Metody wykrywania

mechanizmów oporności

bakterii na antybiotyki

Aleksander Deptuła
Katedra i Zakład Mikrobiologii
Collegium Medicum im. L. Rydygiera w
Bydgoszczy

Antybiotykoterapia - definicje

•

Antybiotykoterapia empiryczna

• Podstawą wyboru leku jest znajomość jego

aktywności przeciwbakteryjnej,
farmakokinetyki, farmakodynamiki i
aktualnej sytuacji epidemiologicznej i
wrażliwości przypuszczalnych czynników
etiologicznych zakażenia.

•

Antybiotykoterapia racjonalna

• Podstawą wyboru leku jest suma wiedzy

bakteriologicznej i klinicznej.

Antybiotykoterapia - definicje

•

Antybiotykoterapia celowana

• Podstawą wyboru leku jest wynik testów

lekowrażliwości szczepu uznanego za
czynnik etiologiczny zakażenia

Wykrycie oporności na wybrane

antybiotyki a ich wprowadzenie do

lecznictwa

Antybiotyk

Wprowadzeni
e

Szczepy oporne

Penicylina

1943

1940

Streptomicyna

1947

1947

Tetracyklina

1952

1956

Gentamicyna

1967

1970

Cefotaksym

1981

1981

Linkomicyna

2000

1999

Wykrycie mechanizmów

oporności

Mechaniz
m

oporności

Rok izolacji szczepów
(+)

MRSA

1961

SPPR

1967

ESBL

1983

VRE

1986

MBL

1988

VISA

1996

VRSA

2002

Ważne skróty

•

MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus)

Staphylococcus aureus oporny na meticylinę

• HA-MRSA – hospital acquired MRSA – szczepy MRSA nabyte w

szpitalu,

• CA-MRSA – community acquired MRSA) pozaszpitalne szczepy

MRSA

•

MSSA

(Methicillin Sensitive Staphylococcus aureus)

Staphylococcus aureus wrażliwy na meticylinę

•

MRCNS (Methicillin Resistant Coagulase-Negative

Staphylococci) Gronkowce koagulazo-ujemne oporne

na meticylinę

•

MSCNS (Methicillin Sensitive Coagulase-Negative

Staphylococci) Gronkowce koagulazo-ujemne wrażliwe

na meticylinę

Ważne skróty

•

VRE (Vancomycin Resistant Enterococci) Enterococcus oporne

na wankomycynę

•

VISA (Vancomycin Intermediate Staphylococcus aureus)

Staphylococcus aureus średniowrażliwy na wankomycynę

•

GISA (Glycopeptide Intermediate Staphylococcus aureus)

szczepy S. aureus średniowrażliwe na glikopeptydy

• hGISA – szczepy o heterogennej ekspresji oporności

•

VRSA (Vancomycin Resistant Staphylococcus aureus)

Staphylococcus aureus oporny na wankomycynę

•

HLAR (High Level Aminoglycosides Resitance) Oporność na

aminoglikozydy wysokiego stopnia

Ważne skróty

•

SPPR (Streptococcus pneumoniae

Penicillin Resistant) Streptococcus

pneumoniae oporny na penicylinę

•

ESBL (Extended Spectrum Beta-

Lactamases) Beta-laktamazy o

rozszerzonym spektrum substratowym

•

MBL (Metalo-Beta-Lactamases) Metalo

beta- laktamazy

•

KPC (Klebsiella pneumoniae

carbapenemases)

Podział mechanizmów

oporności

•

Ze względu na zasadę działania

• Zmiana miejsca docelowego
• Zaburzenia przepuszczalności ściany

komórkowej - influx

• Aktywne wypompowywanie - efflux
• Inaktywacja cząsteczki leku
• Wytworzenie alternatywnych szlaków

metabolicznych

Podział mechanizmów

oporności

•

Ze względu na pochodzenie

• Oporność naturalna
• Oporność nabyta

•

Ze względu na ekspresję

• Indukcyjna
• Konstytutywna

•

Ze względu na miejsce kodowania

• Chromosomalna
• Plazmidowa

Mechanizmy oporności na

główne grupy antybiotyków

Oporność na antybiotyki beta-

laktamowe

•

Synteza enzymu – beta-laktamazy

• Najczęstszy mechanizm oporności wśród

bakterii Gram – ujemnych i gronkowców

• powodują rozerwanie pierścienia -

laktamowego, co powoduje utratę
aktywności antybiotyku

beta-laktamazy - podział

•

Penicylinazy

• plazmidowe (Staphylococcus aureus)
• chromosomalne (Moraxella spp)

•

Cefalosporynazy chromosomalne

• indukcyjne (AmpC) lub konstytutywne

(Pseudomonas spp, Enterobacter spp)

•

Beta-laktamazy o szerokim spektrum

• Klasyczne – plazmidowe (Haemophilus spp)
• ESBL (Escherichia coli, Klebsiella spp)

• Metalo-beta-laktamazy (Stenotrophomonas

maltophilia – naturalna, Pseudomonas
aeruginosa – nabyta)

•

Są enzymami zależnymi od jonów cynku, w
swoim spektrum zawierają karbapenemy, nie są
inaktywowane przez inhibitory -laktamaz

• KPC (K. pneumoniae i inne pałeczki z

rodziny Enterobacteriaceae)

•

Enzymy wrażliwe na działanie kwasu
fenyloboronowego

•

Modyfikacja lub synteza nowego punktu
uchwytu (PBP)

• Streptococcus pneumoniae (SPPR)

•

Mutacja punktowa, lub nabycie nowego genu
pbp kodujących białko PBP

•

Ten typ oporności dotyczy około 21% szczepów
izolowanych w Polsce

•

Skutkuje opornością na WIĘKSZOŚĆ
ANTYBIOTYKÓW - LAKTAMOWYCH

• Staphylococcus spp. (MRSA, MRCNS)

•

Mutacja punktowa, lub nabycie nowego genu
mec A kodujących białko PBP, skutkuje to
syntezą nowego białka PBP (PBP-2` lub PBP 2a)

•

Skutkuje opornością na WSZYSTKIE
ANTYBIOTYKI - LAKTAMOWE

•

Zmiana przepuszczalności błony
komórkowej

Oporność na antybiotyki

aminoglikozydowe

•

Synteza enzymów modyfikujących cząsteczkę
leku

• Zdolność syntezy tych enzymów jest najczęściej

determinowana informacją zakodowaną w genomie
plazmidu, transpozonu lub chromosomie

• Klasy enzymów:

•

Nukleotydotransferazy (adenylacja grup hydroksylowych)

•

Fosfotransferazy (fosforylacja grup hydroksylowych)

•

Acetylotransferazy (acetylacja grup aminowych)

•

Zaburzenia transportu leku do miejsca
docelowego

•

Modyfikacja punktu uchwytu

Oporność na tetracykliny

•

Geny oporności są przeważnie
zlokalizowane na plazmidach lub
transpozonach

• Zaburzenia transportu leku do miejsca

docelowego

• Aktywne usuwanie leku z komórki
• Enzymatyczna inaktywacja leku

Oporność MLS

•

Oporność krzyżowa na makrolidy, linkosamidy i
streptograminy

•

Te trzy grupy antybiotyków posiadają różną strukturę
chemiczną, ale mechanizm oporności jest jednakowy
w przypadku wszystkich

•

Ekspresja MLS

B

może być konstytutywna i indukcyjna

(indukowana przez makrolidy C14 –erytromicyna,
klarytromicyna i C15- azytromicyna)

•

Fenotyp MLS

B

oznacza oporność na: makrolidy,

linkosamidy i streptograminę B przy zachowaniu
wrażliwości na streptograminę A.

•

Modyfikacja punktu uchwytu: białko
S23 rRNA (wspólne dla grupy MLS)

•

Enzymatyczna modyfikacja
antybiotyku

•

Aktywne usuwanie leku z komórki
(efflux): przeważnie izolowana
oporność na jeden z antybiotyków z
grupy MLS

Oporność na chinolony i

fluorochinolony

•

Mutacja w genie kodującym gyrazę

• Głównie dotyczy Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus aureus, Serratia marcescens,

Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis

i Salmonella spp.

• Mutacja ma charakter wielostopniowy, w

związku z czym, szczepy nabywają oporność

w coraz większym stopniu

•

Aktywne usuwanie leku z komórki

• Głównie pałeczki Gram-ujemne i

Mycobacterium tuberculosis

Oporność na glikopeptydy

•

Modyfikacja punktu uchwytu

• Wiąże się z nabyciem genu van A, van B,

van C, van D lub van E, które są
odpowiedzialne za zmianę składu
aminokwasowego łańcuchów białkowych
peptydoglikanu

• Dochodzi do zamiany końcowej D-Alaniny na

D-mleczan

• Wiąże się to z utratą powinowactwa

glikopeptydów do łańcuchów białkowych
peptydoglikanu

•

Znaczna nadprodukcja D-Alaniny

• Nadprodukcja jest tak duża, że wszystkie

dostępne cząsteczki leku wiążą się z wolną
D-Alaniną, a wiązania krzyżowe łańcuchów
bocznych mogą powstawać prawie bez
przeszkód

• Dowiedziono, że szczepy VISA mają

kilkakrotnie grubszą ścianę komórkową od
innych szczepów Staphylococcus aureus,
przez „impregnację” kompleksami
glikopeptyd-D-Ala

Oporność na kotrimoksazol

•

Spadek powinowactwa reduktazy
dihydrofolianowej do trimetoprimu i
syntazy dihydropterynianowej (DHPS)
do sulfometoksazolu

•

Nadprodukcja DHPS

•

Obniżona przepuszczalność osłon
komórkowych dla leków

Wykrywanie mechanizmów

oporności

Meticylinooporność u

Staphylococcus spp.

•

Stosuje się krążki z cefoksytyną (30g),

ponieważ jest mniej podatna na
degradację przez penicylinazy
gronkowcowe

•

Inne metody:

• Metoda przeglądowa z oksacyliną w

podłożu (nie zalecana dla CNS)

• Testy oparte o wykrywanie białka PBP2`

(2a) – MRSA –Screen, Slidex MRSA, Oxoid
PBP2`

• Wykrycie genu mecA techniką PCR

(metoda referencyjna)

Średnia wrażliwość na

wankomycynę u Staphylococcus

aureus

•

Stosuje się Etest

Oporność wysokiego stopnia na

aminoglikozydy (HLAR) u Enterococcus

spp.

•

Stosuje się metodę przeglądową
(BHIA+ 500g/ml gentamicyny i

BHIA+2000g/ml streptomicyny)

•

Wzrost po 24h – HLAR

Wykrywanie ESBL

•

Test dwóch krążków: cefalosporyna III
generacji lub aztreonam, w odległości 20-
25 mm układa się krążek z antybiotykiem
zawierającym kwas klawulanowy

•

Poszerzenie strefy zahamowania wzrostu
od strony krążka z kwasem
klawulanowym interpretuje się jako wynik
dodatni, co oznacza, że badany szczep
wytwarza ESBLs

Wykrywanie ESBL

Wykrywanie ESBL

Ekspresja beta-laktamaz typu AmpC w

obecności induktora u szczepu C. freundii

•

Widoczne zmniejszenie strefy zahamowania wzrostu dla

cefotaksymu (CTX) i ceftazydymu (CAZ) od strony

induktora – imipenemu (IMI)

•

Porównanie wielkości średnic stref

zahamowania wzrostu:

• Ceftazidim i Ceftazidim z kwasem

klawulanowym

• Cefotaksym i Cefotaksym z kwasem

klawulanowym

•

Jeżeli różnica w wielkości stref

zahamowania wzrostu (cefalosporyna z

inhibitorem – cefalosporyna) jest większa

lub równa 5 mm, wynik uznaje się za

dodatni

Interpretacja kliniczna

•

szczepy wytwarzajace ESBL należy
traktować jako szczepy oporne na
wszystkie penicyliny (bez połączeń z
inhibitorami), cefalosporyny (z wyjątkiem
cefamycyn) i aztreonam

•

W przypadku szczepów ESBL (+)
izolowanych z ciężkich zakażeń należy je
traktować jako oporne również na
połączenia beta-laktamów z inhibitorami
beta-laktamaz

Wykrywanie MBL

•

Test dwóch krążków – jałowy krążek bibułowy + 10 µl
0,5 M EDTA i krążek z imipenemem

•

Test dwóch krążków – jałowy krążek bibułowy + 4 µl
kwasu 2-merkaptopropionowego

•

Porównanie średnic stref zahamowania wzrostu –
krążek z imipenemem oraz krążek z imipenemem i
10 µl 0,5 M EDTA

•

Etest MBL

Wykrywanie MBL – poszerzenie strefy

zahamowania wzrostu

•

imipenem, EDTA + kwas merkaptooctowy

•

ceftazydym, kwas merkaptopropionowy

Wykrywanie MBL – porównanie stref

zahamowania wzrostu

•

imipenem, imipenem +EDTA

Interpretacja: różnica IPI – IPM ≥7 – wynik dodatni

Wysoka czułość i doskonała swoistość w przypadku szczepów P.
aeruginosa

Wykrywanie MBL – Etest

•

imipenem, imipenem +EDTA

Interpretacja: ośmiokrotny spadek wartości MIC imipenemu w obecności
EDTA
lub pojawienie się strefy fantomowej– wynik dodatni
Czułość i swoistość> 90%

MBL – interpretacja kliniczna

•

Szczepy MBL (+) należy traktować jako
klinicznie oporne na WSZYSTKIE
ANTYBIOTYKI BETA-LAKTAMOWE z
wyjątkiem aztreonamu

KPC - wykrywanie

•

Test przesiewowy – brak wrażliwości na
ertapenem i/lub meropenem

•

Test potwierdzenia: porównanie średnic
stref zahamowania wzrostu wokół krążków
z imipenemem lub meropenemem oraz
krążków z imipenemem lub meropenemem
na które dodano 20 μl roztworu kwasu
fenyloboronowego (15 mg/ml)

•