Oznaczanie lekowrażliwości bakterii na antybiotyki.

W ostatnich latach lekooporne bakterie były przyczyną kilku poważnych epidemii zakażeń o dużej śmiertelności. Doprowadziło to do potrzeby wprowadzenia krajowych i międzynarodowych programów kontroli monitorujących antybiotykooporność bakterii na podstawie oceny lekowrażliwości z zastosowaniem wiarygodnych metod, które pozwoliłyby uzyskać porównywalne dane.

Kliniczna definicja terminów „oporny” i „wrażliwy”

Wynik badania wrażliwości w formie przedstawionej lekarzowi kwalifikuje mikroorganizm do jednej z dwóch lub więcej kategorii wrażliwości.

• Wrażliwy. Mikroorganizm określamy jako „wrażliwy” na antybiotyk, jeśli odpowiedź kliniczna na leczenie danym antybiotykiem, stosowanym w zalecanych dawkach, jest prawdopodobna.

• Średnio wrażliwy dotyczy dwóch sytuacji. Określa szczepy o „umiarkowanej wrażliwości” na antybiotyk, który może być zastosowany w leczeniu w większej dawce z powodu niskiej toksyczności lub koncentracji w ognisku zakażenia (np. mocz). Klasyfikacja odnosi się również do szczepów wskazujących „średnią wrażliwość” na bardziej toksyczne antybiotyki, które mogą być zastosowane w wyższych dawkach. W tej sytuacji pośrednia kategoria stanowi strefę buforową miedzy wrażliwością i opornością.

Podobnie jak większość klinicystów nie jest świadoma, mimo klinicznego znaczenia, subtelnej różnicy między średnią i umiarkowaną wrażliwością, wiele laboratoriów w obydwu sytuacjach używa określenia „średnia”.

• Oporny. Ten termin wskazuje, że niezależnie od zastosowanej dawki i lokalizacji infekcji, oczekiwany jest brak odpowiedzi klinicznej na dany antybiotyk.

W pewnych sytuacjach, na przykład w badaniu odpowiedzi gronkowców na benzylopenicylinę, istnieją tylko kategorie „wrażliwy” i „oporny” (odpowiadające zdolności do wytwarzania ß-laktamaz).

Wskazania do rutynowego oznaczania lekowrażliwości.

Antybiogram w laboratorium klinicznym może zostać wykonany w dwóch celach:

• aby ukierunkować lekarza w wyborze najlepszego leku przeciwbakteryjnego indywidualnie dla pacjenta;

• aby gromadzić informacje epidemiologiczne o oporności mikroorganizmów o istotnym znaczeniu dla zdrowia publicznego.

Antybiogram jako wskazówka do leczenia.

Antybiogramy nigdy nie powinny być wykonywane dla zanieczyszczających próbkę lub komensalnych mikroorganizmów, należących do flory fizjologicznej, oraz innych, nie mających związku z procesem zakażenia. Antybiogramy powinny być wykonywane tylko z czystych hodowli mikroorganizmów prawdopodobnie wywołujących zakażenie.

Zmodyfikowana metoda dyfuzyjno - krążkowa (Kirby - Bauera).

Odczynniki

1. Agar Mueller - Hintona - przygotować zgodnie z zaleceniem producenta. Rozlać podłoże na płytki Petriego do poziomu około 4 mm. Płytka o średnicy 9 cm zawiera około 25 ml podłoża.

2. Krążki z antybiotykami - można używać wszystkich dostępnych komercyjnie krążków o właściwej średnicy i stężeniu leku. Zapasy krążków należy przechowywać w -20⁰C. Mały podręczny zestaw krążków można przechowywać w lodówce do miesiąca. Po wyjęciu z chłodziarki pojemnik należy pozostawić w temperaturze pokojowej na około 1 godziny - do wyrównania temperatur.

3. Wzorzec zmętnianie - przygotować wzorzec zmętnienia wlewając 0,6 ml 1% (10 g / l) roztworu dwuwodzianu chlorku baru do 100-mililitrowego kalibrowanego cylindra i wypełnić do 100 ml 1% (10 ml / l) kwasem siarkowym. Roztwór wzorcowego zmętnienia należy umieścić w identycznej probówce, jak probówki z bulionem. Wzorzec może być przechowywany w ciemności, w temperaturze pokojowej przez 6 miesięcy, pod warunkiem, że jest zamknięty w sposób uniemożliwiający parowanie.

4. Wymazówki - przygotowuje się zapas bawełnianych wymazówek na drewnianych patyczkach. Wymazówki sterylizuje się w autoklawie lub w sterylizatorach na suche gorące powietrze, umieszczając je w puszkach, probówkach lub opakowane w papier.

5. Procedura - aby przygotować inoculum z hodowli na podłożu stałym, należy zebrać ezą 3 - 5 kolonii badanego mikroorganizmu o tym samym wyglądzie. Przenieść do probówki z fizjologicznym roztworem soli. Jeśli inoculum przygotowywane jest z czystej hodowli, należy w ten sam sposób w roztworze fizjologicznym soli zawiesić ezą materiał pobrany ze zlewnego wzrostu. Porównać probówkę ze wzorcem zmętnienia i dostosować gęstość badanej zawiesiny do wzorca, dodając więcej bakterii lub więcej fizjologicznego roztworu soli. Właściwa gęstość inoculum jest konieczna do uzyskania zlewnej lub prawie zlewnej murawy wzrostu. Badany szczep posiać na płytki, zanurzając sterylną wymazówkę w inoculum. Usunąć nadmiar zawiesiny, obracając i przyciskając wymazówkę mocno do ścianki probówki powyżej poziomu płynu. Zawiesinę rozprowadzić dokładnie na całej powierzchni podłoża. Na koniec przesunąć wymazówkę wzdłuż brzegów powierzchni agaru. Pozostawić na kilka minut do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, z zamkniętym wieczkiem. Krążki z antybiotykami można umieścić na posianej płytce za pomocą sterylnej pęsety. Zastosowanie szablonu ułatwia równomierne rozmieszczenia krążków. Do umieszczenia krążków z antybiotykami na posianej płytce można również użyć sterylnej igły z zatyczką. Maksymalnie na płytce o średnicy 9 - 10 cm można umieścić siedem krążków. Sześć krążków można rozmieścić równomiernie w jednakowej odległości, około 15 mm od brzegu płytki, a jeden krążek nałożyć w centrum płytki. Odległość między krążkami nie może być mniejsza niż 2 cm. Każdy krążek należy delikatnie przycisnąć, zapewniając równomierny kontakt z podłożem. Płytki powinny być preinkubowane przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie po odwróceniu do góry dnem inkubować w cieplarce w 35⁰C. Temperatura powyżej 35⁰C zaburza wyniki wrażliwości na oksacylinę / metycylinę. Nie inkubować w atmosferze dwutlenku węgla. Po całonocnej inkubacji należy zmierzyć średnicę każdej strefy (wliczając średnicę krążka) i zanotować odczyt (w mm). Interpretować wyniki zgodnie z wartościami przedstawionymi w tabeli. Pomiar stref może być wykonany za pomocą linijki przyłożonej do dna płytki, bez jej otwierania. Wyniki badania lekowrażliwości można odczytać posługując się szablonem. Granicę strefy zahamowania ustala się gołym okiem w miejscu, gdzie rozpoczyna się widoczny wzrost.

Metoda seryjnych rozcieńczeń antybiotyku w podłożu Muellera - Hintona.

Sporządza się szereg dwukrotnych rozcieńczeń badanego antybiotyku w bulionie Muellera - Hintona w następujący sposób:

1. Jałowe probówki z korkami (co najmniej 14 w statywie) napełnia się 2 ml bulionu, a następnie do pierwszej probówki dodaje się 2 ml roztworu zawierającego antybiotyk w określonym stężeniu, np. 1 mg / ml - zależnie od skali wrażliwości.

2. Po wymieszaniu przenosi się pipetą 2 ml z pierwszej probówki do drugiej. Dalsze rozcieńczenia - aż do ostatniej wykonuje się w analogiczny sposób, przy czym z ostatniej probówki należy odrzucić 2 ml.

3. Następnie wcześniej przygotowaną 24-godzinną hodowlę badanego szczepu na podłożu stałym w postaci skosu spłukuje się za pomocą 2 ml jałowego roztworu PBS -u w celu otrzymania zawiesiny, którą następnie rozcieńcza się tak, aby uzyskać odpowiednią gęstość wyjściową.

4. Do poszczególnych rozcieńczeń z szeregu dodaje się taką ilość zawiesiny, aby w każdej probówce uzyskać odpowiednią gęstość bakterii (kolejno do rozcieńczeń dodajemy 200 μl zawiesiny).

5. Po 16 - 20 godzinnej inkubacji w temperaturze 35⁰C należy wizualnie określić, gdzie znajduje się probówka, w której nie stwierdza się zmętnienia podłoża i która równocześnie poprzedza probówkę, w której zmętnienie występuje.

6. Stężenie antybiotyku występujące w tej probówce określa się jako minimalne stężenie antybiotyku potrzebne do zahamowania wzrostu badanego szczepu bakteryjnego. Stężenie to określa się akronimem MIC (ang. minimal inhibitory concentration) i wyraża się w mg/l.

7. W zależności od wartości stężenia antybiotyku hamującego wzrost badanego szczepu określa się go jako wrażliwy, średniowrażliwy lub oporny na dany antybiotyk wg norm NCCLS M100-S8, styczeń 2000.

Niekiedy konieczne jest określenie wartości minimalnego stężenia bakteriobójczego - MBC (ang. minimal bactericidal concentration). W tym celu z probówek, w których oznaczono MIC, wysiewa się 0,1 ml bulionu na płytki z podłożem Muellera - Hintona, w następującej kolejności: z ostatniej probówki, w której obserwowano wzrost, oraz z 4 kolejnych probówek, w których wzrostu nie obserwowano. Za MBC uważa się takie stężenie badanego antybiotyku (wyrażone w mg/l), które redukuje liczbę kolonii badanego szczepu bakteryjnego na podłożu stałym Muellera - Hintona do ilości poniżej 50 kolonii, po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37⁰C.

- 3 - Oznaczanie lekowrażliwości bakterii na antybiotyki.

---