FENOTYPOWE I

GENOTYPOWE METODY

IDENTYFIKACJI I

RÓŻNICOWANIA

DROBNOUSTROJÓW

FENOTYP



Fenotyp zespół cech organizmu

włączając w to nie tylko morfologię
także właściwości fizjologiczne , cykl
życiowy , wpływ środowiska na
organizm.



Fenotyp jest ściśle związany z

genotypem.

RÓŻNICOWANIE
FENOTYPOWE



Cechy fenotypowe:

-morfologiczne: kształt(np. kulisty,

pałeczkowaty), rozmiary,
barwienie(G+,G-),rzęski, otoczki

-fizjologiczne: enzymy łańcucha

oddechowego, metabolizmu białkowego
,aminokwasów, końcowe produkty
metabolizmu

-chemiczne: struktura ściany komórkowej,

struktura antygenowa

RÓŻNICOWANIE
FENOTYPOWE



W rutynowej diagnostyce

mikrobiologicznej różnicowanie
drobnoustrojów przeprowadza się
najpierw na podstawie cech
fenotypowych .



Ocenia się morfologię i wzrost

drobnoustrojów na odpowiednich
podłożach mikrobiologicznych czyli
zewnętrzne efekty ekspresji
informacji genetycznej.

RÓŻNICOWANIE
FENOTYPOWE



Obserwuje się zmienność fenotypową

szczepów związaną z warunkami
środowiskowymi takimi jak stosowane
środki dezynfekcyjne , antybiotyki,
specyfika oddziału. Zmienność
związaną z odpornością chorych ,
miejscem zakażenia , obecnością flory
fizjologicznej.

METODY
FENOTYPOWANIA



BIOTYPOWANIE



SEROTYPOWANIE



TYPOWANIE BAKTERIOFAGOWE



ANTYBIOGRAM



ELEKTROFOREZA BIAŁEK

-PROFIL BIAŁEK KOMÓRKOWYCH
-IMMUNOBLOTTING
-METODA MLEE
-ZYMOTYPOWANIE

BIOTYPOWANIE



W badaniach epidemiologicznych lub

ekologicznych w celu określenia źródła
szczepu lub drogi jego rozprzestrzeniania
może zaistnieć dokładniejszej charakterystyki
analizowanych szczepów ludzkich i
zwierzęcych.



Na przykład Staphylococcus aureus :

-wytwarzanie staphylokinazy
-β-hemolizy
-koagulacja osocza bydlęcego
-typ wzrostu pojedynczych kolonii na agarze

z fioletem krystalicznym

SEROTYPOWANIE



Immunologiczna analiza antygenów

powierzchniowych czyli serotypowanie jest
najpowszechniej wykorzystywana do
określania typu serologicznego otoczki oraz
typu koagulazy może być metodą
uzupełniającą do innych metod serologicznych
.

TYPOWANIE
BAKTERIOFAGOWE



Do typowania ludzkich szczepów

Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa stosuje się międzynarodowy
zestaw fagów ,polega to na wysokiej
specyficzności fagów bakterie mają
specyficzny wzór fagowy –lizowane są przez
określone fagi.



Dzięki tej metodzie zidentyfikowano wiele

epidemii .

ANTYBIOGRAM



Lekooporność/ lekowrażliwość



Podstawowa metoda różnicowania szczepów

zyskała szerokie zastosowanie w placówkach
diagnostycznych jako nieliczna jest metodą
wystandaryzowaną co umożliwia
porównywanie wyników między różnymi
ośrodkami diagnostycznymi.



W badaniach rutynowych stosuje się metodę

dyfuzyjno-krążkową oznacza się wrażliwość
na antybiotyki.

ELEKTROFOREZA-
ANALIZA PROFILU BIAŁEK
KOMÓRKOWYCH



Techniki elektroforetyczne pozwalają na porównanie
cech w oparciu o różnice białek komórkowych
powierzchniowych i wydzielniczych lub po lizie
komórek.



Analiza wszystkich białek otrzymanych po degradacji
komórek poddanych działaniu lizostatyny może być
wykonana na żelu poliakryloamidowym (PAGE).



Mała powtarzalność rozdziałów elektroforetycznych
stawia metodę o niewielkiej przydatności do
typowania S.aureus.

ELEKTROFOREZA
BIAŁEK
IMMUNOBLOTTING



Metoda polegająca na wykonaniu reakcji

Western-blot znakowanymi przeciwciałami z
rozdzielonymi w trakcie elektroforezy
antygenami danego szczepu.



Immunoblotting jest łatwiejsza i prostsza w

interpretacji od metody elektroforezy profilu
białek komórkowych.

ELEKTROFOREZA
BIAŁEK MLEE



Typowanie metodą MLEE oparte jest na

polimorfizmie badanych enzymów
komórkowych .



Zmienność enzymatyczna jest

odzwierciedleniem rożnic genetycznych
powstałych w loci tych enzymow. Szczepy
bakteryjne mogą zostać zaklasyfikowane do
poszczególnych typów elektroforetycznych na
podstawie otrzymanych wzorów
elektroforetycznych.

ELEKTROFOREZA
BIAŁEK
ZYMOTYPOWANIE



Zymotypowanie jest jedną z odmian metody

elektroforezy typu MLEE. Opiera się na
polimorfizmie enzymów gronkowcowych
należących do grupy lipaz, esteraz.



Polimorfizm enzymów jest określany na

podstawie różnic w ruchliwości elektroforetycznej
w żelu poliakryloamidowo-agarozowym
spowodowanych różnym zakresem aktywności
wobec pięciu syntetycznych substratów.

GENOTYP



Zespół genów danego osobnika

warunkujących jego właściwości
dziedziczne.



Materiał genetyczny jest unikalny i

stały dla każdego organizmu (w
porównaniu do cech fenotypowych).

GENOTYPOWANIE



Obecnie główną rolę w typowaniu bakterii, a

w tym także gatunku S. aureus przejęły
metody molekularne oparte na analizie
genomu bakteryjnego, zwłaszcza w
przypadkach zakażeń powodowanych przez
atypowe szczepy niemające typowych cech
biochemicznych .



Metody genotypowe stosuje się przede

wszystkim do wykrywania szczepów które są
bardzo trudne w hodowli albo namnażają się
bardzo powoli.

SONDY DNA



DNA zbudowane jest z dwóch

komplementarnych nici kwasów nukleinowych
możliwe jest wykrycie jednoniciowych
sekwencji metodą hybrydyzacji przy użyciu
znakowanych pojedynczych nici.



Sondy mogą być znakowane radioaktywnie

lub nieradioaktywnymi cząstkami
znacznikowymi (biotyna ,dioksygenina).



Sondy molekularne z uzyciem techniki PCR są

często używane w diagnostyce
mikrobiologicznej.

ZALETY SOND
MOLEKULARNYCH



Drobnoustroje za pomocą sond są wykrywane

nawet gdy są martwe



Są szczególnie przydatne przy masowych

badaniach przesiewowych i epidemiologicznych



Dotyczy to występowania w materiale bardzo

małych ilości drobnoustrojów np.

-Mycobacterium sp., Chlamydia sp.
-wirusy HIV,HCV,
-pierwotniaki

HYBRYDYZACJA



W fazie stałej-poszukiwana cząsteczka lub

sonda są przytwierdzone do błony nylonowej,
nitrocelulozowej(technika colony blot i dot
blot)



W fazie płynnej-wykrywana cząsteczka i

sonda są w fazie płynnej



In situ –do wykrywania DNA bakteryjnego w

zakażonej tkance

AMPLIFIKACJA I
SEKWENCJONOWANIE



Sekwencją docelową do identyfikacji bakterii

bardzo trudnych w hodowli jest często swoisty
region w obrębie 16 S rRNA , w którym pewne
segmenty są identyczne dla wszystkich
bakteri.Pomiędzy tymi regionami występują
również swoiste fragmenty dla gatunku lub
rodzaju.



Uzyskane sekwencje zasad porównuje się z

danymi w bibliotece referencyjnej.

AMPLIFIKACJA I CHIPY

GENOWE



Wykorzystuje się tysiące nukleotydów

swoistych dla bekteri chorobotwórczych
przytwierdzonych do chipa o powierzchni
ok.2cm² .Chip pokrywany jest
zamplifikowanym i oznakowanym
jednoniciowym DNA (zawierającym
np.gatunkowo swoiste sekwencje)
pochodzącym z badanego materiału.
Mierzymy stopień wiązania się z
komplementarnymi sekwencjami metoda
fluorescencji, specjalnym czytnikiem.

ANALIZA PROFILI
PLAZMIDOWYCH



Metoda genotypowania oparta na izolacji DNA

plazmidowego z komórek bakteryjnych i
rozdziale elektroforetycznym w żelu
agarozowym.



W zależności od wielkości i ilości plazmidów w

komórce otrzymuje się charakterystyczne
wzory plazmidowe



Metoda ma zastosowanie tylko do szczepów

posiadających plazmidy np. Salmonella,E.coli.

TESTY AMPLIFIKACJI
DNA TECHNIKĄ PCR



Amplifikacja znanych regionów genomu połączona z
analizą restrykcyjną (PCR-RFLP) lub równoczesnej
amplifikacji dwóch lub więcej różnych fragmentów
DNA w jednej mieszaninie reakcyjnej.



Produkty PCR poddaje się trawieniu enzymami
restrykcyjnymi, dobiera się je znając sekwencję
powielonego DNA. Wykrywa się charakterystyczny
dla danego drobnoustroju polimorfizm długości
fragmentów restrykcyjnych wykrywany metodą
elektroforezy żelowej na poziomie gatunku
np.Listeria,Borrelia.

REAL-TIME PCR



Technika detekcji kwasów nukleinowych, w

szczególności w wykrywaniu mutacji, analiza
ilościowa.



Podczas reakcji ilość amplifikowanego DNA

monitoruje się używając technik
fluorescencyjnych. Pozwala to na wykrycie na
początku reakcji pojedynczych cząsteczek
matrycy.



Metoda bardzo czuła, wymaga niewielkich

ilości DNA.



Można przeprowadzić różnicowanie na

poziomie szczepu.

HYBRYDYZACJA DNA-
DNA



Określanie przynależności do badanego

genotypu oparta na ilościowym podobieństwie
w chromosomalnym DNA .



Zastosowanie w badaniach naukowych.

GENOTYPOWANIE



W mikrobiologii zidentyfikowano i dokładnie

scharakteryzowano geny drobnoustrojów
pełniące takie funkcje, jak: odpowiedzialność
za cechy inwazyjności, toksyczności i
oporności na leki.
Znajduje to szerokie i trudne do przecenienia
zastosowanie w diagnostyce zakażeń, w
genotypowaniu drobnoustrojów dla celów
epidemiologicznych, a więc określaniu
podobieństwa i wspólnego pochodzenia,
ustalaniu źródeł i dróg szerzenia się
patogenów. 

DZIĘKUJEMY

ZA UWAGĘ

KONIEC