktury pozostałych (ryć. 11-2). Badania
prowadzone u zwierząt wykazały, że występują obie sytuacje.
Należy jednak zaznaczyć,
że istnieje także druga teoria tłumacząca
fenomen fenogrup. Przyjmuje ona, że każdy antygen warunkowany jest
przez jeden gen. Wówczas zespół antygenów dziedziczący się jako jednostka
genetyczna byłby uwarunkowany przez grupę genów bardzo silnie ze sobą
sprzężonych. Przy takim uwarunkowaniu genetycznym może dochodzić do
powstawania rekombinantów, a w konsekwencji do nietypowego dziedzi-
czenia antygenów krwinkowych. Przykłady takie opisano u bydła, głównie
w odniesieniu do układu grupowego B. Należy pamiętać, że istnieją białka
zbudowane z podjednostek kodowanych przez różne geny. Zatem możliwe
jest, że w niektórych przypadkach obie teorie będą miały zastosowanie do
wyjaśnienia polimorfizmu antygenów erytrocytarnych.
Liczba znanych układów grupowych (loci)
u zwierząt gospodarskich
wynosi: 7 w genomie konia (układy: A, C, D, K, P, Q, U) oraz owcy (układy: A,
B, C, D, M, R, X), 11 w genomie bydła (układy: A, B, C, F, J, L, M, S, Z, T', R'), 13
w genomie kury (układy: A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, M, O, P) oraz 15
w genomie świni (układy: A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, O). Biologiczna
funkcja powyższych białek nie została jeszcze poznana. Natomiast bardzo
bogata jest wiedza na temat połimorfizmu występującego w obrębie poszcze-
gólnych układów (tab. 11-1). W przypadku wielu układów grupowych znane
jest umiejscowienie chromosomowe loci. Wśród poznanych układów są takie,
w których wykryto dotąd tylko dwa allele (np. układ L bydła czy układ
C świni), przy czym jeden z nich jest odpowiedzialny za występowanie białka
mającego determinantę antygenową wykrywaną przez surowicę testową ,
a drugi allel (allel „ —") koduje białko, które w reakcji z dostępną surowicą
testową nie daje reakcji serologicznej. Układ grupowy, w którym występuje
allel „ — " określany jest jako otwarty. Na drugim biegunie są układy o olbrzy-
mim polimorfizmie, jak np. układ grupowy B bydła, w którym wykryto 40
antygenów i opisano około 1000 alleli (fenogrup). Można przypuszczać, że
cząsteczka białka kodowana przez ten gen ma bardzo zróżnicowaną strukturę
i przez to ma wiele determinant antygenowych. Ponadto determinanty mogą
mieć wiele wariantów, a każdy z nich jest rozpoznawany przez odrębną
surowicę testową.
W efekcie wśród alleli będą takie, które warunkują
pojawienie się tylko jednej determinanty (rozpoznawanej przez jedną
surowicę), oraz takie, które odpowiadają za występowanie kilku determinant
(rozpoznawanych przez analogiczną liczbę surowic). Pomiędzy tymi skrajnymi
przykładami są liczne układy grupowe, w których zidentyfikowano kilka
czy kilkanaście alleli. W tabeli 11-11 przedstawione są rozpoznane dotychczas
antygeny i allele u koni.
Na uwagę zasługuje układ grupowy A świni. Jego ekspresja zależna jest
od dodatkowego locus S, który ma działanie epistatyczne w stosunku do
locus układu A. Gen S ma dwa allele: S oraz s. W układzie grupowym
A występują dwa antygeny A oraz O. Pojawienie się antygenu A lub
O uzależnione jest od genotypu w locus S, przy czym działanie epistatyczne
pojawia się przy genotypie homozygoty recesywnej ss.
Jak to już wcześniej wspomniano, badanie grup krwi wymaga stosowania
surowic testowych, które powinny spełniać warunek swoistości. Surowice
takie są produkowane przez laboratoria, które zajmują się badaniami
antygenów erytrocytarnych na potrzeby kontroli pochodzenia zwierząt.
Procedura produkcji oparta jest na immunizacji zwierząt, pozyskaniu od nich
surowicy odpornościowej (na ogół poliwalentnej, czyli zawierającej wiele
różnych przeciwciał), a następnie jej „oczyszczaniu" (absorpcji niespecyficz-
nych przeciwciał) do momentu otrzymania surowicy testowej (monowalent-
nej), to znaczy zawierającej przeciwciała skierowane przeciw konkretnemu
antygenowi erytrocytarnemu.
Niezmiernie istotne jest, aby surowice testowe,
wyprodukowane w różnych laboratoriach, charakteryzowały się identyczną
swoistością. Cel ten osiąga się poprzez cykliczne przeprowadzanie, pod
auspicjami Międzynarodowego Towarzystwa Genetyki Zwierząt (ang.
International Society for
Animal Genetics — ISAG), międzynarodowych
testów porównawczych (ang. comparison test). Polegają one na tym, że do
laboratoriów uczestniczących w teście przesyłane są zestawy zakodowanych
próbek krwi zwierząt. Za pomocą dostępnych surowic testowych należy
ustalić, jakie antygeny występują na erytrocytach w poszczególnych prób-
kach. Zbiorcze wyniki testu są udostępniane zainteresowanym laboratoriom.
W Polsce produkcją surowic testowych zajmuje się Instytut Zootechniki
(bydło, świnie, konie) oraz Zakład Hodowli Koni AR w Poznaniu (konie).
Białka surowicy krwi, erytrocytów
i leukocytów
Białka surowicy krwi, erytrocytów i leukocytów są drugą, po grupach krwi,
pod względem liczebności grupą markerów genetycznych klasy I. Poszcze-
gólne warianty tych białek są określane za pomocą technik elektroforetycz-
nych (np. elektroforeza w żelu poliakryloamidowym lub elektroforeza
dwuwymiarowa czy rozdział białek w gradiencie pH — tzw. elektrofokusing).
Identyfikacja wariantów tych białek musi być potwierdzona w teście porów-
nawczym (pod kontrolą Międzynarodowego Towarzystwa Genetyki Zwie-
rząt). Na przykład u koni testy takie wykonywane są dla 16 systemów białek.
Polimorfizm białek leukocytów, nazywanych także cząsteczkami lub
antygenami głównego układu zgodności tkankowej (MHC), i ich znaczenie
są omówione szczegółowo w rozdziale: Genetyczne podstawy odporności
i oporności.
Polimorfizm białek surowicy krwi wynika ze zmienności ich form
strukturalnych, będących skutkiem mutacji punktowych w genie kontrolu-
jącym syntezę danego białka lub genach kodujących enzymy odpowiedzialne
za modyfikację potranslacyjną. Niektóre białka i enzymy surowicy krwi
zestawiono w tabeli ll-III. Spośród ponad 25 białek najbardziej polimorficzne
są albumina, inhibitor α-proteaz i transferyna. Liczba rozpoznanych
wariantów elektroforetycznych białek jest jednak specyficzną cechą
gatunkową.
Albuminy współdziałają z globulinami w regulacji równowagi płynów
ustrojowych. Najwięcej wariantów tego białka zidentyfikowano
u bydła. U owiec synteza albumin jest kontrolowana przez locus ALB
umiejscowiony w chromosomie 6 i będący w sprzężeniu z locus białka
wiążącego witaminę D, przy czym jeden z alleli (ALBS) występuje u
większości ras. U świń locus albuminy jest umiejscowiony w chromosomie
8ql2.
Inhibitory α-proteaz cechuje największy polimorfizm u takich
gatunków, jak świnia, koń i koza. U świń są one determinowane przez
ściśle sprzężone loci (Pi1, PO1A, PO1B, PIZ, P/3, PJ4) zajmujące łącznie
region długości około 2 centymorganów (chromosom 7q24-q26). Ze
względu na to, że różne rasy świń mają całkowicie odmienne haplotypy
(czyli układy sprzężonych alleli z loci genów dla inhibitorów α-proteaz),
są one cennymi markerami genetycznymi. Tak więc, w rasie szwedzkiej
yorkshire oraz landrace zidentyfikowano po około 40 różnych haplotypów.
Z drugiej strony, niektóre allele są charakterystyczne dla danych ras, jak
np. PO1ABi PO1BYdla wielkiej białej polskiej.
U koni w jednym poznanym dotychczas locus inhibitora α-proteaz
wykryto 20 alleli, z kolei u kóz inhibitory α-proteaz są kontrolowane
przez 4 loci, charakteryzujące się podobnym stopniem polimorfizmu (3-5
alleli).
Transferyna jest
β-globuliną, mającą dwa aktywne centra wiązania
żelaza.
Jej podstawową funkcją jest transpor żelaza z miejsc
absorpcji w przewodzie pokarmowym do różnych komórek organizmu.
Jest to najbardziej polimorficzne białko zidentyfikowane dotychczas
u podstawowych gatunków zwierząt gospodarskich. U koni jest ono
determinowane przez 13 alleli, przy czym jedynie allele Tf-D i Tf-F2
występują prawie u wszystkich ras koni. Natomiast u świń allel TfB jest
głównym allelem u ras europejskich i azjatyckich, podczas gdy allel TfA
występuje przede wszystkim u yorkshire, hampshire i duroc. Najrzadsze
allele to TfE (tylko u świń rasy hampshire) oraz Tf1 (u dzika
europejskiego). Locus transferyny u świń znajduje się w chromosomie 13
(13q31), u bydła w chromosomie l, u owiec także w chromosomie l (Iq42-
q45).
Spośród białek i enzymów erytrocytarnych (tab. 11-IV) szczególnie
interesujące są deaminaza adenozyny i hemoglobina.
Deaminaza adenozyny została dotychczas wykryta u trzody chlewnej,
owiec (chromosom 15), kur i bydła, przy czym u bydła jest to enzym
leukocytarny. U świń w locus ADA znanych jest sześć alleli. Polimorficzne
warianty są związane z różną aktywnością tego enzymu. U
osobników o genotypie ADA°ADA°
brak jest deaminazy adenozyny w
erytrocytach, natomiast jest ona aktywna w leukocytach i innych
tkankach. Allel ten, określany jako zerowy, występuje szczególnie często
u zwierząt podatnych na stres, które mają skłonność do wytwarzania
mięsa typu DFD (ciemne, twarde i suche).
Hemoglobina wykazuje największy polimorfizm u owiec, bydła i kóz.
Warianty tego białka różnią się tylko budową łańcucha β. Na przykład
u bydła w trzech pozycjach tego łańcucha, kontrolowanego przez locus
znajdujący się w chromosomie 15q22-q27, są różne aminokwasy. Polimorfizm
genu kontrolującego hemoglobinę występuje u niektórych ras bydła, jak np.
u rasy Jersey i niektórych ras mięsnych. Większość ras bydła, wśród nich
bydło czarno-białe i czerwono-białe, jest monomorficzna. U owiec warianty
hemoglobiny kontrolowane są przez loci: HBA (24 chromosom) i HBB (15
chromosom). Ciekawe jest, iż łańcuch β hemoglobiny C (HBB C) jest
wytwarzany tylko w przypadku anemii i tylko u osobników mających allel
HBA, a
wielkość tego wytwarzania zależy od nasilenia anemii. Ponadto
wariant A hemoglobiny β (HBB A) wykazuje większe powinowactwo do
tlenu niż wariant B (HBB B) i związany jest z większą wartością hematokrytu.
Allotypy immunoglobulin i lipoprotein
Antygenowe właściwości surowicy krwi, określane terminem allotypy, są
to ugrupowania chemiczne (najczęściej jeden lub kilka aminokwasów) wy-
stępujące na cząsteczkach białek i różnicujące osobniki tego samego
gatunku. U większości gatunków zwierząt gospodarskich poznane allotypy
zlokalizowane są przede wszystkim na α-, β- i γ-globulinach. Stopień
polimorfizmu allotypowego jest różny zależnie od gatunku. U świń
zidentyfikowano dotychczas 16 allotypów we frakcji β-globulin, 14
allotypów dla γ-globulin i 3 dla α-globulin. Natomiast u owiec wykryto
11antygenowych markerów cząsteczek α-globulin, 10 determinant
antygenowych we frakcji β-globulin oraz 7 we frakcji γ-globulin.
W przypadku antygenów immunoglobulin u bydła, dotychczas
zidentyfikowano 3 allotypy, kontrolowane przez allele bval, bva2 oraz bvb.
Również lipoproteiny, biorące udział w transporcie cholesterolu, wykazują
właściwości antygenowe. W zależności od właściwości fizycznych wyróżnia
się pięć klas tych białek, od lipoprotein o bardzo małej gęstości (VLDL) do
lipoprotein o bardzo dużej gęstości (VHDL). Największe zróżnicowanie
allotypów lipoprotein, oznaczonych symbolem Lp, stwierdzono dotychczas
u świń, u których najbardziej polimorficzny, bo liczący ponad 21 allotypów,
jest układ Lpb. Większość tych allotypów jest determinowana przez
kodominujące allele. W następnych układach (Lpr, Lpt i Lpu) znane są po
dwa allele, a w piątym układzie (Lps) tylko jeden allel. U pozostałych
gatunków zwierząt polimorfizm allotypowy lipoprotein jest niewielki. U
bydła zidentyfikowano 3 allotypy, u owiec 1.
Głównymi białkami mleka są kazeiny αs1, αs2, β i κ oraz białko serwatkowe
— P-laktoglobulina. U bydła loci kazein znajdują się obok siebie w 6
chromosomie (6q26-q33) i zajmują razem odcinek DNA długości około 200
kpz (tysięcy par zasad). Ze względu na ścisłe sprzężenie loci kazein,układ
sprzężonych alleli nazywany jest haplotypem. Genotyp zwierzęcia w loci
kontrolujących białka mleka można określać
za pomocą metody elektroforezy stosowanej zarówno w przypadku
rozdziału białek (żel skrobiowy lub poliakryloamidowy), jak i analizy na
poziomie DNA (żel agarozowy lub poliakryloamidowy). Określenie genotypu
na podstawie badania białka jest możliwe tylko u samic będących okresie
laktacji.
Natomiast analiza polimorfizmu genów kodujących białka (z
wykorzystaniem
metody RFLP, opisanej w rozdziale: Metody analizy i modyfikacji genomu)
może być przeprowadzana u osobników obu płci i w każdym wieku.
U bydła w locus kazeiny αsl wykryto pięć alleli: A, B, C, D i E, przy czym
największą frekwencją u bydła europejskiego charakteryzuje się allel B,
a u bydła indyjskiego — allel C.
Białko αs2-kazeiny różni się długością łańcucha od białka αs1-kazeiny,
składają się one bowiem odpowiednio z 207 i 199 aminokwasów.
Poszczegól-
ne warianty aS2-kazeiny są kontrolowane przez 4 allele: A, B, C i D, z
których
jedynie A i D są obecne w genotypie bydła ras europejskich.
β-Kazeina wykazuje większy polimorfizm niż kazeiny αs1i αS2, albowiem
W locus
kontrolującym syntezę tego białka stwierdzono 7 alleli.
U bydła
europejskiego najczęściej występuje wariant
β-kazeiny A, bardzo rzadko
wariant
β-kazeiny B (prawie wyłącznie stwierdzane są genotypy
hetero-
zygotyczne AB).
Dotychczas u bydła wykryto 6 typów κ-kazeiny, determinowanych
allelami:
A, B, C, E, F i G.
Różnice między poszczególnymi wariantami
polegają na zmianie aminokwasu, będącej konsekwencją mutacji punktowej
(tranzycji jednej zasady na inną). Tak więc allele A i B różnią się
nukleotydami w dwóch miejscach
łańcucha DNA, które powodują
zmianę aminokwasu. W pozycji 136 łańcucha polipeptydowego B jest
treonina, a w wariancie A — izoleucyna, natomiast w pozycji 148
wariant B κ-kazeiny ma kwas asparaginowy, a wariant A — alaninę.
Molekularna identyfikacja alleli A i B metodą PCR-RFLP jest przedstawiona
w rozdziale: Zmienność cech.
Allel E κ-kazeiny różni się od A i B podstawieniem A→G (seryna->glicyna
w pozycji 155 łańcucha polipeptydowego). Allel F powstał w wyniku
mutacji punktowej w allelu A, polegającej na tranzycji G→A, której skutkiem
jest zmiana w pozycji 10 łańcucha polipeptydowego aminokwasu argininy
na histydynę. Podobnie allel G powstał wskutek tranzycji C→T w allelu A,
powodującej zamianę argininy na cysteinę w pozycji 97 sekwencji amino-
kwasowej białka. Mutacje te tworzą miejsca restrykcyjne dla enzymów HhaI
I MaII, co stwarza możliwość molekularnej identyfikacji poszczególnych
alleli za pomocą metody PCR-RFLP.
Białko serwatkowe mleka bydła, β-laktoglobulina, występuje w dwóch
wariantach A i B. β-Laktoglobulina odgrywa rolę w odporności organizmu,
pobierana bowiem przez oseski z mlekiem matki chroni je przed infekcjami.
Mleko zawierające β-laktoglobulinę B różni się od mleka z β-laktoglobulina
A większą zawartością suchej masy, tłuszczu i kazein oraz lepszą przydat-
nością technologiczną do produkcji serów.
Podobnie jak w przypadku κ-kazeiny, znane są różnice w sekwencji
aminokwasowej obu wariantów β-laktoglobuliny, wynikające z polimorfizmu
genu kodującego to białko.
Białko β-laktoglobuliny składa się z 162 aminokwasów. Różnica między
wariantem A i B polega na tym, że wariant A w pozycji 64 sekwencji
aminokwasowej zawiera kwas asparaginowy (GAT), natomiast wariant
B — glicynę (GGT). Z kolei w pozycji 118 w wariancie A jest walina (GTC),
zaś w B -- alanina (GCC). Zmiana zasady w kodonie 118 genu stwarza
miejsce restrykcyjne dla enzymu HaeIII (GG/CC) w allelu β-laktoglobuliny
B. Zostało to wykorzystane w opracowanym teście PCR-RFLP, który także
jest już rutynowo stosowany.
W mleku kóz i owiec, podobnie jak bydła, są cztery frakcje białek.
Najbardziej polimorficzny jest gen kazeiny αs1 u kóz (7 alleli — A, B, C, D,
E, F, O). O ile allele A, B, C i E różnią się między sobą kilkoma podstawieniami
aminokwasów, o tyle allele D i F wykazują znacznie większe różnice,
polegające na delecji odpowiednio 11 i 37 aminokwasów. W pozostałych loci
wykryto po 2 allele. Podobnie u owiec, z wyjątkiem locus P-laktoglobuliny
(chromosom 3p28), w którym są 3 allele, w loci kontrolującym główne białka
mleka występują po 2 allele.
Polimorfizm DNA
W jądrowym DNA zdecydowanie przeważają sekwencje niekodujące,
wśród których dużą przydatność dla potrzeb analizy genetycznej mają
sekwencje powtarzaj ące się tandemowo. W połowie lat 80. opisano po
raz pierwszy sekwencje minisatelitarne. Ich cechą charakterystyczną jest
to, że długość podstawowego motywu powtarzającego się wynosi zazwyczaj
kilkanaście nukleotydów. Do najbardziej znanych sekwencji minisate-
litarnych należą: 33.5 (motyw podstawowy: GGGAGGTGGGCAGGAGG),
33.6 (motyw podstawowy: AGGGCTGGAGG) i 33.15 (motyw podstawowy:
AGAGGTGGGCAGGTGG). Sekwencje te występują w wielu miejscach (loci)
genomu, a w konkretnym locus może być różna liczba powtórzeń motywu
podstawowego. Jeśli strawiony enzymem restrykcyjnym i rozdzielony
elektroforętycznie DNA hybrydyzuje się z wyznakowaną radioaktywnie
sondą zawierającą sekwencję minisatelitarną, to na błonie radiograficznej
pojawia się układ prążków, który reprezentuje fragmenty DNA o różnej
długości. Fragmenty te pochodzą z wielu loci, a ich długość zależy od liczby
powtórzeń motywu podstawowego i także odległości, jaka dzieliła sekwencję
minisatelitarną od miejsca cięcia przez enzym restrykcyjny. Uzyskany układ
prążków, nazywany niekiedy „odciskiem palca" DNA (ang. DNA fingerprint),
przedstawia wysoce charakterystyczny obraz osobniczego DNA, który może
być wykorzystany m.in. do kontroli pochodzenia i identyfikacji śladów
biologicznych. Obok równoczesnej analizy wielu loci możliwe jest także
badanie polimorfizmu sekwencji minisatelitarnej w pojedynczym locus.
Badanie takie wymaga zastosowania sond o dużej specyficzności, to znaczy
zawierających nie tylko sekwencję minisatelitarną, ale także sekwencje ją
otaczające, oraz przeprowadzenia hybrydyzacji zgodnie z zaostrzoną proce-
durą (ang. high stringency). Z zebranych do tej pory informacji o występowaniu
sekwencji minisatelitarnych w różnych genomach wynika, żeIch loci są położone
głównie w częściach telomerowych chromosomów. Z tego względu ich przydatność
w budowaniu markerowych map genomo-wych jest ograniczona.
Wkrótce po odkryciu polimorfizmu sekwencji minisatelitarnych opisano polimorfizm
krótkich sekwencji, bo zawierających motyw podstawowydługości kilku nukleotydów,
także powtarzających się tandemowo. Zostałyone określone terminem sekwencji
mikrosatelitarnych. Do tej pory najczęściej opisywano dwu- (np. CA) lub
czteronukleotydowe (np. CATA) motywy podstawowe. Sekwencje mikrosatelitarne
mogą występować jako proste powtórzenia motywu podstawowego lub mogą mieć
układ złożony, polegający na tym, że powtórzenia motywu podstawowego są
przedzielone inną sekwencją — np. (CA)nAT(CA)m lub też sekwencja przedzielająca
jest otoczona różnymi powtarzającymi się motywami podstawowymi — np.
(GT)nGAT(AG)m. Wykrywanie polimorfizmu mikrosatelitarnego może
być prowadzone podobnie jak sekwencji minisatelitarnych, tzn. hybrydyzacji
z sondami i wówczas analiza dotyczy równocześnie wielu loci.
Szczególne jednak znaczenie zyskały sekwencje mikrosatelitarne w chwili, gdy za
pomocą techniki PCR, po rozpoznaniu sekwencji otaczających sekwencję
mikrosatelitarną, możliwe stało się analizowanie pojedynczych loci.
Na podstawie wiedzy o sekwencjach otaczających mikrosatelitę syntetyzowane
są oligonukleotydy pełniące funkcję starterów dla polimerazy DNA. Badanie
polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych w pojedynczym locus polega na
amplifikacji techniką PCR specyficznych fragmentów, pochodzących z DNA
wyizolowanego od danego osobnika, a następnie określeniu ich długości za
pomocą klasycznej elektroforezy (np. żel poliakryloamidowy + barwienie
azotanem srebra) lub w automatycznym sekwenatorze DNA. Zależnie od
genotypu osobnika stwierdza się występowanie jednego fragmentu, w przy-
padku homozygoty, lub dwóch fragmentów — u heterozygoty (ryć. 11-3
wkładka kolorowa). Sekwencje mikrosatelitarne stały się najpowszechniej-
szym źródłem markerów genetycznych, dzięki wysokiemu polimorfizmowi
i równomiernemu rozproszeniu w genomie. Szacuje się, że w genomie
ssaków sekwencje takie występują co 6-10 tysięcy par nukleotydów. Warto
zaznaczyć, że sekwencje mikrosatelitarne mogą występować w intronach
(przykładem są geny apolipoproteiny A oraz B świni) lub nawet w eksonach
(gen kodujący huntingtynę u człowieka).
Wykrywanie polimorfizmu (markerów) DNA możliwe jest również
wówczas, gdy nie są znane ani sondy molekularne, ani sekwencje starterowe
umożliwiające amplifikację techniką PCR konkretnego, polimorficznego
fragmentu DNA. Jedną z częściej stosowanych procedur w takiej sytuacji
jest losowa amplifikacja polimorficznego DNA (ang. random
amplified
Polymorphic DNA — RAPD). Analiza tego typu polega na amplifikacji
nieznanych fragmentów DNA, za pomocą sekwencji starterowej o losowej
kombinacji nukleotydów (zazwyczaj składa się z 10 nukleotydów), w której
dominują nukleotydy C i G. Zamplifikowane fragmenty, reprezentujące
zazwyczaj różne
loci w genomie, są poddawane elektroforezie, w wyniku
której uzyskuje się kilka prążków (fragmentów DNA różnej długości).
Badając grupę osobników można stwierdzić różnice w układzie prążków,
które są wynikiem mutacji punktowych tworzących lub znoszących miejsce
rozpoznawane przez losowy 10-nukleotydowy oligonukleotyd starterowy
dla reakcji PCR. Zidentyfikowanie takiego polimorficznego fragmentu
pozwala na dalszą jego analizę, w tym sekwencjonowanie. Po określeniu
sekwencji tego fragmentu możliwe staje się ograniczenie analizy genetycznej
do tego pojedynczego locus. W ten sposób identyfikuje się markery określane
skrótem SCAR (ang. Seauence characterized amplified region). Jeśli amp-
lifikowany fragment jest wystarczająco duży, to możliwe jest jego zlokalizo-
wanie w chromosomie (mapowanie fizyczne). Przykładem takiej procedury
jest identyfikacja polimorficznego markera RAPD, amplifikowanego przez
starter 5'-AGAATAGGC-3', charakterystycznego dla psów obciążonych
chorobą genetyczną — postępującym zanikiem siatkówki (ang. progressive
rod-cone degeneration). Polimorficzny fragment, wykryty za pomocą techniki
RAPD, został następnie molekularnie opisany, co doprowadziło do iden-
tyfikacji markera specyficznego SCAR, który zlokalizowano w chromosomie
9 u psa. Należy zaznaczyć, że markery RAPD czy SCAR mogą zawierać
sekwencje kodujące lub niekodujące i dlatego ich jednoznaczna klasyfikacja
do kategorii markerów klasy I lub II jest trudna.
Badanie polimorfizmu DNA jest powszechnie stosowane także dla
markerów klasy I. Analiza taka opiera się najczęściej na wykrywaniu
polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP), a także polimor-
fizmu konformacji jednoniciowych łańcuchów DNA (SSCP). Istotą obu
metod jest identyfikacja mutacji punktowych w obrębie genów. O metodach
tych napisano w rozdziale: Metody analizy i modyfikacji genomu.
Dynamiczny rozwój badań, których celem jest sekwencjonowanie geno-
mów różnych gatunków, zaowocował identyfikacją nowej klasy markerów
genetycznych, określanych symbolem SNP (ang. single nucleotide polymor-
phism). Polimorfizm ten związany jest z występowaniem pojedynczych
zmian sekwencji nukleotydów w homologicznych sekwencjach, np. allel
l - AATCGGC oraz allel 2 — AATGGGC. Mutacja punktowa prowadzi do
powstania miejsca polimorficznego typu SNP, jeśli każdy z alleli występuje
w populacji z częstością nie mniejszą niż 1%. Polimorfizm SNP wiąże się
zazwyczaj z obecnością w puli genowej populacji jedynie dwóch alleli.
Niewątpliwą zaletą polimorfizmu SNP jest jego powszechność w genomach
różnych gatunków. Na przykład, prace nad ustaleniem sekwencji DNA
genomu człowieka ujawniło co najmniej 1,4 mln miejsc SNP, spośród
których większość występuje poza strukturą genów. Wynika z tego,
że te
proste podstawienie nukleotydów zazwyczaj ma charakter tzw. cichego
podstawienia, czyli nie wpływa na budowę polipetydu, ale może od-
działywać na ekspresję genu. Jednakże niektóre z tych podstawień mogą
wywoływać skutki fenotypowe. Ogromne nasycenie genomów markerami
SNP sprawia coraz powszechniejsze ich wykorzystywanie w analizie
genetycznej. Do identyfikacji alleli SNP może być przydatna technika RFLP
(jeśli mutacja zmienia sekwencję rozpoznawaną przez enzym restrykcyjny)
lub SSCP. Jednak identyfikacja wielu miejsc SNP wymaga odwołania się do
innych technik, w tym sekwencjonowania DNA. Polimorfizm na poziomie
sekwencji nukleotydów może być również związany z brakiem (delecja) lub
wstawieniem (insercja) jednego lub kilku nukleotydów. Tego typu markery
opisywane są terminem InDel (Insertion Deletion polymorphism) i mogą
mieć np. następujące formy: allel l — TCGAATGAATT (insercja AAT) i allel
2 — TCGGAATT (delecja AAT).
Wykorzystanie markerów genetycznych w
hodowli zwierząt
Markery genetyczne znajdują zastosowanie w pracy hodowlanej między
innymi w kontroli pochodzenia, ocenie wartości genetycznej zwierząt pod
kątem cech użytkowych i selekcji pośredniej, tzw. MAS (ang. marker
assisted
selection), ocenie zmienności genetycznej wewnątrz i między
populacjami (liniami) oraz szacowaniu dystansu genetycznego. Informacje
o umiejscowieniu loci markerów genetycznych znajdują się w markerowych
mapach genomu (rozdział: Mapy genomowe).
Kontrola pochodzenia u zwierząt od wielu lat jest prowadzona na
podstawie układów grupowych krwi i polimorficznych białek, czyli mar-
kerów genetycznych klasy I. Podstawą tej kontroli jest to,
że potomek
dziedziczy jeden allel z każdego locus od ojca, drugi od matki. Zatem
w przypadku grup krwi nie może on mieć antygenu erytrocytarnego,
którego nie stwierdzono u jednego z rodziców. Do kontroli pochodzenia
najlepsze są układy grupowe, w których występuje wiele antygenów,
u bydła są to układy B (40 antygenów), C (12 antygenów) oraz S (8 anty-
genów), u świń układy M (12 antygenów), E (17 antygenów) i L (12 anty-
genów), natomiast u koni układy A (7 antygenów), D (17 antygenów),
P (4 antygeny) i Q (3 antygeny). Przykład kontroli pochodzenia na podstawie
polimorfizmu antygenów erytrocytarnych oraz białek surowicy krwi i eryt-
rocytów przedstawiono w tabeli 11-V.
Porównanie genotypów i fenotypów źrebaka i klaczy wskazuje na to,
że w fenotypie ojca musiały wystąpić antygeny erytrocytarne A-a, D-cgm, P-ad
i Q-b oraz typy białek TF-O, ALB-A, ES-I, PHI-I. Warunków tych nie spełnia
ogier l, można wykluczyć jego ojcostwo. Spełnia je ogier 2, on zatem może być
ojcem źrebięcia.
Ponieważ kontrola pochodzenia na podstawie polimorfizmu antygenów
erytrocytarnych (grup krwi) i polimorficznych białek surowicy krwi nie
zawsze stwarza możliwość jednoznacznego wskazania pary rodzicielskiej,
ostatnio coraz częściej są stosowane do tego celu markery genetyczne
klasy II (niekodujące sekwencje DNA). Daje to możliwość wykorzystania
znacznie bardziej precyzyjnych kryteriów analizy genetycznej. Można
wyróżnić dwie podstawowe metody stosowane do kontroli pochodzenia;
jedna jest oparta na polimorfizmie minisatelitarnym, druga na polimorfizmie
mikrosatelitarnym. Polimorfizm minisatelitarny jest podstawą metody „odcis-
ku palca" DNA. W metodzie tej strawiony (pocięty) enzymem restrykcyjnym
i rozdzielony elektroforetycznie DNA jest hybrydyzowany z sondą, którą jest
np. sekwencja minisatelitarna. Uzyskany obraz prążków jest charakterystycz-
ny dla danego osobnika, ale potomek otrzymuje od każdego z rodziców po
jednym prążku („allelu") danej sekwencji (ryć. 11-4). Prawdopodobieństwo
wystąpienia tego samego obrazu prążków u dwóch niespokrewnionych
osobników jest minimalne. Dokładność kontroli pochodzenia można zwięk-
szyć przez użycie w analizie kilku sond molekularnych.
W celu określenia prawdopodobieństwa wykluczenia pochodzenia danego osobnika
po danym rodzicu (-ach) stosowane są odpowiednie wzory.
W przypadku analizy polimorfizmu w jednym locus minisatelitarnym
u potomka i jednego z rodziców (nie zawsze dysponujemy pełnymi danymi
pochodzenia) prawdopodobieństwo wykluczenia obliczane jest ze wzoru:
Gdy dostępne są informacje dotyczące polimorfizmu minisatelitarnego
w DNA obojga rodziców i potomka, prawdopodobieństwo wykluczenia
obliczane jest ze wzoru:
Jak już wspomniano, analiza polimorfizmu w kilku loci minisatelitarnych
równocześnie zwiększa dokładność kontroli pochodzenia. W takim przypad-
ku określa się tzw. łączne prawdopodobieństwo wykluczenia dla wszystkich
badanych loci. Wzór na obliczanie tego prawdopodobieństwa ma tę sama
postać dla obu przypadków, dostępności informacji zarówno o jednym,
jak i obojgu rodzicach:
Druga metoda stosowana obecnie do kontroli pochodzenia wykorzystuje
polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych. W przypadku każdej sekwencji
mikrosatelitarnej potomek otrzymuje jeden allel od matki, drugi od ojca,
dokładnie tak, jak to jest przy cechach monogenowych — jakościowych.
Istnieje możliwość kontroli pochodzenia za pomocą PCR multipleks, w której
stosuje się kilka markerów równocześnie.
Długość alleli (produktu PCR— zamplifikowanych sekwencji mikrosatelitarnych)
może być oznaczana za pomocą automatycznego sekwenatora. Przykład kontroli
pochodzenia na podstawie sekwencji mikrosatelitarnej 2319 (powtórzenie
4-nukleotydowe)u lisów, której długość określono metodą elektroforetycznego
rozdziału w żelu poliakryloamidowym barwionym azotanem srebra oraz za pomocą
automatycznego sekwenatora, przedstawiono na rycinie 11-5 (wkładka
kolorowa). Krzywe 1-5 obrazują genotypy szczeniąt (3-5) oraz ich domniemanych
rodziców — ojca (1) i matki (2). Ojciec jest homozygotą pod względem allelu
długości 235 pz, matka natomiast heterozygotą (jeden allel - 243 pz, drugi
— 263 pz). Wszystkie szczenięta są heterozygotami, przy czym allel długości
235 pz odziedziczyły po ojcu. Dwa z nich otrzymały od matki allel długości 243 pz,
natomiast trzeci — allel 263 pz. Widoczny „pik„ przy długości 270 pz jest to
marker wielkości fragmentu DNA, dodawany do każdej próby DNA analizowanej
za pomocą sekwenatora.
W ostatnich latach badacze coraz częściej zastanawiają się nad wykorzystaniem
do kontroli pochodzenia polimorfizmu pojedynczych nukleotydów, określanego
symbolem SNPs (ang. single nucleotide polymorphisms). Polimorfizm ten jest
wynikiem mutacji punktowych (zamiana określonej zasady w danym nukleotydzie
na inną).
Przyczyną odchodzenia od wykorzystywania sekwencji mikrosatelitarnych
w kontroli pochodzenia są głównie zachodzące w nich mutacje, których
częstość szacuje się na 10-2-10-5 na pokolenie. Zaletą SNPs jest bardzo duża
gęstość ich rozmieszczenia w genomie (na przykład w genomie człowieka występują
one co ok. 1300 par zasad). Również to, że do identyfikacji genotypu
w przypadku polimorfizmu pojedynczych nukleotydów można zastosować
zdecydowanie więcej technik molekularnych niż do identyfikacji genotypu
w loci mikrosatelitarnych, sprawia, iż w niedalekiej przyszłości polimorfizm
pojedynczych nukleotydów zastąpi sekwencje mikrosatelitarne nie tylko
w kontroli pochodzenia, ale także w poszukiwaniach genów ważnych
z hodowlanego punktu widzenia, szacowaniu zmienności genetycznej
i dystansu genetycznego.
Badacze niemieccy wybrali na razie 60 SNPs do kontroli pochodzenia
u bydła holsztyńsko-fryzyjskiego, brunatnego szwajcarskiego i simentali.
Identyfikacji genotypu w loci tych markerów daje 99,99% prawdopodobieństwa
wykluczenia.
Sekwencje mikrosatelitarne są bardzo pomocne w analizie genetycznego
tła cech ilościowych. Cechy użytkowe (ilościowe) są determinowane przez
wiele genów o małym efekcie każdego z nich, dlatego identyfikacja ekspresji
tych genów jest znacznie utrudniona. Prowadzone są badania w celu
znalezienia takich genów, które mają znaczący wpływ na kształtowanie się
cech użytkowych. Analiza asocjacji między markerami mikrosatelitarnymi
a cechami ilościowymi jest pierwszym krokiem do identyfikacji genów
„ważnych", czyli istotnych z hodowlanego punktu widzenia.
Znając sprzężenie między określonym markerem genetycznym a np. wydajnością
białka w mleku, można dla młodej jałówki określić, jaka będzie wartość tej cechy
w przyszłości. Wykorzystując markery mikrosatelitarne wykryto u bydła
kilka loci znajdujących się w różnych chromosomach, warunkujących cechy
użytkowości mlecznej (tab. 11-VI). U świń określono także regiony chromo-
somów sprzężone z cechami użytkowości mięsnej i rozpłodowej (tab. 11-VII).
Niektóre cechy użytkowe występują tylko u jednej płci lub nie można
ich zmierzyć przyżyciowe. Cechy takie mogą być doskonalone jedynie
poprzez selekcje pośrednią. Rozwój technik molekularnych przyczynił się
do opracowania metody selekcji pośredniej nazwanej MAS (ang. marker
assisted selection). W metodzie tej kryterium wyboru zwierzęcia jest jego
genotyp w locus markera genetycznego wykazującego asocjację z doskona-
loną cechą użytkową. Większość cech użytkowych o znaczeniu ekonomicz-
nym ujawnia się fenotypowo u zwierząt w określonym wieku (np. cechy
użytkowości mlecznej). W takim przypadku selekcja pośrednia (MAS) jest
znacznie bardziej intensywna i dokładna w porównaniu z selekcją tradycyj-
ną, a postęp genetyczny jest uzyskiwany w krótszym czasie. Wynika to
z możliwości określenia genotypu u bardzo młodych zwierząt.
Badania asocjacji markerów genetycznych z cechami ilościowymi zaowo-
cowały już wykryciem u większości gatunków zwierząt gospodarskich sporej
liczby loci genów ważnych, o istotnym wpływie na cechy użytkowe. Okazało
się, że niektóre geny oddziałujące na wartość cechy ilościowej mają ogromne
znaczenie. Geny takie nazwano głównymi lub genami o dużym efekcie.
Należą do nich między innymi geny warunkujące hipertrofię mięśniową
u bydła i owiec, zwiększoną plenność świń, zwiększoną płodność owiec oraz
geny białek mleka — κ-kazeiny i β-laktoglobuliny (jest o nich mowa
w rozdziale: Zmienność cech). W przypadku tych cech jest już możliwa
selekcja bezpośrednia, której kryteriami są genotypy zwierząt w danych loci.
Markery genetyczne, głównie klasy II, są również pomocne w doskonaleniu
niektórych cech jakościowych. Przykładem tego jest wykorzystanie
markerów mikrosatelitarnych do identyfikacji obecności w genotypie hetero-
zygotycznym recesywnego allelu rogatości u bydła. Jest to cecha dziedzicząca
się z dominacją całkowitą, której fenotyp jest taki sam u osobnika homo-
zygotycznego i heterozygotycznego. Problem eliminacji z populacji genu
rogatości jest dość istotny w krajach zachodnich, w których coraz więcej
uwagi poświęca się dobrostanowi zwierząt. Posiadanie rogów jest cechą
niekorzystną tak w aspekcie dobrostanu (gdyż może być przyczyną uszko-
dzeń ciała), jak również intensywnej hodowli (zasiniaczenia i ukryte
uszkodzenia tusz są przyczyną istotnych strat ekonomicznych w produkcji
żywca). Stosowany w stadach bydła mięsnego zabieg usuwania rogów
powoduje cierpienie zwierząt oraz zmniejszenie ich dziennych przyrostów,
ponadto jest zabiegiem kłopotliwym. Aby tego uniknąć, coraz więcej uwagi
poświęca się genetycznemu uwarunkowaniu bezrożności i możliwości
prowadzenia selekcji w tym kierunku. Dotychczas wiadomo jedynie, że
locus polled, kontrolujący bezrożność/rogatość u bydła, występuje w l chromo-
somie. Identyfikacja nosicieli genu p może być przeprowadzana za pomocą
analizy polimorfizmu sprzężonych z tym genem markerów genetycznych.
Znane są już dwie sekwencje mikrosatelitarne, sprzężone z locus polled,
które mogą być wykorzystane do tego celu.
Polimorfizm markerów genetycznych jest wykorzystywany w badaniach
nad odpornością/podatnością zwierząt na różne choroby i zaburzenia
genetyczne, dzięki czemu nosiciele niekorzystnych alleli mogą być wykrywa-
ni, zanim wystąpią objawy chorobowe. Szczególne znaczenie mają badania
związku między antygenami/genami głównego układu zgodności tkankowej
(MHC) a występowaniem chorób, zwłaszcza infekcyjnych. Zagadnienie to
jest opisane w rozdziale: Genetyczne podstawy odporności i oporności.
W badaniach z zakresu genetyki populacji znajdują zastosowanie zarówno
markery genetyczne klasy I, jak i klasy II. Zastosowanie frekwencji alleli
markerów genetycznych klasy I do szacowania zmienności genetycznej
wewnątrz i między populacjami omówione zostało w rozdziale: Podstawy
genetyki populacji. Znaczenie markerów genetycznych w hodowli zwierząt
podkreśla to, że są one wykorzystywane do analizy zmienności genetycznej
w ramach programów Światowej Strategii Zachowania Zasobów Genetycznych
Zwierząt Gospodarskich FAO (Global Strategy for the Farm Animal Genetic
Resources), w której są uwzględnione zasady międzynarodowego porozumie-
nia — Konwencji o Biologicznej Różnorodności. Zmienność genetyczna
w obrębie ras ginących lub uznanych za zagrożone jest określana na podstawie
polimorfizmu markerów genetycznych, przede wszystkim polimorfizmu
antygenów erytrocytarnych (grup krwi) i polimorfizmu DNA mikrosatelitarnego.
Markery genetyczne są także niezwykle przydatne w szacowaniu stopnia
zinbredowania (homozygotyczności) poszczególnych populacji (linii), w ana-
lizie podobieństw i różnic między populacjami i ustalaniu dystansu genetycz-
nego między nimi. Szacowanie dystansu genetycznego i wybór ras, które
cechuje duża zmienność genetyczna, służy zachowaniu biologicznej różno-
rodności zwierząt gospodarskich. Z kolei ocena zmienności genetycznej
między populacjami (liniami) ułatwia wybór optymalnego wariantu krzyżo-
wania, a w krzyżowaniu towarowym uzyskanie maksymalnego efektu
heterozji, ujawniającego się głównie zwiększeniem wydajności cech użyt-
kowych zwierząt. Charakterystyka wybranych markerów genetycznych
pozwala
śledzić wpływ pracy selekcyjnej na strukturę genetyczną danej
populacji, jak określone geny ulegają eliminacji równolegle z eliminacją
cech niekorzystnych z hodowlanego punktu widzenia.
