Nowe kierunki w
diagnostyce nowotworów
u dzieci
Prof. dr hab. n. med. Maryna
Krawczuk Rybak
Klinika Onkologii Dziecięcej
Nowe kierunki w
diagnostyce nowotworów
u dzieci
Prof. dr hab. n. med. Maryna
Krawczuk Rybak
Klinika Onkologii Dziecięcej
I
1. Cytometria przepływowa
–
diagnostyka białaczek
–
choroba resztkowa
–
oporność wielolekowa
2. FISH
3. PCR/RT-PCR
4. Microchips array
II Medycyna nuklearna
•
Scyntygrafia MIBG, Ga
67
(gal)
•
PET - CT
Metody stosowane w diagnostyce
nowotworów u dzieci
•
mikroskopia świetlna,elektronowa
•
immunofenotypowanie
•
cytogenetyka
•
biologia molekularna
•
analiza biochemiczna
•
Immunofenotypowanie
badanie antygenów przy zastosowaniu specyficznych przeciwciał
–
metoda ELISA
–
metoda cytometrii przepływowej
–
metoda radioimmunologiczna
Teoria Watsona i Cricka
• DNA
-
2 śrubowato oplecione nici tworzące
strukturę podwójnej helisy. Każda z nici
zbudowana jest z 4 rodzajów nukleotydów.
• Hybrydyzacja
-
tworzenie się par
dwóch komplementarnych nukleotydów
Ograniczenia metody cytogenetycznej:
•
trudność w uzyskaniu płytek metafazalnych
•
zła jakość chromosomów
•
ograniczona rozdzielczość prążków
•
złożone rearanżacje kariotypowe
•
FISH:
–
możliwość oceny w jądrach interfazalnych
–
szybka analiza dużej liczby komórek (np. w ocenie choroby resztkowej,
w ocenie odsetka komórek z aberracjami chromosomalnymi
–
konieczność posiadania odpowiednich sond
• FISH
-
fluorescencyjna hybrydyzacja in situ
–
wykrywanie specyficznych sekwencji DNA w preparatach
cytologicznych poprzez tworzenie kompleksu DNA
chromosomowego ze specyficzną sondą molekularną
• sonda
- fragment DNA , o określonej sekwencji
nukleotydów
•
rodzaje sond:
– centromerowe (badania zmian liczbowych chromosomów)
– malujące
– specyficzne dla określonych genów
•
M - FISH
•
SKY (spectral karyotyping)
–
zastosowanie >24 kolorów do jednoczesnej
analizy wszystkich chromosomów
• PCR
-
umożliwia in vitro amplifikację wybranych sekwencji DNA przy
użyciu polimerazy DNA i syntetycznych
oligonukleotydów (tzw. starterów)
komplementarnych do końców wybranych
sekwencji DNA
• RT - PCR
(reverse transcription PCR) -
modyfikacja reakcji PCR
do wykrywania i analizy cząsteczek RNA. Zasadniczym etapem reakcji
jest odwrotna transkrypcja tj. synteza cDNA na matrycy RNA w
obecności odpowiednich primerów i enzymu odwrotnej
transkryptazy
•
Wysoka czułość metod: wykrycie 1 komórki nowotworowej na
10
3
- 10
7
prawidłowych komórek
PCR, RT - PCR
analiza DNA lub RNA tkanki guza
•
diagnoza
•
prognoza
•
histogenetyka
Wykrywanie:
•
śladowych ilości materiału guza (1 komórki nowotworowej)
•
ekspresji genów związanych z nowotworem
•
rearanżacji genów immunoglobulin
•
amplifikacji onkogenów, np. myc - N
•
genu WT1, WT2
•
mutacji genu supresorowego p53
•
wysoka czułość metody
•
bardzo czuła i bardzo szybka diagnoza
•
monitorowanie choroby
•
wykrywanie choroby resztkowej przy remisji cytomorfologicznej
Mikromacierze (chipy DNA)
•
równoczesne prowadzenie reakcji hybrydyzacji poprzez sondy DNA
(każda o innej sekwencji i umieszczona w określonym miejscu płytki)
–
ocena obecności genu/genów
–
określenie kolejności zasad w niezsekwencjonowanych fragmentach DNA
–
określenie ekspresji (aktywności) tysięcy genów
•
badanie ludzkiego genomu
•
szybka diagnostyka infekcji (bakteryjnych, wirusowych)
•
diagnostyka chorób metabolicznych
•
diagnostyka chorób
uwarunkowanych genetycznie
•
badanie mutacji będących
podstawą karcinogenezy
•
odkrywanie nowych leków
•
badanie profilu ekspresji nowotworów
Diagnostyka białaczek
•
morfologiczna - klasyfikacja FAB
•
cytochemiczna
•
immunofenotypowanie
–
metoda Elisa
–
metoda cytometrii przepływowej z użyciem
przeciwciał monoklonalnych dwu-, trój-,
czterokolorowych
–
określa:
•
pochodzenie komórek blastycznych
•
stopień ich dojrzałości i zróżnicowania (stadium
rozwojowe, na którym dany limfoblast uległ
transformacji nowotworowej)
•
zawartość DNA w komórce (ploidia)
L1
L2
L3
Poszerzenie diagnostyki
morfologicznej i cytochemicznej
•
przy ujemnych barwieniach, np. PAS - ujemnych
ALL - możliwość błędnego zakwalifikowania
•
wykrywanie koekspresji (dwuklonalności)
•
wykrywanie białaczek mieszanych (15-20% AML
wykazuje koekspresję antygenów limfoidalnych)
•
możliwość określenia linii, do której należą
limfoblasty (T, B, NK)
•
hiperploidia (index DNA 1,16 i 1,6 - dobre
rokowanie natomiast ID1,6 prognoza zła
•
hipoploidia - rokowanie złe
Znaczenie prognostyczne
określenia immunofenotypu
ostrych białaczek
•
Dostosowanie protokołu chemioterapii do typu
komórek nowotworowych
•
B- ALL - duże dawki ARA - C, cyklofosfamidu
•
brak ekspresji CD 10 - gorsze rokowanie
•
ekspresja CD 34 - dobre rokowanie
•
gorsze efekty w T - ALL - intensyfikacja
leczenia
CD 34
Oporność wielolekowa
(MDR - multidrug
resistance
)
DNA
topoizomeraza
II
naprawa DNA
LPR, PGR, MPR
(1)
(1)
(2)
(4,5)
(6)
(3)
METABOLIZM
LEKU
LEK
GLUTATION
APOPTOZA
białka
regulujące
apoptozę
MDR - diagnoza
1) Cytometria przepływowa
•
Przeciwciała monoklonalne znakowane
fikoerytryną skierowane przeciwko
zewnątrzkomórkowej cząsteczce P - gp
(P-
glikoproteina)
2) RT - PCR - ocena mRNA białka P - gp
Remisja
•
kryterium cytomorfologiczne
-
obecność 1-5% blastów (czułość 10
-
1
-10
-2
)
•
choroba resztkowa
- obecność
populacji komórek białaczkowych między
populacją komórek o prawidłowym
fenotypie poniżej wykrycia w badaniu
morfologicznym
0
10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
1
1 2 3 4
czułość badania
cytomorfologicznego
czułość immunofenotypizacji
i techniki PCR
,,wyleczenie”
okres obserwacji
I - Rx Con - Rx / M - Rx
Wykrywanie / monitorowanie
choroby
resztkowej
1)
Immunofenotypowanie
:
wykrywa 0,01% komórek białaczkowych (10
-3
- 10
-
4
)
•
nieprawidłowa ekspresja antygenów
•
koekspresja antygenów innych linii
hematopoetycznych (w ALL pre B możliwość
koekspresji linii T - komórkowej, mieloidalnej)
•
asynchroniczna rozwojowo ekspresja antygenów
(nadmierna ekspresja, brak ekspresji)
•
ekspresja ektopowych antygenów (obecność
antygenów poza ich typową lokalizacją)
Wykrywanie / monitorowanie
choroby
resztkowej cd.
2) Łańcuchowa reakcja polimerazy
(PCR)
•
czułość metody 10
-4
- 10
-6
•
wykrywa:
•
specyficzne transkrypty fuzyjne,
np. BCL - ABL, E2A - PBX1,
TEL - AML1
•
specyficzne immunoglobuliny IgH
i rearanżacje genu TCR
(T - cell receptor)
Znaczenie wykrywania MRD
(minimal residual
disease)
•
określenie wstępnej odpowiedzi na leczenie,
niski poziom MRD lub jej brak - dobre
rokowanie
•
MRD po indukcji remisji jest najważniejszym
czynnikiem rokowniczym (niezależnie od
innych czynników ryzyka jak wiek, liczba blastów,
immunofenotyp, obecność aberracji
chromosomalnych w czasie rozpoznania,
odpowiedź na prednison)
•
ocena prawdopodobieństwa wznowy po
leczeniu, po przeszczepie szpiku
Aberracje chromosomalne w
nowotworach -informacja o
potencjalnym mechanizmie
patogenetycznym choroby
•
aktywacja protoonkogenu - np. dostanie się
onkogenu c-myc pod kontrolę genu regulującego
ekspresję łańcucha ciężkiego immunoglobulin
- rozwój chłoniaka Burkitta lub ALL
- L3; cytogenetycznie translokacja t (8;14)
•
fuzja genów - wytworzenie aktywnego produktu
białkowego zaangażowanego w proces
powstawania nowotworu,
np. białkowe produkty
genów fuzyjnych w wyniku
translokacji t (9;22), t (8;21)
C-myc
Chromosom Philadelphia
Znaczenie aberracji
cytogenetycznych: w
białaczkach
•
powyżej 50 chromosomów u 25-50 % ALL -
dobre rokowanie
•
82-94 (około - tetraploidia) - 1% - złe
rokowanie
•
47-50 chromosomów - pośrednie rokowanie
•
pseudodiploidia (strukturalne rearanżacje),
46 chromosomów - rokowanie złe
•
diploidia - rokowanie pośrednie
•
hypoploidia - rokowanie złe
• Translokacje:
ALL
–
t (1;19) - 5-6%. E2-PBX1, hyperleukocytoza,
wysokie wartości LDH,DI 1,16, rokowanie złe
–
t (9;22) - około 5%, BCR-ABL, rokowanie złe
–
t (4;11) - 2-5%, AF4-MLŁ rokowanie złe
–
t (8;14) - około 2% TCR alfa - c-myc
AML
–
t (8;21) M2-AML,często pozaszpikowa lokalizacja ,
korzystna rokowniczo
–
t (15;17) w M3 - gen fuzyjny pml/rara koduje białko
nieprawidłowego receptora kwasu retinowego
W guzach litych:
•
mięsak Ewinga - t (11;22)
•
retinoblastoma - chromosom 13q14 - locus Rb
•
guz Wilmsa - anomalie chromosomu 11,12,1
•
neuroblastoma - delecja ramienia krótkiego
chromosomu 1, amplifikacja onkogenu n - myc
produkt genu WT1
Nowotwory drobno -
okrągłokomórkowe u dzieci
1. PNET (kości i tkanki miękkie)
a) sarcoma Ewing
b) peripheral neuroepithelioma
c) guz Askina
d) PNET kości
e) pozakostny s. Ewing
(neuralny)
2. Guzy kości
a) osteosarcoma
b) chondrosarcoma
c) prymitywny mięsak kości
3. Guzy tkanek miękkich
a) RMS
b) ppozakostny mięsak Ewing
(nie - neuralny)
4. Neuroblastoma
5. Pozawęzłowy chłoniak
immunofenotypowanie
1.
Neurospecyficzna enolaza
(neuroepitelialne guzy, mięśnie)
2.
Leu 7 - guzy pochodzenia neuralnego
3.
Neurofilamenty - guzy pochodzenia neuralnego
4.
Desmina - guzy pochodzenia miogennego
5.
Aktyna - guzy pochodzenia miogennego
6.
Wimentyna - guzy mezenchymalne, mięsaki,
chłoniaki
7.
Keratyna - guzy zarodkowe, synowiosarcoma,
neurofibrosarcoma
8.
MIC2 - s. Ewing, PNET
cząsteczka keratyny
Badanie radiologiczne (rtg, CT, usg)
•
ocena anatomiczna
•
charakterystyka zaburzeń strukturalnych
Badanie scyntygraficzne
•
zlokalizowanie miejsca przemian
metabolicznych
Scyntygrafia z Ga
67
po terapii chłoniaków
•
ocena masy resztkowej guza
•
diagnostyka wznowy
po okresie remisji
•
ocena reakcji po leczeniu
Scyntygrafia MIBG
•
diagnostyka
•
monitorowanie terapii
•
diagnostyka wznowy
nowotworów układu
neuroendokrynnego
PET/CT
•
połącznie metody badania
obrazowego z lokalizacją
przemian metabolicznych w
tkance (badanie anatomiczno
- czynnościowe)
•
dokładna ocena lokalizacji i
identyfikacja rodzaju patologii
na poziomie molekularnym
•
dokładny staging zmiany
nowotworowej
PET/CT
•
izotopy pozytronowe (18F-FDG), fluorine-IP,
fluorodeoksyglukoza
•
18F - FDG jest akumulowana wewnątrzkomórkowo
następnie ulega fosforylacji (przez heksokinazę) do
18F - FDG - fosforanu i pozostaje w komórce
•
połączenie wizualne obrazu, a także
radioznakowanego analogu glukozy
