Ocena wartości dowodu z badania
DNA

Izolacja

DNA

Izolacja

DNA

Pomiar

stężenia DNA

Pomiar

stężenia DNA

Amplifikacja (PCR) loci

polimorficznych

Amplifikacja (PCR) loci

polimorficznych

Analiza porównawcza –

próbka dowodowa - próbka

referencyjna

Analiza porównawcza –

próbka dowodowa - próbka

referencyjna

Ocena wartości dowodu z
badania DNA (statystyka)

Ocena wartości dowodu z
badania DNA (statystyka)

Przygotowanie opinii

Przygotowanie opinii

Oględziny dowodów, zabezpieczanie

śladów

Oględziny dowodów, zabezpieczanie

śladów

Elektroforeza fragmentów

DNA

Elektroforeza fragmentów

DNA

Interpretacja wyników

Interpretacja wyników

Ekspertyza genetyczna

Sekwencjonowanie

DNA (mtDNA)

Sekwencjonowanie

DNA (mtDNA)

CSF1P

O

D5S81

8

D21S1

1

TH0

1

TPOX

D13S3

17

D7S82

0

D16S5

39

D18S5

1

D8S11

79

D3S13

58

FG

A

VW

A

AME

L

AME

L

Płeć

Penta

E

Penta

D

D2S133

8

D19S4

33

Wybór markerów genetycznych nie jest
przypadkowy

Badania populacyjne

• Ich wyniki stanowią podstawę do wyboru locus jako markera identyfikacyjnego

– Locus powinna charakteryzować wysoka heterozygotyczność
– Zgodność z regułą Hardy’ego-Weinberga (allele niezależne statystycznie w obrębie

locus)

– Brak sprzężenia genetycznego z innymi markerami wykorzystywanymi w procesie

identyfikacji genetycznej (allele niezależne statystycznie dla różnych loci)

• Znajomość częstości alleli niezbędna jest do oceny wartości dowodu z badania DNA

Podstawowa zasada w genetyce populacyjnej, zgodnie z którą

częstości genotypów i alleli w dużych, losowo krzyżujących się

populacjach pozostają niezmienne we wszystkich pokoleniach,

przy założeniu braku mutacji, migracji i doboru naturalnego.

Reguła Hardy’ego – Weinberga

Przykład – reguła Hardy’ego-
Weinberga

• Częstości alleli i genotypów są powiązane za pomocą prostego równania

p

2

+2pq+q

2

= 1

• Częstości genotypów

– AA = 81%
– Aa = 18%
– aa = 1%

• Częstości alleli (populacja 100 osób = 200 alleli)

– A = 162 allele + 18 alleli = 190 alleli = 90% = 0,9 (p)
– a = 2 allele + 18 alleli = 20 alleli = 10% = 0,1 (q)

• p + q = 100% = 1
• Oczekiwana częstość osobników homozygotycznych: AA = 0,9 x 0,9 =

0,81 = p

2

oraz aa = 0,1 x 0,1 = 0,01 = q

2

• Oczekiwana częstość osobników heterozygotycznych: 2 x 0,9 x 0,1 =

0,18 = 2pq

• Reguła HW to przybliżenie stanu rzeczywistego – nie uwzględnia ewolucji
• Zmiany częstości genów w populacjach zachodzą na skutek: 1)mutacji, 2)

działania doboru naturalnego, 3) dryfu genetycznego, 4) migracji

Obliczenia zgodności z regułą Hardy’ego-
Weinberga

• W praktyce porównuje się heterozygotyczność obserwowaną z

heterozygotycznością oczekiwaną (zgodnie z równaniem HW)

• Badania populacyjne pozwalają na określenie

heterozygotyczności obserwowanej (O)

• Za pomocą prostego testu Chi kwadrat możemy ocenić, czy

nasze wyniki są bliskie wartości oczekiwanych (E)

• χ2 = ∑ (O

Aa

– E

Aa

)2/E

Aa

• Test dokładny Fishera można zastosować w tym samym celu
• Oprogramowanie komputerowe umożliwia przeprowadzenie

stosownych obliczeń

Stan równowagi Hardy’ego-Weinberg’a

Marker genetyczny jest w stanie równowagi Hardy’ego-Weinberga, gdy

oczekiwane

częstości genotypów są zgodne z

obserwowanymi

częstościami genotypów.

 Stan równowagi HW dowodzi, że marker jest

stabilny genetycznie

nie

obserwujemy działania presji ewolucyjnej lub nieprzypadkowego
kojarzenia.

 W praktyce testy mogą wykazać potencjalny nadmiar homozygot, który

często tłumaczony jest poprzez „

wypadanie alleli

”, a więc

niedoskonałość testu powodującą uzyskiwanie fałszywych oznaczeń
jednego allela z dwóch różnych istniejących faktycznie – np. mutacja w
miejscu wiązania startera PCR (allele zerowe).

Stan równowagi Hardy’ego-Weinberga może być zakłócony, gdy:

A. ma miejsce pokrewieństwo wśród rodziców → podwyższona liczba
homozygot.
B. istnieje silna istotna substruktura populacji
C. ma miejsce selekcja – osobnicy o pewnych genotypach przekazują je
wydajniej niż osobnicy o innych genotypach

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

1

2

3

4

5

Allele Number

A

ll

el

e

Fr

eq

u

en

cy

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Allele Number

A

ll

el

e

F

re

q

u

en

cy

2. Pula alleli jest próbą losową, a każdy allel jest

niezależnym „losem” z jego rozkładu częstości

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

1

2

3

4

5

6

7

8

Allele Number

A

ll

el

e

Fr

eq

u

en

cy

Rozkład
skorelowany

1. Zależności pomiędzy allelami w różnych

loci

Trzy prawa prawdopodobieństwa

1. Wartości prawdopodobieństw leżą w zakresie od 0 do 1 (0%-

100%)

2. Zdarzenia mogą się wzajemnie wykluczać. W tym przypadku

prawdopodobieństwa poszczególnych zdarzeń możemy
sumować.

-

Prawdopodobieństwo, że zajdzie jedno z dwóch zdarzeń wzajemnie

wykluczających się jest równe 1 czyli 100 %
- Prawdopodobieństwo zdarzenia H = 1 – prawdopodobieństwo zdarzenia G.

3. Jeśli dwa zdarzenia są niezależne od siebie, to ich

prawdopodobieństwa możemy przemnażać. Wtedy
prawdopodobieństwo, że jednocześnie zajdą niezależne
zdarzenia H i G = iloczynowi prawdopodobieństw dla tych
dwóch zdarzeń

O markerach genetycznych, które są od siebie niezależne (są od siebie

odpowiednio oddalone fizycznie przez co dziedziczą się niezależnie)
mówimy, że są w stanie

równowagi sprzężeń

(linkage equilibrium), są

więc statystycznie niezależne.

Markery zależne są w stanie

nierównowagi sprzężeń

(linkage

disequilibrium) – w tym przypadku nie możemy stosować reguły mnożenia
(zdarzenia nie są niezależne od siebie, a więc trzecie prawo
prawdopodobieństwa nie jest spełnione).

Nierównowaga sprzężeń

(linkage disequilibrium, LD)

Testowanie możemy prowadzić również w oparciu o prosty test Chi
kwadrat

Program Arlequin

Analiza porównawcza ślad - próbka
referencyjna

Brak zgodności profili DNA

Porównanie wykazało brak zgodności oznaczonego w próbce
dowodowej profilu DNA z profilem genetycznym oznaczonym w
nadesłanym materiale porównawczym. Należy wykluczyć
możliwość pochodzenia próbki dowodowej od podejrzanego.

Niepełny profil DNA

Częściowy profil genetyczny, który oznaczono w próbce dowodowej
nie pozwala na przeprowadzenie wnioskowania odnośnie zgodności
profili DNA.

Zgodność profili DNA

Profil DNA oznaczony w próbce dowodowej jest zgodny z profilem DNA
charakterystycznym dla podejrzanego A.

Co dalej ?

1. Sprawca pozostawił swój
materiał biologiczny na miejscu
zdarzenia

2. Podejrzany w wyniku działania
przypadku ma taki sam profil DNA
jak materiał pozostawiony na
miejscu zdarzenia (może też być
blisko spokrewniony ze sprawcą ...)

3. Błąd laboratorium

Powody uzyskania zgodności profili

Oskarżenie:
ślad pochodzi
od
podejrzanego

Obrona: ślad
pochodzi od
nieznanego sprawcy,
podejrzany w wyniku
przypadku ma profil
zgodny z profilem
śladu

Hipoteza oskarżenia i hipoteza obrony

Jak ocenić wartość uzyskanego
dowodu

• Naszym zadaniem jest udzielenie odpowiedzi na pytanie,

czy jest prawdopodobne, że do zgodności profili DNA w
analizowanych próbkach doszło na skutek przypadku ?

• Odpowiedź uzyskamy poprzez obliczenie częstości danego
genotypu (profilu DNA) w populacji.

• Jeśli profil DNA jest częsty (np. ma go 1 na 10 osób)
prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności jest wysokie.

• Jeśli jednak okaże się, że profil jest rzadki (np. ma go 1
na 1 miliard osób) prawdopodobieństwo przypadkowej
zgodności jest bardzo niskie.

• Dowód w tym drugim przypadku jest bardzo mocny.

Szansa

a priori

na rzecz winy =

Pr(G)/Pr(nieG)

G

- podejrzany jest winny

nieG

- podejrzany jest niewinny

E

-

dowód z badania DNA

Szansa a priori

na

rzecz winy
podejrzanego -
wynika z wszelkich
informacji
wynikających
z dochodzenia, poza
dowodem
z laboratorium

Szansa a posteriori

na rzecz winy

podejrzanego - ustalona przez sąd -
wynika z wszelkich dopuszczonych
dowodów w sprawie (w tym dow. z
DNA!)

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

nieG

E

P

G

E

P

nieG

P

G

P

E

nieG

P

E

G

P





Szansa
a

posteriori

Szansa
a priori

Iloraz

wiarygodnoś

ci

Miara wartości dowodu

Prawo Bayesa w postaci szansy

dowód z badania DNA

prawdopodobieństwo
prawdopodobieństwo
winy a priori winy a

posteriori

Dowód z badania DNA modyfikuje
prawdopodobieństwo winy a priori

Prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności

(match probability)

Prawdopodobieństwo, że inna

niespokrewniona

osoba wybrana

losowo z populacji ma identyczny profil DNA może być
oszacowane poprzez obliczenie częstości z jaką ten profil DNA
(genotyp) występuje w populacji.

 Częstości alleli poznajemy dzięki badaniom
populacyjnym.

 Populacyjne bazy danych powinny gromadzić dane
dla osób niespokrewnionych o ustalonym
pochodzeniu etnicznym.

 Jaką bazę danych wybrać w celu przeprowadzenia
obliczeń?

-

dla różnych grup etnicznych

- dla jednej grupy etnicznej
- dla regionu np. Małopolski.

P(E|nieG) = prawdopodobieństwo
przypadkowej zgodności dwóch
profili

(match probability, MP)

= prawdopodobieństwo posiadania przez
przypadkową osobę
z populacji profilu DNA zgodnego z
profilem DNA podejrzanego =

częstość

profilu DNA
w populacji

Prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności

Kontradyktoryjność procesu
sądowego

Iloraz dwóch prawdopodobieństw

warunkowych:

H

0

– ustalono dowód, bo podejrzany jest winny

H

1

– ustalono dowód, ale doszło do tego przez

przypadek, a podejrzany w rzeczywistości
jest niewinny

LR (likelihood ratio) - iloraz wiarygodności
służy do porównania prawdopodobieństw
dowodu przy założeniu dwóch alternatywnych
twierdzeń (hipoteza zerowa i hipoteza
alternatywna).

zgodność profili DNA

Iloraz wiarygodności LR – stosunek dwóch prawdopodobieństw
tego samego zdarzenia (zgodności profili DNA) przy założeniu
różnych hipotez.

Jak bardzo dowód (ustalona zgodność
profili DNA) zwiększa
prawdopodobieństwo, że to oskarżony
pozostawił dany ślad?”

)

(

)

(

niewinny

jest

podejrzany

DNA

z

dowód

P

winny

jest

podejrzany

DNA

z

dowód

P

LR

Iloraz wiarygodności

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

nieG

E

P

G

E

P

nieG

P

G

P

E

nieG

P

E

G

P





=

„

uzyskanie zgodności

profilu DNA

podejrzanego

z profilem DNA z miejsca zdarzenia jest

milion

razy bardziej prawdopodobne,

przy założeniu, że jest on sprawcą (źródłem
śladu),

niż

uzyskanie takiej zgodności

,

jeżeli ślad

pozostawiła inna, niespokrewniona
z podejrzanym osoba, a zgodność
podejrzanego jest dziełem przypadku”

Sposób wyrażania wyniku analizy LR

Wartość LR

przekłada się liczbowo na

szansę powtórzenia się danego
zgodnego profilu DNA w populacji

np.

LR = 100 bilionów

szansa powtórzenia się powyższego profilu
DNA w populacji ... wynosi jak

1 na 100

bilionów

niespokrewnionych osób.

Która hipoteza jest bardziej
prawdopodobna

hipoteza prokuratury – to podejrzany popełnił
przestępstwo. Prawdopodobieństwo zgodności
profili DNA jest wtedy równe 100%; Hp = 1

hipoteza obrony – to inna losowa osoba z populacji
popełniła przestępstwo, a zgodność profili jest
dziełem przypadku

Która hipoteza jest bardziej
prawdopodobna

1

Częstość genotypu w
populacji

Marker

genetyczny

Allel 1

Allel 2

p

q

Wzór

Częstość

genotypu

D3S1358

15

16

0.26159

0.25331

2pq

0.1325

Reguła mnożenia

(product rule)

Częstość profilu DNA obliczana jest poprzez
oszacowanie częstości genotypu dla każdego
locus, a następnie przemnożenie wartości dla
wszystkich loci genetycznych.

Reguła mnożenia może być zastosowana dzięki
niezależności analizowanych markerów
genetycznych.

Która hipoteza jest bardziej
prawdopodobna

1

Częstość genotypu w
populacji

Marker

genetyczny

Allel 1

Allel 2

p

q

Wzór

Częstość

genotypu

D3S1358

15

16

0.26159

0.25331

2pq

0.1325

VWA

17

18

0.28146

0.20033

2pq

0.1128

D16S539

12

11

0.32616

0.32119

2pq

0.2095

Analiza wielu niezależnych markerów DNA

Marker

genetyczny

Allel 1

Allel 2

p

q

Wzór

Częstość

genotypu

D3S1358

15

16

0.26159

0.25331

2pq

0.1325

VWA

17

18

0.28146

0.20033

2pq

0.1128

D16S539

12

11

0.32616

0.32119

2pq

0.2095

D2S1338

19

24

0.26124

0.22132

2pq

0.1156

D8S1179

13

12

0.30464

0.18543

2pq

0.1130

D21S11

30

29

0.27815

0.19536

2pq

0.1087

D18S51

15

16

0.15894

0.13907

2pq

0.0442

D19S433

12

13

0.16124

0.15426

2pq

0.0497

TH01

9.3

6

0.36755

0.23179

2pq

0.1704

FGA

22

21

0.21854

0.18543

2pq

0.0810

Częstość profilu DNA

1.35 x 10

-10

Brak zgodności profili DNA

Profil DNA oznaczony w próbce dowodowej jest zgodny z
profilem DNA charakterystycznym dla podejrzanego A.

Brak zgodności profili DNA

Prawdopodobieństwo, że ujawniona zgodność jest dziełem przypadku
wynosi
1 x 10-12, innymi słowy teoretyczna szansa powtórzenia się danego
zgodnego profilu DNA w populacji niespokrewnionych mieszkańców
Polski wynosi jak 1: 1 biliona osób.

Profil DNA oznaczony w próbce dowodowej jest zgodny z profilem DNA
charakterystycznym dla podejrzanego A.

Zgodność profili DNA jest 1 bilion razy bardziej prawdopodobna jeśli,
to podejrzany jest źródłem próbki dowodowej, niż jeśli jakaś inna
przypadkowa osoba z populacji stanowi jej źródło.

Wartości ilorazu wiarygodności (LR)
wspomagające hipotezę oskarżenia:

1 - 10 dowód słaby

10 - 100 średni umiarkowany

100 - 1000 umiarkowanie mocny

1000 - 10 000 mocny

10 000 - 100 000 bardzo mocny

wyjątkowo mocny > 1 milion

Skala obrazująca wartość dowodu

N=260 mln mieszkańców USA (System CODIS -
13 loci typu STR) – US FBI październik 1997

Jeżeli z dużą statystyczną precyzją określi się,
że ślad pochodzi od podejrzanego, to znaczy, że
naprawdę od niego pochodzi, a jeżeli inne
dowody przemawiają na korzyść podejrzanego,
należy znaleźć inne wytłumaczenie ustalonej
zgodności:

- naniesienie w innym czasie, niezależnym od
zdarzenia
- ślad mógł być celowo podrzucony

Konserwatywny sposób wypowiadania się co
do źródła pochodzenia śladu przez FBI

Problem częstości rzadkich alleli

Dla alleli bardzo rzadkich przyjmuje się wartość częstości = 5/2N
(zalecane przez NRC II)

Układ polimorficzny

Siostra NN?

NN

D3S1358

15, 18

15, 18

VWA

17, 18

17, 18

D16S539

12

12

D2S1338

16, 25

16, 25

Amelogenina

X

X, Y

D8S1179

10, 15

10, 15

D21S11

29, 30.2

29, 30.2

D18S51

16, 17

16, 17

D19S433

15, 16

13, 15

TH01

7, 9

7, 9.3

FGA

21, 22

21, 22

• Współczynnik pokrewieństwa F (Theta) – miara poziomu

pokrewieństwa pomiędzy dwiema osobami

• Prawdopodobieństwo, że dana osoba posiada kopię allela

przodka (identical by descent, ibd)

• Dla rodzica i dziecka oraz rodzeństwa F=1/4
• Dla wuja i siostrzenicy F=1/4
• Dla kuzynów pierwszej linii F=1/16
• Przy kojarzeniu w pokrewieństwie oczekiwana częstość

heterozygot jest zredukowana właśnie o współczynnik F

• Przy obliczaniu wartości dowodowej w sprawach dot. spornego

ojcostwa w pokrewieństwie należy zastosować odpowiednią
korektę

Problem pokrewieństwa podejrzanych

Związek z podejrzanym

Prawdopodobieństwo zgodności

Niespokrewniony

1 na miliard

Pierwszy kuzyn

1 na 100 milionów

Pół-rodzeństwo

1 na 10 milionów

Rodzic/dziecko

1 na 1 milion

Rodzeństwo

1 na 10 tysięcy

Problem pokrewieństwa podejrzanych

• Dochodzenie spornego ojcostwa (czy ten mężczyzna

jest biologicznym ojcem dziecka?)

• Dochodzenie spornego pokrewieństwa (czy ten

mężczyzna jest wujkiem dziecka?)

• NN –identyfikacja szczątków ludzkich (czy ten

fragment ludzkiego ciała pochodzi od zaginionego

krewnego?)

Analiza pokrewieństwa (podstawowa)

• Więcej niż jeden analizowany scenariusz

• Masowe groby, katastrofy
• Sprawy imigracyjne

• Jednocześnie można porównywać

pomiędzy sobą tylko dwie alternatywne
hipotezy.

• Zaawansowane programy komputerowe do

rozwiązywania tego rodzaju problemów,
np. DNA_VIEW.

Analiza pokrewieństwa (zaawansowana)

Dochodzenie spornego ojcostwa

Współczynnik ojcostwa

(paternity index, PI

= LR)

Iloraz wiarygodności: H

p

/H

d

H

p

= szansa, że to pozwany przekazał allel

H

d

= szansa, że inny przypadkowy mężczyzna przekazał

allel

H

p

= 1 jeśli ojciec jest homozygotą

H

p

= 0.5 jeśli ojciec jest heterozygotą

D3 :
Matka: 15, 17
Dziecko: 15
Ojciec: 15
15 to allel pochodzący od ojca, częstość = 0.2335

PI = 1/0.2335 = 4.28

Łączny współczynnik ojcostwa

(combined

paternity index, CPI)

Współczynnik ojcostwa CPI = sumaryczna wartość LR
- Uzyskanie wyników analizy (brak wykluczenia
pozwanego)

jest

100

000

razy

bardziej

prawdopodobne, przy założeniu, że pozwany jest
biologicznym ojcem dziecka ...,

niż uzyskanie powyższych wyników analizy DNA, przy
założeniu, że biologicznym ojcem jest inny
niespokrewniony z nim mężczyzna, a pozwany nie
wyklucza się w wyniku działania przypadku.

Wynik w postaci współczynnika ojcostwa
(LR)

PI = L = 100 000

a priori

p = 0,5 wówczas

[W = L /(L + 1)]

prawdopodobieństwo ojcostwa (a

posteriori) W = 99,999%

Prawdopodobieństwo ojcostwa (W)

•Inny (bardziej przejrzysty dla sądu sposób wyrażenia
prawdopodobieństwa

•Prawdopodobieństwo ojcostwa

W = pL /(pL + 1-p)

• W = Wahrscheinlichkeit (prawdopodobieństwo)
• p = prawdopodobieństwo a priori
• L = PI

PI = L = 100 000

a priori

p = 0.2 wówczas

[W = pL /(pL + 1-p)]

prawdopodobieństwo ojcostwa (a

posteriori) W = 99,996%

Prawdopodobieństwo ojcostwa (W)

• Wiarygodny mężczyzna twierdzi, że oskarżenie kobiety
jest fałszywe

• Statystyka mówi, że np. w podobnych przypadkach tylko 1 raz
na 5 mężczyzna jest winny

• p zamiast 0,5 może zostać ustalone na 1/5 tj. 0.2

14,18

15,18

15,17

14

,18

13

,17

15,17

Typowa transmisja

alleli (brak mutacji)

Mutacja ojcowska

Problem mutacji w komórkach
płciowych

STR

G

M

G

C

G

AF

G

B

D8S1179

12,14

12,14

14,15

14,15

D21S11

29,30.2

30,30.2

29,30

29,30.2

D7S820

9,11

8,11

8,9

9,12

CSF1PO

10

10

10

10

D3S1358

15

15

15

15

TH01

9,9.3

9,9.3

7,9.3

7,9.3

D13S317

8

8,9

8,9

8,13

D16S539

8,12

8,12

8,12

8,12

D2S1338

20,25

17,20

17,20

17,20

D19S433

14,15

13,15

13,14

14,15

vWA

16,17

16,17

17

16,18

TPOX

8

8

8

8

D18S51

13,17

13,17

13,17

13,17

Amelogenin

X

X

X,Y

X,Y

D5S818

11,12

11,13

11,14

11,12

FGA

20

20,23

21,23

21,23

Sprawa dotycząca kazirodztwa