METODY IDENTYFIKACJI DROBNOUSTROJÓW
KRYTERIA IDENTYFIKACJI – identyfikacja polega na określeniu przynależności badanego organizmu do odpowiedniej jednostki taksonomicznej.
MIKROORGANIZMÓW PROKARIOTYCZNYCH – bakterie stanowią najlepiej scharakteryzowana grupę drobnoustrojów.
METODY KONWENCJONALNE – obejmują morfologię, skład chemiczny ściany komórkowej, obecność inkluzji komórkowych, obecność substancji zapasowych, zdolność do tworzenia barwników, sposób odżywiania, wymagania pokarmowe, zdolność do metabolizowania sacharydów, związków azotu i siarki, skład jakościowy i ilościowy produktów fermentacji, stosunek do tlenu, zakres pH i temperatur wzrostu, wrażliwość na antybiotyki, patogenność, zależności symbiotyczne, środowisko występowania, charakterystykę immunologiczną.
METODY BIOLOGII MOLEKULARNEJ – obejmują analizę ilościowa kwasów nukleinowych, homologie kwasów nukleinowych, kariotypowanie elektroforetyczne, analizę polimorfizmu miejsc restrykcyjnych RFLP, PCT i AFLP, metody analizy porównawczej RNA rybosomowego, znali ze sekwencyjną 23S rRNA, amplifikację rejonów podjednostki 16S rRNA.
GRZYBÓW – podstawowym kryterium jest sposób rozmnażania generatywnego, ale rozpatruje się także:
U DROŻDŻY – cechy morfologiczne komórki, sposób rozmnażania wegetatywnego, cechy hodowlane populacji, tworzenie pigmentu, zdolność do tworzenia wegetatywnych spor, pseudogrzybni i grzybni, cechy biochemiczne (tworzenie ureazy, zdolność asymilacji i fermentacji różnych źródeł węgla, asymilacji azotanów, osmotolerancyjność, osmofilność), budowę ściany komórkowej (zawartość gluka nów, mannanów i chityny), ekologię oraz patogenność, analizę DNA, zgodność sekwencji 18S rRNA.
U GRZYBÓW STRZĘPKOWYCH – morfologia i cechy makroskopowe tworzonej grzybni oraz właściwości biochemiczne.
METODY IDENTYFIKACJI DROBNOUSTROJÓW – powinny być szybkie, czułe i łatwe.
BIOCHEMICZNE – polegają na określeniu zdolności mikroorganizmów do asymilacji (konwersja składnika odżywczego do związków budulcowych i energii w formie ATP), fermentacji (beztlenowa enzymatyczna konwersja związków organicznych do prostszych związków i energii w formie ATP) i rozkładu określonych związków. Cechy biochemiczne określa się na odpowiednio skomponowanych pożywkach wzrostowych, obserwując wzrost, zmianę zabarwienia pożywki czy wydzielanie gazu. Wyniki analizuje się numerycznie. Badany szczep zostaje opisany przez kod liczbowy. Obecnie używa się gotowych zestawów z mini probówkami zawierającymi zróżnicowane, zliofilizowane pożywki z indykatorami.
TESTY API – 15 systemów obejmujących niemal wszystkie grupy bakterii znajdowane w użytkowych laboratoriach mikrobiologicznych. Rezultat odczytuje się jako reakcje barwną. Tego typu analizatory pozwalają tez na identyfikacje antybiotykowrażliwości. Ponadto uzyskuje się pełen profil biochemiczny drobnoustroju oraz dodatkowe informacje dotyczące nietypowych testów lub dalszych testów pozwalających na rozróżnienie zbliżonych gatunków.
SYSTEM IDENTYFIKACJI BIOLOG – oparty na analizie zdolności testowanego mikroorganizmu do wykorzystania 95 związków będących źródłami węgla. Rezultat odczytuje się jako reakcje barwną. Możliwe jest uzyskanie charakterystycznego obrazu testu – fingerprint, unikatowego dla gatunku drobnoustroju.
POŻYWKI CHROMOGENNE I FLUOROGENNE – pożywki zawierające substrat chromogeny lub fluorogenny. Mikroorganizmy dają na takich pożywkach kolonie o zróżnicowanyc zabarwieniu lub fluorescencji. Większość takich substratów jest objęta patentem, ale znane są: salmon-GAL (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozyd) – substrat β-galaktozydazy, X-glukuronid – chromogen β-glukuronidazy, MUG – pod w pływem β-glukuronidazy rozpada się na związek świecący w UV. Metodę ta stosuje się do wykrywania patogenów w surowcach, produktach żywnościowych oraz materiale klinicznym. Identyfikuje się tak m.in. E. coli.
BIOFIZYCZNE:
ELEKTROFOREZA BIAŁEK – wytwarzanych przez mikroorganizmy. Ich skład jakościowy i ilościowy jest cechą charakterystyczna danej jednostki taksonomicznej. Umożliwia uzyskanie profili białkowych i ich porównywanie. Identyfikacje często poprzedza hodowla mikroorganizmów na pożywce zawierającej aminokwas znakowany radioaktywnie. Marker zostaje wbudowany do białek mikroorganizmów, które następnie poddaje się izolacji i przeprowadza elektroforezę SDS-PAGE.
CHROMATOGRAFIA GAZOWA – jest stosowana do uzyskania profilu kwasów tłuszczowych pochodzących z lipidów błony komórkowej. Skład lipidów jest unikatowy dla każdego gatunku (a nawet podgatunku) przy zachowaniu kontrolowanych warunków hodowli, gdyż jest kodowany przez chromosom bakteryjny i nie ma na niego wpływu informacja kodowana w plazmidach. Komórki bakteryjne poddaje się saponifikacji, podczas której następuje alkaliczna hydroliza triacylogliceroli i uwolnienie kwasów tłuszczowych. Następnie prowadzi się etylowanie kwasów tłuszczowych oraz ich ekstrakcje z fazy wodnej w celu zwiększenia ilości i przeprowadza chromatografie gazową.
CHROMATOGRAFIA GAZOWO-CIECZOWA (GLC) – detekcja lotnych końcowych produktów metabolizmu. Pozwala identyfikować bakterie sporujące i acydotermofilne w sokach owocowych. Alicyclobacillus wytwarza gwajakol, który można wykryć nawet w śladowych ilościach.
SPEKTROSKOPIA W PODCZERWIENI Z TRANSFORMACJĄ FOURIERA (FTIR) – uzyskanie w podczerwieni widm komórek poddanych dezintegracji, co jest odzwierciedleniem ich składu chemicznego.
BIOLOGII MOLEKULARNEJ – oparte na badaniu homologii kwasów nukleinowych.
SONDY GENETYCZNE – przyjmuje się, że homologia kwasów >60% ten sam gatunek, >20% ten sam rodzaj, 1-5% brak pokrewieństwa. Duże znaczenie ma porównywanie rRNA, gdyż występuje w dużej liczbie kopii.
PCR,
POLIMORFIZM MIEJSC RESTRYKCYJNYCH – fingerprint.
IMMUNOLOGICZNE – oparte na specyficznej reakcji zachodzącej pomiędzy przeciwciałem a antygenem, którym mogą być komórki mikroorganizmów lub ich metabolity.
TESTY AGLUTYNACYJNE – umożliwiają diagnozowanie mikroorganizmów na podstawie analizy antygenów ścian komórkowych, komórek lub specyficznych toksyn. W celu wzmocnienia wizualnego efektu aglutynacji, cząsteczki lateksu opłaszcza się przeciwciałami, co powoduje wtórna aglutynację spowodowana agregacją cząsteczek lateksu.
TECHNIKI IMMUNOENZYMATYCZNE EIA (enzyme immuno assai) – przeciwciała lub antygeny są połączone z enzymami lub radioizotopami. Reakcja pomiędzy antygenem i przeciwciałem jest wykrywana przez specyficzne znakowanie samego przeciwciała fluorochromami, radioizotopem lub enzymem, co umożliwia wykrycie reakcji immunologicznej po dodaniu kompleksu chromogenu z substratem enzymu. Pozwala to na wykrycie nawet małych ilości antygenu.
TECHNIKI IMMUNOENZYMOFLUORESCENCYNE – komórki znakowane przeciwciałem z markerem fluorescencyjnym mogą być rozdzielane w cytometrze fluorescencyjnym. Technika FACS wykorzystuje laser do aktywacji fluorescencji przeciwciała, co umożliwia sortowanie komórek z różnymi znacznikami w polu elektrycznym.
TECHNIKA ELISA (enzyme linked immunosorbent assai):
METODA BEZPOŚREDNIA WSPÓŁZAWODNICZA (direct competitive ELISA) – wiązanie w pierwszej kolejności przeciwciała specyficznego dla danego antygenu z faza stałą. Następnie dodawana jest określona ilość antygenu oznakowanego enzymem oraz badana próba, która zawiera antygen nie połączony z enzymem – nieoznakowany. Liczba miejsc wiążących przeciwciała jest ograniczona, więc istnieje kompetycja pomiędzy Antygenem oznakowanym i badanym. Ilość oznakowanego antygenu związanego z przeciwciałem jest odwrotnie proporcjonalna do zawartości antygenu w próbie.
METODA POŚREDNIA WSPÓŁZAWODNICZA (indirect competive ELISA) – stosuje się nieoznakowane przeciwciało specyficzne dla antygenu, a następnie wtórne przeciwciało połączone z enzymem.
METODA KANAPKOWA (double antibody Sandwich ELISA) – antygen pochodzący z badanej próby zostaje unieruchomiony pomiędzy dwoma warstwami przeciwciał. Przeciwciało specyficzne dla antygenu zostaje związane z faza stałą. Jeżeli z badanym materiałem wprowadzony jest antygen, to zostaje on związany z przeciwciałem i unieruchomiony na nośniku. Niezwiązane antygeny zostają wymyte buforem i usunięte, po czym wprowadza się 2 porcję specyficznych przeciwciał, związanych z enzymem. Barwny kompleks powstaje w wyniku reakcji immunoenzymatycznej pomiędzy unieruchomionym na nośniku, antygenem pochodzącym z badanego materiału oraz przeciwciałem oznakowanym enzymem a substratem enzymatycznym wprowadzonym do środowiska reakcji. Test kanapkowy znalazł zastosowanie w immunochromatografi.