HODOWLANE I NIEHODOWLANE

METODY WYKRYWANIA

DROBNOUSTROJÓW

Celem diagnostyki mikrobiologicznej

jest:

●

Identyfikacja czynnika etiologicznego
odpowiedzialnego za zakażenie.

●

Określenie profilu wrażliwości drobnoustroju na
chemioterapeutyki.

●

Nadzór mikrobiologiczny i epidemiologiczny.

Metody wykorzystywane w mikrobiologi

można podzielić na:

●

Bezpośrednie -polegające na wykryciu
drobnoustroju w materiale badanym.

●

Pośrednie – oparte na wykrywaniu swoistych
przeciwciał.

Inny podział tych metod to:

●

Metody konwencjonalne (hodowlane)

●

Metody niehodowlane.

Metody hodowlane

Metody hodowli drobnoustrojów połączone są z
izolacją i identyfikacją mikroorganizmu. W
pobranym i badanym materiale występują różne
gatunki drobnoustrojów, w celu ich wyizolowania,
namnożenia i uzyskania czystej hodowli , próbkę
posiewa się na odpowiednie podłoża wzrostowe.
Oprócz identyfikacji czynnika etiologicznego
powinny być wykonane też testy wrażliwości na
antybiotyki.

Posiew bakterii

Posiew- zakładanie kolonii (hodowli).
Podstawową metodą diagnostyki bakteriologicznej
i mikrobiologicznej w mikrobiologii klinicznej jak i
badawczej to metoda uzyskiwania pojedynczych,
odosobnionych kolonii bakterii (grzybów) na
podłożu mikrobiologicznym.
Hodowla drobnoustrojów- stworzenie
odpowiednich warunków, w których bytują
drobnoustroje.

Warunki hodowli muszą być dostosowane

do rodzaju i wymagań drobnoustroju.

Warunki hodowli drobnoustrojów:
- odpowiedni rodzaj pożywki (zawartość

składników odżywczych)

- czynniki chemiczne (pH, tlenowość)
- czynniki fizyczne (temperatura inkubacji)

Rodzaje hodowli

hodowla czysta-
zawiera jeden
gatunek
drobnoustrojów

hodowla mieszana-
zawiera drobnoustroje
z różnych gatunków

Hodowla statyczna

Krzywa rzeczywista wzrostu populacji bakterii w hodowli statycznej

.

Faza zastoju (lag faza) - następuje po wsianiu bakterii do podłoża. Ilość bakterii w tej
fazie nie wzrasta, a nawet czasami następuje ich spadek liczebności. Jest to okres w
którym drobnoustroje przystosowują się do nowego środowiska

Faza młodości fizjologicznej - komórki intensywnie oddychają, szybko powiększają
swoje wymiary ale nie dzielą się. Komórki w tej fazie są bardziej wrażliwe na różne
niekorzystne czynniki. Faza ta jest bardzo krótka i kończy się w momencie kiedy komórki
zaczynają się dzielić.

Faza logarytmicznego wzrostu - na początku fazy wielkość komórek ulega zmniejszeniu
by następnie utrzymywać się na stałym poziomie. Komórki bardzo intensywnie dzielą się
przy zachowaniu stałej częstości podziału. Nie zmienia się wiek osobniczy komórek.
Długość tej fazy zależy od czynników środowiskowych jak i od cech danej bakterii. Faza ta
może ulec skróceniu na skutek wyczerpania się składników pokarmowych, nadmiernego
nagromadzenia toksycznych produktów metabolizmu itp.

Faza równowagi - następuje zwolnienie tępa podziałów. Przyrost liczby komórek z
podziału i ich ubytek powodowany zamieraniem jest w stanie równowagi w wyniku czego
liczba żywych komórek pozostaje na stałym poziomie. Komórki ulegają zmianom stają się
nieregularne, powstają formy rozdęte.

Faza zamierania - podziały stają się bardzo rzadkie, a przypadki śmierci komórek stają się
coraz częstsze a w rezultacie liczba komórek maleje.

Faza logarytmicznego zamierania - podziały komórek prawie całkowicie ustają, a
komórki zamierają. W rezultacie liczba komórek stale maleje. W niekorzystnych 
warunkach zamieranie może zachodzić bardzo szybko wówczas mówimy o fazie śmierci
logarytmicznej.  

Hodowla ciągła

W przeciwieństwie do hodowli statycznej
umożliwia ona ciągły wzrost bakterii w fazie
logarytmicznego wzrostu. Uzyskuje się je
zapewniając stały dopływ jałowej (czystej)
pożywki do miejsca hodowli drobnoustrojów oraz
odpływ nadmiaru podłoża, który zawiera produkty
metabolitu, wraz z nadmiarem hodowli.

Hodowle zsynchronizowane

Ich cechą charakterystyczną jest podobny czas

dzielenia się drobnoustrojów.
Hodowlę tą otrzymujemy:

- poprzez przeniesienie bakterii do temp. 4o C, pod

wpływem szoku termicznego bakterie przestają
rosnąć. Przeniesienie bakterii do temp. 37o C

powoduje wzrost bakterii.
- wirowanie
- sączenie bakterii poprzez sączki bakteryjne. Używa

się filtrów membranowych z małymi porami (metoda

selektywna)

Podział drobnoustrojów ze względu na:

●

Wymagania tlenowe:

- tlenowce- rosną tylko w obecności tlenu

- beztlenowce (bezwzględne)- nie rosną w obecności tlenu: Clostridium

- mikroaerofile (względne beztlenowce)- rosną w warunkach beztlenowych jak i przy
zawartości tlenu 2-8%

●

Wymagania temperaturowe:

- psychrofile (zimnolubne, rosną w temp. od minusowych do +20oC)

- mezofile (optimum wzrostu w temp. od 30oC do 40oC)- większość drobnoustrojów
występujących w środowisku, mikroorganizmy saprofityczne, mikroorganizmy
chorobotwórcze

- termofile (ciepłolubne, temp. wzrostu 35oC – 60oC a nawet 90oC)

●

Kwasowość:

- alkalifile- rozwijają się w środowisku alkalicznym (pH 8-11)

- neutrofile- rozwijają się w pH 6,5-7

- acidofile- rozwijają się w pH 2-5

Charakterystyczne cechy podłoży

mikrobiologicznych

- odpowiednia zawartość substancji odżywczych
- odpowiednie pH
- klarowność, jednorodność
- jałowość

Podział podłoży

1

.Ze względu na konsystencję:

- stałe (>1% agaru)

- półpłynne (0,5-1%)

- płynne- buliony

2

.Ze względu na zawartość substancji:

- syntetyczne

- półsyntetyczne

- naturalne

3

.Ze względu na ilość i jakość składników

odżywczych:

- proste dla drobnoustrojów o niskich
wymaganiach odżywczych

- złożone- wzbogacone dla drobnoustrojów
o wysokich wymaganiach odżywczych

4

.Ze względu na wzrost drobnoustrojów:

- wybiórczo-namnażające

- wybiórczo-różnicujące

- podłoża specjalne

- podłoża transportowe

- podłoża transportowo-namnażające

Identyfikacja drobnoustrojów na podstawie

charakterystycznego wzrostu na podłożach

1.Na podłożach płynnych wzrost związany jest ze sposobem
oddychania bakterii
- typ denny- osad na dnie probówki (beztlenowce-
Clostridium, Saccharomyces cerevisiae)
- typ dyfuzyjny- zmętnienie (Escherichia coli)
- typ powierzchniowy- błonka, nalot, kożuszek (tlenowce)
- typ mieszany- błonka i zmętnienie (mikroaerofile)
- obecność lub brak gazu (rurka Durchama lub bezpośrednie

gazowanie podłoża)

Identyfikacja drobnoustrojów na podstawie

charakterystycznego wzrostu na podłożach

2.Na podłożach stałych (agarowych)- morfologia kolonii

Kształt -okrągły, owalny, promienisty, rozgałęziony, soczewkowata, nitkowata,
koncentryczna

Wielkość- średnica kolonii w mm

Powierzchnia- gładka, pomarszczona, gruboziarnista, matowa, z połyskiem

Typ wzrostu kolonii- powierzchniowy, podpowierzchniowy, wgłębny

Wyniosłość ponad powierzchnię- płaska, stożkowata, lekko wypukła

Kolor kolonii i podłoża

Przejrzystość kolonii i podłoża- nieprzejrzyste, mętne, przejrzyste

Zapach

Struktura i konsystencja kolonii (za pomocą ezy)- mazista, ciągnąca się,
skórzasta, ziarnista, krucha, sucha, śluzowata

Fluorescencja- tak/nie

Typ hemolizy- tak (jaka)/nie

Metody niehodowlane

Szybkie testy diagnostyczne pozwalające sugerować lub ustalić

czynnik etiologiczny w bardzo krótkim czasie (30 min- kilku godzin,
np. preparat Grama, test lateksowy, PCR- kilka godzin).

Wyróżniamy:

1. Bezpośredni preparat mikroskopowy z badanego materiału.

2. Preparat mikroskopowy barwiony

3. Odczyny immunologiczne

4. Metody biologii molekularnej

5. Typowanie bakteriofagami

6. Testy lateksowe

Preparat mikroskopowy

Barwienie bakterii pozwala na obserwację
drobnoustrojów w mikroskopie świetlnym celem
oceny ich wielkości, kształtu, i niektórych cech
morfologicznych.
Preparaty przyżyciowe służą do obserwacji
ruchliwości,żywotności,sposobu rozmnażania
drobnoustrojów.Małe rozmiary bakterii
pozwalają jedynie na obserwację ich sposobu
poruszania się w takim preparacie.

Preparat mikroskopowy

Ze względu na to,co podlega
barwieniu,wyróżniamy:

●

Barwienie negatywne-polegające na barwieniu
tła, a bakterie pozostają niezabarwione np.
czerwienią kongo, tuszem chińskim

●

Barwienie pozytywne-polegające na barwieniu
bakterii, z których przygotowany jest preparat
np. błękitem metylenowym,fuksyną,zielenią
malachitową

Preparat mikroskopowy

Ze względu na ilość barwników zastosowanych
przy barwieniu,wyróżnia się:

●

Barwienie pozytywne proste z zastosowaniem
tylko jednego barwnika np. błękitu
metylenowego Loefflera

●

Barwienie pozytywne złożone z
wykorzystaniem kilku barwników np.barwienie
matodą Gramma lub metodą Neissera

Odczyny immunologiczne

Reakcje te oparte są na zdolności łączenia się
przeciwciał ze specyficznym antygenem w
odpowiednim środowisku reakcji.
Wyróżniamy następujące odczyny:

●

Odczyn precypitacji

●

Aglutynacja lateksowa

●

Aglutynacja szkiełkowa

●

Metody immunofluorescencyjne

●

Metody immunoenzymatyszne

Odczyny immunologiczne

Odczyn precypitacji- rozpuszczalne antygeny
polipeptydowe lub wielocukrowe uzyskane z tkanek
lub drobnoustrojów na drodze ekstrakcji kwasami,
enzymatycznie lub w podwyższonej temperaturze. Do
ich identyfikacji stosuje się swoiste znane przeciwciała
w obecności elektrolitów. Powstałe kompleksy
antygen-przeciwciało wypadają z roztworu w postaci
osadu (kłaczków).
Zastosowanie - oznaczanie grup serologicznych
paciorkowców hemolizujących

Odczyny immunologiczne

Aglutynacja lateksowa – mikrocząsteczki
lateksu opłaszcza się znanymi przeciwciałami,
które wiążą się ze specyficznymi antygenami, w
efekcie powstają, widoczne gołym okiem,
aglutynaty. Metody te nie wymagają użycia
czystych szczepów bakteryjnych.
Zastosowanie – identyfikacja dwoinek
zapalenia płuc.

Odczyny immunologiczne

Aglutynacja szkiełkowa- identyfikacja
nieznanych szczepów drobnoustrojów przy
zastosowaniu znanych swoistych surowic
odpornościowych .
Zastosowanie- w diagnostyce bakterii z
rodzaju: Salmonella, Schigella, Escherichia
coli, Pseudomonas, Neiseria.

Odczyny immunologiczne

Metoda immunofluorascencji
bezpośredniej

Na utrwalone próbki nakrapia się wzorcowe
przeciwciała wyznakowane fluorochromem. Po
inkubacji preparat umieszcza się w mikroskopie
fluorescencyjnym. Jeśli w badanym materiale
znajdowały się specyficzne dla wyznakowanych
przeciwciał drobnoustroje, w polu widzenia
mikroskopu uwidacznia się świecący kompleks.

Odczyny immunologiczne

Metody immunoenzymatyczne (test Elisa)

W reakcji tej badane antygeny reagują z
przeciwciałami, które związane są z enzymem.
W celu uwidocznienia kompleksu antygen-
przeciwciało dodaje się odpowiedni substrat i
po inkubacji odczytuje się wynik reakcji barwnej
jakościowo lub ilościowo. Nasilenie barwy
zależy od ilości kompleksu antygen-
przeciwciało.

Metody biologi molekularnej

Metoda ta polega na poszukiwaniu kwasów
nukleinowych w materiale klinicznym lub
hodowli. Podstawową techniką wykorzystywaną
w tych badaniach jest PCR.
PCR – łańcuchowa reakcja polimerazy
Jest to reakcja selektywnego powielania
wybranego fragmentu DNA w warunkach in
vitro. Metoda ta pozwala wykryć znikome ilości
DNA w badanej próbce.

Typowanie bakteriofagami

(wirusy bakteryjne)

Metoda ta służy identyfikacji określonych
gatunków wyhodowanych bakterii oraz pozwala
na określenie ich typów fagowych.
Oznaczanie typów fagowych wykorzystywane
jest w dochodzeniu epidemiologicznym, w celu
ustalenia źródła zakażenia np. typowanie
bakteriofagowe szczepów Salmonella typhi.

Określenie lekowrożliwości

Antybiogram metodą dyfuzyjno-krążkową lub
seryjnych rozcieńczeń.

Metody te pozwalają na dobór chemoterapeutyku o największym
zakresie działania i największej skuteczności przeciwko
wyizolowanemu drobnoustrojowi.
Dostępne są komercyjne metody oznaczania lekooporności bakterii
wg. Systemu ATB
- ATB -G dla rodziny Enterobacteriaceae
- ATB-STAPH5 dla gronkowców
- ATB-ANA dla bakterii beztlenowych