Nowiny Lekarskie 2007, 76, 4, 314-321

PAWEŁ SACHA, PIOTR JAKONIUK, PIOTR WIECZOREK, MARCIN ŻÓRAWSKI

MECHANIZMY OPORNOŚCI NA ANTYBIOTYKI β-LAKTAMOWE

IZOLATÓW ESCHERICHIA COLI, KLEBSIELLA PNEUMONIAE, PROTEUS MIRABILIS

I ENTEROBACTER CLOACAE OPORNYCH NA CEFOTAKSYM

MECHANISMS OF RESISTANCE TO β-LACTAM ANTIBIOTICS IN ESCHERICHIA COLI,

KLEBSIELLA PNEUMONIAE, PROTEUS MIRABILIS

AND ENTEROBACTER CLOACAE ISOLATES RESISTANT TO CEFOTAXIME

Zakład Diagnostyki Mikrobiologicznej

Akademia Medyczna w Białymstoku

Kierownik Zakładu: dr hab. med. Piotr Jakoniuk

Streszczenie

Wstęp. Wyniki badań naukowych na świecie wskazują na narastanie oporności na antybiotyki wśród pałeczek Enterobacteriaceae.

Cel. Ocena występowania mechanizmów oporności na antybiotyki β-laktamowe oraz wrażliwości na antybiotyki wśród szczepów P. mirabilis, E.

coli, K. pneumoniae i E. cloacae opornych na cefotaksym.

Materiały i metoda. Przebadano 303 szczepy pałeczek Enterobacteriaceae izolowane z różnych materiałów klinicznych. Do badania wrażliwości na

antybiotyki stosowano metodę dyfuzyjno-krążkową. Do oceny występujących mechanizmów oporności na antybiotyki β-laktamowe stosowano

metodę PCR i MDDT.

Wyniki. Wytwarzanie ESBL było najważniejszym mechanizmem warunkującym oporność na antybiotyki β-laktamowe. Zdolność wytwarzania

ESBL wykryto u 33,7% izolatów Enterobacteriaceae, głównie u E. cloacae (16,8%) i K. pneumoniae (11,9%). Mechanizm AmpC wykazano

u 9,9%, a inne mechanizmy oporności u 7,9% badanych izolatów Enterobacteriaceae. Częstość występowania mechanizmów oporności

w grupie szczepów opornych na cefotaksym wynosiła: ESBL – 60%, ESBL i AmpC – 15,5%, AmpC – 6,7% i 17,8% inne.

Wnioski. Najważniejszym mechanizmem oporności na antybiotyki β-laktamowe badanych pałeczek Enterobacteriaceae było wytwarzanie ESBL

i/lub AmpC enzymów. Nie wykazano obecności enzymów CTX-M wśród szczepów opornych na cefotaksym.
SŁOWA KLUCZOWE: mechanizmy oporności na antybiotyki β-laktamowe, Enterobacteriaceae, wrażliwość na antybiotyki.

Summary

Introduction. Worldwide scientific data show that there is an increasing level of resistance to antibiotics among Enterobacteriaceae rods.

Aim. The aim of this study was to evaluate susceptibility to antibiotics and detection of mechanisms of resistance to β-lactam antibiotics among

P. mirabilis, E. coli, K. pneumoniae, and E. cloacae strains resistant to cefotaxime.

Material and methods. We studied 303 strains of Enterobacteriaceae rods isolated from different clinical samples. Disk – diffusion method

was used to study susceptibility to antibiotics. MDDT and PCR methods were used to detect mechanisms of bacterial resistance to β-lactam

antibiotics.

Results. The major mechanism of resistance to β-lactam antibiotics was production of ESBL. ESBL were detected in 33.7% of Enterobacteriaceae

isolates, especially in E.cloacae (16.8%) and K.pneumoniae (11.9%). AmpC mechanism was detected in 9.9% isolates and other mechanisms in

7.9% isolates of Enterobacteriaceae. Occurrence of mechanisms resistance in cefotaxime-resistant group (R-CTX) respectively: ESBL – 60%,

ESBL and AmpC – 15.5%, AmpC – 6.7% and other 17.8%.

Conclusion. The most important mechanisms of resistance to β-lactam antibiotics in Enterobacteriaceae were production ESBL and/or AmpC

enzymes. Strains producing CTX-M enzymes among of cefotaxime-resistant strains were not found.
KEY WORDS: mechanisms resistance to β-lactam antibiotics, Enterobacteriaceae, susceptibility to antibiotics.

Wstęp

Wśród wielu antybiotyków stosowanych w leczeniu

zakażeń wywołanych przez pałeczki Enterobacteriaceae

nadal najważniejszą grupę stanowią antybiotyki β-lak-

tamowe. Szczególnie chętnie w praktyce klinicznej

korzysta się z cefalosporyn ze względu na ich znakomite

właściwości farmakokinetyczne, szerokie spektrum działania

przeciwbakteryjnego i niewielką toksyczność. Wszystkie te

cechy preferują stosowanie tych leków zarówno u dzieci, jak

i osób dorosłych do zwalczania zakażeń o różnej lokalizacji

[1, 2].

Nadużywanie cefalosporyn III generacji, takich jak

cefotaksym, czy ceftazydym często prowadzi do selekcji

szczepów opornych na większość antybiotyków β-lak-

tamowych (oprócz karbapenemów). Najliczniejszą

grupę z nabytą opornością na cefalosporyny stanowią

gramm-ujemne pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae.

Kolonizacja środowiska szpitalnego takimi szczepami

może stanowić istotny czynnik ryzyka, wpływający na

zwiększenie liczby zakażeń szpitalnych stwarzających

poważne trudności terapeutyczne [3, 4].

Należy pamiętać, że antybiotyki cefalosporynowe

stanowią jeden z czynników mutagennych prowadzący

do wytwarzania oporności przez bakterie na antybiotyki

315

Mechanizmy oporności na antybiotyki β-laktamowe izolatów Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae...

315

β

-laktamowe. Wśród wielu mechanizmów odpowiedzial-

nych za tego typu oporność u pałeczek Enterobacteriaceae,

na pierwszym miejscu wymienia się β-laktamazy o

rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL; ang.

extended-spectrum β-lactamases) [3]. Geny kodujące ich

wytwarzanie mogą być zlokalizowane na chromosomie lub

plazmidach. Możliwość transferu plazmidów wśród różnych

gatunków Enterobacteriaceae stwarza zagrożenia związane

z pojawianiem się szczepów wieloopornych [3–5].

Dynamicznie rozprzestrzeniającą się wśród pałeczek

Enterobacteriaceae grupą ESBL są cefotaksymazy (CTX-

M) [6, 7]. Dotychczas opisano ponad 60 różnych CTX-M [8]

występujących wśród wielu gatunków bakterii. Doniesienia

o ich występowaniu napływają z odległych regionów świata:

Azja [9], Ameryka Płd. i Płn. [10, 11], Afryka [12]. Również

w Europie odnotowuje się istotny wzrost zainteresowania tą

grupą ESBL [13–16].

W Polsce, pierwsze enzymy z tej grupy opisali w

1998 roku Gniadkowski i wsp. u Citrobacter freundii

(CTX-M-1/MEN-1) i Escherichia coli (CTX-M-3) [17].

Kilka lat później (w 2002 roku), ten sam zespół ba-

dawczy opisał obecność CTX-M-3 u innych gatunków

pałeczek Enterobacteriaceae (z rodzaju Klebsiella,

Enterobacter, Serratia, Morganella) izolowanych w 15

szpitalach z różnych regionów Polski [18].

Cel badań

– Ocena częstości występowania różnych mechanizmów

warunkujących oporność E. coli, P. mirabilis, E. cloacae i K.

pneumoniae na antybiotyki β-laktamowe.

– Porównanie aktywności różnych antybiotyków wobec

szczepów opornych na cefotaksym.

– Określenie udziału cefotaksymaz (CTX-M) w

oporności badanych gatunków pałeczek Enterobacteriaceae

na cefalosporyny.

Materiał i metody

Badania dotyczące występowania mechanizmów

oporności na antybiotyki β-laktamowe oraz ocenę

wrażliwości na antybiotyki przeprowadzono na 303

pałeczkach Enterobacteriaceae należących do 4 gatunków:

Escherichia coli (n = 72), Klebsiella pneumoniae (n = 75),

Proteus mirabilis (n = 69) i Enterobacter cloacae (n = 87).

Wszystkie szczepy wyizolowano z materiałów klinicznych

(wymazy z ran, cewniki, dreny itd.) w Zakładzie Diagnostyki

Mikrobiologicznej Akademii Medycznej w Białymstoku

w pierwszych dwóch miesiącach kolejnych lat 2004, 2005

i 2006. Badane gatunki dobierano do badań w podobnych

proporcjach ilościowych (20–29 szczepów/kolejny rok).

Identyfikację do gatunku (po izolacji z materiału

klinicznego) przeprowadzono z zastosowaniem karty GNI

i automatycznego systemu VITEK 1 (bioMérieux, Marcy

l’Etoile, France).

Szczepy po izolacji (z 2004 i 2005 roku) były

przechowywane na kriobankach w temperaturze –32

o

C.

Przed przystąpieniem do badań szczepy rewitalizowano

poprzez 3-krotny pasaż na agarze Columbia (bioMérieux,

Marcy l’Etoile, France) i poddawano ponownej

identyfikacji przy użyciu ID 32E i systemu ATB

(bioMérieux, Marcy l’Etoile, France).

Badanie wrażliwości na antybiotyki wykonano

metodą dyfuzyjno-krążkową na podłożu Muller-Hintona

agar (Oxoid, Basingstoke, UK) postępując zgodnie z za-

leceniami CLSI i Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds.

Lekowrażliwości Drobnoustrojów [19, 20].

Oceniano wrażliwość na następujące grupy leków:

cefalosporyny (cefotaksym, ceftazydym, cefepim, cefazolina,

cefuroksym), monobaktamy (aztreonam), karbapenemy

(imipenem, meropenem), penicyliny i ich połączenia z in-

hibitorami (ampicylina, amoksycylina z kwasem

klawulanowym, tikarcylina z kwasem klawulanowym,

piperacylina z tazobaktamem, ampicylina z sulbaktamem),

aminoglikozydy (gentamycyna, netilmycyna, amikacyna)

oraz ciprofloksacynę, tetracyklinę i trimetoprim z

sulfametoksazolem.

W celu kontroli poprawności wykonywanych badań

stosowano szczepy referencyjne Escherichia coli ATCC

25922 i Escherichia coli ATCC 35218.

Mechanizm oporności na antybiotyki β-laktamowe

określano na podstawie uzyskanych wyników w teście

MDDT (ang. Modified Double Disk Test) stosując

metodykę i kryteria opisane przez Pitout i wsp. [21].

Jako szczepy wzorcowe stosowano Klebsiella

pneumoniae ATCC 700603 (ESBL-dodatni) i Pseudomonas

aeruginosa ATCC 27853 (AmpC-dodatni).

Szczepy, u których stwierdzono oporność na cefotaksym

(R-CTX) i wykazano wytwarzanie β-laktamaz z grupy ESBL,

badano techniką PCR na obecność genów warunkujących

wytwarzanie CTX-M. Jako materiał wykorzystano

genomowy DNA, izolowany z 24-godzinnej hodowli (37

o

C)

bakterii na bulionie TSB (Emmapol, Gdańsk, Polska). Izolację

przeprowadzono posługując się zestawem GeneMatrix

(EURx, Gdańsk, Polska), postępując zgodnie z pro-

cedurą opisaną przez producenta.

Do reakcji PCR przygotowywano 25 µl mieszaniny,

zawierającej: 25 pmol każdego ze starterów, 1x bufor

reakcyjny, 2 mM MgCl

2

, 1µl dNTSs, 0,5U Delta 2 DNA

polimerazy (DNA-Gdańsk II, Gdańsk, Polska) i 2 µl ge-

nomowego DNA. Mieszaninę składników reakcji

uzupełniano do końcowej objętości wodą dejonizowaną.

Reakcję PCR przeprowadzono w termocyklerze

Cyclone 96 (PEQLAB Biotechnology, GmbH) w

następujących warunkach: 1) wstępna denaturacja w 94

o

C,

6 minut; 2) denaturacja w 94

o

C, 60 sekund; 3) przyłączanie

starterów w 50

o

C, 40 sekund; 4) wydłużanie nici DNA

w 72

o

C, 60 sekund; 5) końcowe wydłużanie w 72

o

C,

6 minut; 6) schłodzenie do 4

o

C. Etapy 2, 3, 4 powtarzano

cyklicznie 35 razy.

W badaniach zastosowano uniwersalne startery dla

rodziny enzymów CTX-M o sekwencji opisanej przez

316

Paweł Sacha i inni

316

Sundsfjord i wsp. [22].

Produkty reakcji PCR rozdzielano w czasie 60

minut (napięcie 5V/cm), w 1,6% żelu agarozowym (MP

Biomedicals, France) i barwiono bromkiem etydyny

(MP Biomedicals, France) w buforze TBE. Spodziewana

wielkość produktów dla genu bla

CTX-M

wynosiła 585 par

zasad (pz). Ich obecność oceniano w transiluminatorze UV

(UVP Ltd., UK), a wielkość uzyskanych produktów po

rozdziale elektroforetycznym porównywano z markerem

MW 100-1000 (DNA-Gdańsk II, Gdańsk, Polska).

Wyniki

Przeprowadzone badania oceniające oporność pałeczek

Enterobacteriaceae na różne antybiotyki przedstawiono w

tabeli 1.

Wykazały one występowanie oporności wobec

antybiotyków β-laktamowych u ponad połowy szczepów

K. pneumoniae (52–69,7%) i E. cloacae (65,5–72,4%).

Pałeczki E. coli i P. mirabilis były bardziej wrażliwe.

Obserwowano niższy odsetek szczepów opornych

na cefalosporyny, od 4,2% (cefoperazon) do 43,5%

(cefazolina). Najniższą aktywność wśród cefalosporyn III

generacji wykazywał cefotaksym (8,3–69,7% szczepów

opornych).

Za wyjątkiem tikarcyliny z kwasem klawulanowym

(TIM), pozostałe badane preparaty antybiotyków β-lak-

tamowych z inhibitorami β-laktamaz (AMC, SAM

i TZP), nie wykazywały zadowalającej aktywności

przeciwbakteryjnej.

Jedynymi antybiotykami β-laktamowymi, wobec

których nie występowała oporność wśród badanych

pałeczek Enterobacteriaceae były karbapenemy (imipenem,

meropenem) i cefepim.

W grupie antybiotyków aminoglikozydowych

najaktywniejszym preparatem była amikacyna (E. coli – 4,2%

i P. mirabilis – 4,3% szczepów opornych). Oporność na

pozostałe (gentamycynę i netylmycynę) wahała się w

zakresie od 8,3% do 68% szczepów i zależała od gatunku.

Zaobserwowano duże zróżnicowanie oporności na

tetracyklinę. Najmniej szczepów opornych wykazano

u pałeczek K. pneumoniae (8%), natomiast inne gatunki,

tj. E. coli, P. mirabilis i E. cloacae były w większości

oporne. Co do pozostałych badanych preparatów

(ciprofloksacyny i trimetoprimu z sulfametoksazolem), to

najmniej opornych szczepów wykazano u E. coli (16,7%

i 25%), a najwięcej (58,6% i 55,2%) u E. cloacae.

Na podstawie wyników powyższych badań, stosując

jako kryterium wrażliwość na cefotaksym, wyłoniono

2 grupy szczepów: R-CTX (oporne na cefotaksym) i S-

CTX (wrażliwe na cefotaksym). Grupę pierwszą (R-CTX)

stanowiło 135/303 szczepów (44,6%), a grupę drugą

(S-CTX) – 168/303 szczepów (55,4%). Wyniki analizy

wrażliwości na antybiotyki w obu grupach pałeczek

Enterobacteriaceae zestawiono w tabeli 2.

Dane te wskazują na znacznie wyższą oporność

pałeczek z grupy R-CTX wobec stosowanych w badaniach

antybiotyków, a szczególnie aminoglikozydów (wyjątek

szczepy E. coli), cefalosporyn (wyjątek wysoka aktywność

ceftazydymu wobec K. pneumoniae) i połączeń penicylin

z inhibitorami β-laktamaz.

Wyniki badań nad mechanizmami warunkującymi

oporność na antybiotyki β-laktamowe przedstawiono w

tabeli 3. Badaniami objęto szczepy oporne na cefotaksym

(R-CTX).

Z zastosowaniem testu MDDT stwierdzono

występowanie 2 mechanizmów oporności na β-laktamy,

takich jak wytwarzanie enzymów z grupy ESBL i/lub

AmpC. Zdolność tę wykazano u 75,6% (102/135) R-

CTX szczepów. Najliczniejszą grupę stanowiły pałeczki

wytwarzające tylko ESBL – 81/135 (60%). Większość

szczepów ESBL-dodatnich należała do gatunku E.

cloacae (36/81 – 44,4%) i K. pneumoniae (30/81 – 37%).

Jednoczesne występowanie zdolności wytwarzania ESBL

i AmpC zidentyfikowano u 15 szczepów E. cloacae i 6

szczepów K. pneumoniae. Z kolei zdolność wytwarzania

tylko AmpC wykazano u 9 szczepów z gatunku E. cloacae.

U 17,8% pałeczek Enterobacteriaceae występowały

mechanizmy oporności o innym charakterze aniżeli ESBL

czy AmpC.

Badania wykonane techniką PCR na 102 szczepach

Enterobacteriaceae (81 szczepów wytwarzających ESBL

oraz 21 szczepów, które oprócz zdolności wytwarzania ESBL

wytwarzały także AmpC), nie wykazały obecności genów bla

CTX-M

(cefotaksymaz) w żadnym z testowanych szczepów.

Dyskusja

Występowanie w środowisku szpitalnym szczepów

pałeczek Enterobacteriaceae opornych na antybiotyki

β

-laktamowe staje się dość powszechnym zjawiskiem.

Znaczną rolę w ekspansji oporności wśród różnych

gatunków odgrywają antybiotyki należące do cefalosporyn

III-generacji. Nadużywanie takich preparatów jak

cefotaksym „prowokuje” bakterie do wytwarzania

mechanizmów obronnych. Do najczęściej opisywanych

zalicza się obecnie zdolność wytwarzania ESBL [3–5].

Przeprowadzone przez nas badania na puli 303

szczepów Enterobacteriaceae izolowanych z różnych

materiałów klinicznych w latach 2004–2006 wykazały

występowanie dużej grupy szczepów opornych na

cefotaksym (135/303 – 44,6%). Większość wywodziła się

z gatunku K. pneumoniae i E. cloacae (≥ 69% szczepów).

Oporność na inne cefalosporyny u tych gatunków

występowała na zbliżonym poziomie (od 64% do 72,4%).

Ciekawym faktem był brak występowania szczepów

K. pneumoniae opornych na ceftazydym w grupie R-

CTX (jedynie 6,3% szczepów średnio wrażliwych).

Tego typu szczepy (ESBL-dodatnie) wrażliwe „in vitro”

na ceftazydym (MIC; 2 mg/L) opisywane są również

w literaturze [13].

Aktywność poszczególnych antybiotyków w grupie

317

Mechanizmy oporności na antybiotyki β-laktamowe izolatów Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae...

317

Tab. 1. Oporność na antybiotyki pa

łeczek

Enterobacteriaceae

(N = 303)

Table 1.

Resistance to antibiotics of

Enterobacteriaceae

rods (N = 303)

Gatunek (liczba szczep

ów)

Szczepy oporne (%)

CTX

CAZ

CFP

FEP

CZ

CXM

ATM

IPM

MEM

AM

AMC

TIM

TZP

SAM

GM

NET

AN

CIP

TE

SXT

Escherichia coli (72)

8,3

8,3

4,2

-

33,3

25,0

-

-

-

83,3

58,3

-

8,3

58,3

16,7

8,3

4,2

16,7

75,0

25,0

Klebsiella pneumoniae (75)

69,7

-

52,0

-

64,0

64,0

36,0

-

-

NB

64,0

-

52,0

68,0

64,0

64,0

64,0

28,0

8,0

64,0

Proteus mirabilis (69)

26,1

21,7

17,4

-

43,5

34,8

-

-

-

52,2

30,4

26,1

17,4

39,1

30,4

26,1

4,3

21,7

91,3

60,9

Enterobacter cloacae (87)

69,0

65,5

69,0

-

NB

72,4

69,0

-

-

NB

NB

69,0

69,0

NB

51,7

34,5

48,3

58,6

62,1

55,2

Objaśnienia:

NB, nie badano (naturalna oporno

ść)

CTX,

cefotaksym;

CAZ,

ceftazydym;

CFP

, cefoperazon,

FEP

, cefepim;

CZ,

cefazolina;

CXM,

cefuroksym;

ATM,

aztreonam;

IPM,

imipenem;

MEM,

meropenem;

AM,

ampicylina;

AMC,

amoksycylina

z

kwasem

klawulanowym;

TIM,

tikarcylina

z

kwasem

klawulanowym;

TZP

, piperacylina

z

tazobaktamem;

SAM,

ampicylina

z

sulbaktamem;

GM,

gentamycyna;

NET

, netylmycyna;

AN,

amikacyna;

CIP

,

ciprofloksacyna;

TE, tetracyklina;

SXT

, trimetoprim z sulfametoksazolem

318

Paweł Sacha i inni

318

Tab. 2. Porównanie aktywności antybiotyk

ów wobec pałeczek

Enterobacteriaceae

wrażliwych (S-CTX) i opornych (R-CTX) na cefotaksym

Table 2. Comparison of antibiotics activity between groups

Enterobacteriacea

rods, susceptible (S-CTX) and resistant (R-CTX) to cefotaxime

Oporność

na

ce

fo

ta

ks

ym

Odsetek szczep

ów wrażliwych (%)

Gatunek

(liczba szczep

ów)

CAZ

CFP

FEP

CZ

CXM

ATM

IPM

MEM

AM

AMC

TIM

TZP

SAM

GM

NET

AN

CIP

TE

SXT

E. coli (6)

(R-CTX)

-

-

100

-

-

-

100

100

-

-

-

-

-

100

100

100

100

-

-

K. pneumoniae (48)

93,7

6,2

100

-

-

-

100

100

NB

6,2

-

12,5

12,5

-

-

-

68,7

75,1

-

P. mirabilis (18)

16,7

-

100

-

-

100

100

100

-

-

16,7

33,3

-

-

-

83,3

33,3

-

-

E. cloacae (63)

-

-

100

NB

-

-

100

100

NB

NB

-

-

NB

30,0

30,0

35,0

25,0

10,0

25,0

E. coli (66)

(S-CTX)

100

81,8

100

45,4

81,8

80,9

100

100

18,2

45,5

-

54,5

54,5

81,8

80,9

80,9

63,3

27,3

63,6

K. pneumoniae (27)

100

100

100

100

100

100

100

100

NB

44,4

100

100

77,8

100

100

100

77,8

55,6

88,9

P. mirabilis (51)

100

100

100

64,7

88,2

100

100

100

64,7

94,1

88,2

94,1

82,4

94,1

100

100

94,1

17,6

52,9

E. cloacae (24)

100

77,8

100

NB

55,6

100

100

100

NB

NB

88,9

88,9

NB

88,9

88,9

77,8

77,8

-

88,9

NB

Objaśnienia:

(R – CTX), izolaty oporne na cefotaksym; (

S – CTX), izolaty wra

żliwe na cefotaksym;

NB, nie badano (naturalna oporno

ść)

CTX, cefotaksym;

CAZ, ceftazydym;

CFP

, cefoperazon,

FEP

, cefepim;

CZ, cefazolina;

CXM, cefuroksym;

ATM, aztreonam;

IPM, imipenem;

MEM, meropenem;

AM, ampicylina;

AMC, amoksycylina

z kwasem klawulanowym;

TIM, tikarcylina z kwasem klawulanowym;

TZP

, piperacylina z tazobaktamem;

SAM, ampicylina z sulbaktamem;

GM, gentamycyna;

NET

, netylmycyna;

AN, amikacyna;

CIP

,

ciprofloksacyna;

TE, tetracyklina;

SXT

, trimetoprim z sulfametoksazolem

319

Mechanizmy oporności na antybiotyki β-laktamowe izolatów Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae...

319

Tab. 3. Mechanizmy oporno

ści na antybiotyki

β-laktamowe w

śród szczep

ów Enterobacteriaceae

(opornych na cefotaksym)

Table 3. Resistance mechanisms to

β-lactam antibiotics were among of

Enterobacteriaceae

strains (resistant to cefotaxime)

Liczba szczep

ów

(R – CTX)

Mechanizm oporno

ści – liczba szczep

ów (%)

Gatunek

ESBL

Inne**

CTX-M*

Inne ESBL

ESBL+AmpC

AmpC

Escherichia coli

6

-

3 (50,0%)

-

-

3 (50,0%)

Klebsiella pneumoniae

48

-

30 (62,5%)

6 (12,5%)

-

12 (25,0%)

Proteus mirabilis

18

-

12 (66,7%)

-

-

6 (33,3%)

Enterobacter cloacae

63

-

36 (57,1%)

15 (23,8%)

9 (14,3%)

3 (4,8%)

Razem:

135

-

81 (60,0%)

21 (15,5%)

9 (6,7%)

24 (17,8%)

Objaśnienia: (R-CTX), izolaty oporne na cefotaksym

, ESBL

–

β-laktamazy o szerokim spektrum substratowym

; AmpC – cefalosporynaza C;

* CTX-M (cefotaksymazy)

– obecność genów warunkujących ich wytwarzanie

badano z zastosowaniem techniki PCR;

** - (1) inne

β-laktamazy

, (2) mutacje receptor

ów wiążą

cych antybiotyk,

(3) spadek zdolno

ści transportu leku do miejsca dzia

łania.

320

Paweł Sacha i inni

320

cefalosporyn może być zróżnicowana. Zjawisko to zależy

od rodzajów wytwarzanych β-laktamaz (ESBL). Gonlugur

i wsp. [23] w swoich badaniach otrzymali wyniki świadczące

o wyższej aktywności cefotaksymu (67,9% szczepów

opornych) niż ceftazydymu (71,4% szczepów opornych)

w grupie szczepów ESBL-dodatnich.

W przypadku wykazania zdolności wytwarzania ESBL

i tak należy traktować takie szczepy jako oporne na leczenie

ceftazydymem (i pozostałymi antybiotykami β-laktamowymi).

Wrażliwość na cefotaksym i ceftazydym pozostałych

badanych gatunków (E. coli, P. mirabilis, E. cloacae)

występowała na zbliżonym poziomie.

Antybiotykami, które wykazywały pełną aktywność

wobec wszystkich badanych gatunków (S-CTX i R-

CTX) były: imipenem, meropenem i cefepim (100%).

Zdecydowana większość szczepów opornych na cefo-

taksym, wykazywała jednocześnie oporność na antybiotyki

aminoglikozydowe i połączenia penicylin z inhibitorami.

Przeprowadzone przez nas badania wyłoniły liczną

grupę szczepów (135/303) prezentujących jeden lub

kilka mechanizmów oporności na antybiotyki β-lakta-

mowe. Najczęściej (102/135 – 75,6%) była to zdolność

wytwarzania ESBL. Cechę tą obserwowano wśród 58,6%

pałeczek E. cloacae i 48% K. pneumoniae. Pozostałe

gatunki wykazywały tę zdolność na znacznie niższym

poziomie: P. mirabilis – 17,4% i E. coli – 8,3%.

Z danych literaturowych wynika, że wytwarzanie ESBL

przez poszczególne gatunki pałeczek Enterobacteriaceae

uzależnione jest od wielu czynników. Luzzaro i wsp. [24]

stwierdzili u pacjentów szpitalnych najwięcej szczepów

ESBL-dodatnich wśród Providencia > Enterobacter >

Klebsiella, natomiast u pacjentów leczonych ambulatoryjnie

były to gatunki z rodzaju Proteus i Providencia.

Z kolei wyniki badań przeprowadzonych przez Spanu

i wsp. wraz z The Italian ESBL Study Group [25] na liczbie

8015 izolatów z rodziny Enterobacteriaceae wykazały

najwyższy odsetek szczepów ESBL – dodatnich wśród K.

pneumoniae (37,1%) i P. mirabilis (25,7%).

Rezultaty naszych badań, wskazujące na najczęstszą

zdolność wytwarzania ESBL przez E. cloacae i K.

pneumoniae, wynikają prawdopodobnie z lokalnej sytuacji

epidemiologicznej i zastosowanej w badaniach bardziej

wszechstronnej metody detekcji (MDDT) [21] aniżeli

klasyczna (tj. DDST; ang. double disk synergy test) [5]

. Metoda MDDT pozwala na jednoczesne potwierdzenie

zdolności wytwarzania ESBL i/lub AmpC, co z kolei

przyczynia się do bardziej dokładnego zdefiniowania

tych dwóch mechanizmów oporności na antybiotyki

β

-laktamowe. Mechanizm oporności, związany z

wytwarzaniem AmpC często „maskuje” obecność ESBL

[3, 5].

W grupie 135 szczepów opornych na cefotaksym

zdolność wytwarzania AmpC wykazaliśmy jedynie wśród

gatunków E. cloacae (24 szczepy) i K. pneumoniae (6

szczepów). Często mechanizm ten występował razem ze

zdolnością wytwarzania ESBL (21/30 szczepów).

Badania związane z poszukiwaniem obecności cefo-

taksymaz – pomimo zastosowania czułej techniki detekcji

(PCR) i uniwersalnych starterów dla rodziny enzymów

CTX-M – nie dały pozytywnych rezultatów. Świadczy to

o braku występowania tego typu enzymów w lokalnej

populacji szczepów opornych na cefotaksym (i

wytwarzających ESBL). W celu ustalenia udziału CTX-

M w oporności na antybiotyki β-laktamowe, należałoby

przeprowadzić badania na większej liczbie szczepów.

Poprawna interpretacja wyników oceny wrażliwości na

antybiotyki (antybiogram) powinna opierać się o informacje

uzyskane z rutynowych badań uwzględniających wy-

stępowanie różnych mechanizmów oporności wśród

badanych szczepów bakteryjnych. Ma to kolosalne

znaczenie w doborze przez lekarza antybiotyku skutecznego

w leczeniu zakażeń szczepami wieloopornymi (np.

wytwarzającymi ESBL i/lub AmpC) i eliminacji ich ze

środowiska szpitalnego.

Wnioski

1. Najczęstszym mechanizmem odpowiedzialnym za

oporność na antybiotyki β-laktamowe wśród badanych

pałeczek Enterobacteriaceae było wytwarzanie ESBL

(33,7%) i/lub AmpC (9,9%).

2. Wśród szczepów ESBL – dodatnich opornych na

cefotaksym nie wykazano zdolności wytwarzania CTX-

M (cefotaksymaz).

3. Najwyższą oporność (i różnorodność występujących

mechanizmów oporności) na antybiotyki wykazano u

Enterobacter cloacae i Klebsiella pneumoniae.

4. Imipenem i meropenem wykazywały pełną aktywność

(100% szczepów wrażliwych) wobec wszystkich ba-

danych szczepów.

Piśmiennictwo

1. Christian S.S., Christian J.S.: The cephalosporins antibiotics.

Prim. Care Update Ob/Gyns., 1997, 4(5), 168-174.

2. Nicholson K.G.: Cefalosporyny. W: Antybiotyki i che-

mioterapia. Lambert H.P., O’Grady F.W. (red.). Wy-

dawnictwo Medyczne, Warszawa 1994, 93-138.

3. Bradford P.A.: Extended-spectrum β-lactamases in the 21st

century: characterization, epidemiology, and detection of this

important threat. Clin. Microbiol. Rev., 2001, 14(4), 933-951.

4. Suárez C.J., Lolans K., Villegas M.V., Quinn J.P.: Mechanisms

of resistance to β-lactams in some gram-negative bacteria cau-

sing nosomical infections. Expert Rev. Anti. Infect. Ther., 2005,

3(6), 915-922.

5. Livermoore D.M.: β-lactamases in laboratory and clinical resi-

stance. Clin. Microbiol. Rev., 1995, 8(4) 557-584.

6. Bonnet R.: Growing group of extended-spectrum β-lac-

tamases: the CTX-M enzymes. Antimicrob. Agents Chemo-

ther., 2004, 48(1), 1-14.

7. Rasmussen J.W., Høiby N.: Cefotaximases (CTX-M-ases), an

expanding family of extended-spectrum β-lactamases. Can. J.

321

Mechanizmy oporności na antybiotyki β-laktamowe izolatów Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae...

321

Microbiol., 2004, 50, 137-165.

8. CTX-M-type β-Lactamases. http://www.lahey.org/Studies/

other.asp#table1

9. Kim J., Lim Y.M., Jeong Y.S., Seol S.Y.: Occurrence of CTX-

M-3, CTX-M-15, CTX-M-14 and CTX-M-9 extended-spec-

trum β-lactamases in Enterobacteriaceae clinical isolates in

Korea. Antimicrob. Agents Chemother., 2005, 49(4), 1572-

1575.

10. Villegas M.V., Correa A., Perez F., Zuluaga T., Radice M., Gut-

kind G., Casellas J.M., Ayala J., Lolans K., Quinn J.P. and the

Colombian Nosomical Resistance Study Group.: CTX-12 β-

lactamase in Klebsiella pneumoniae clinical isolate in Colum-

bia. Antimicrob. Agents Chemother., 2004, 48(2) 629-631.

11. Jones R.N., Jenkins S.G., Hoban D.J., Pfaller M.A., Ramphal

R.: In vitro efficacy of six cephalosporins tested against Ente-

robacteriaceae isolated at 38 North American medical centers

participating in the SENTRY Antimicrobial Surveillance Pro-

gram, 1997-1998. Int. J. Antimicrob. Agents.,2000, 15, 111-

118.

12. Al-Agamy M.H.M, Seif El-Din Ashour M., Wiegand I.: First

description of CTX-M β-lactamase-producing clinical Escheri-

chia coli isolates from Egypt. Int. J. Antimicrob. Agents, 2006,

27, 545-548.

13. Pagani L., Dell’Amico E., Migliavacca R., D’Andrea M.M.,

Giacobone E., Amicosante G., Romero E., Rossolini G.M.:

Multiple CTX-M-type extended-spectrum β-lactamases in no-

somical isolates of Enterobacteriaceae from a hospital in Nor-

thern Italy. J. Clin. Microbiol.,2003, 41(9), 4264-4269.

14. Sabaté M., Miró E., Navarro F., Vergés C., Aliga R., Mirellis

B., Prats G.: β-lactamases involved in resistance to broad-spec-

trum cephalosporins in Escherichia coli and Klebsiella spp. cli-

nical isolates collected between 1994 and 1996, in Barcelona

(Spain). J. Antimicrob. Agents Chemother., 2002, 49(6) 989-

997.

15. Quentin C., Arpin C., Dubois V., André C., Lagrange I., Fi-

scher I., Brochet J.P., Grobost F., Jullin J., Dutilh B., Larribet

G., Noury P.: Antibiotic resistance rates and phenotypes among

isolates of Enterobacteriaceae in French extra-hospital practice.

Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 2004, 23, 185-193.

16. Edelstein M., Pimkin M., Edelstein I., Stratchouski L.: Preva-

lence and molecular epidemiology of CTX-M extended-spec-

trum β-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella

pneumoniae in Russian hospitals. Antimicrob. Agents Chemo-

ther., 2003, 47(12), 3724-3732.

17. Gniadkowski M., Scheider I., Pałucha A., Jungwirth R., Mikie-

wicz B., Bauernfeind A.: Cefotaxime-resistant Enterobacteri-

aceae isolates from a hospital in Warsaw, Poland: Identification

of a new CTX-M-3 cefotaxime-hydrolizing β-lactamase that is

closely related to the CTX-M-1/MEN-1 enzyme. Antimicrob.

Agents Chemother., 1998, 42(4) 827-832.

18. Baraniak A., Fiett J., Sulikowska A., Hryniewicz W., Gniad-

kowski M.: Countrywide spread of CTX-M-3 extended-spec-

trum β-lactamase-producing microorganisms of the family

Enterobacteriaceae in Poland. Antimicrob. Agents Chemother.,

2002, 46(1), 151-159.

19. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance

standards for antimicrobial testing. 16th Informational Supple-

ment. M100-S16.Wayne, PA, CLSI, 2006.

20. Hryniewicz W., Sulikowska A., Szczypa K., Skoczyńska

A., Kadłubowska-Łuczak A., Gniadkowski M.: Reko-

mendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na

antybiotyki i chemioterapeutyki. Narodowy Instytut Zdrowia

Publicznego, Warszawa 2006, 1-49.

21. Pitout J.D.D., Reisbig M.D., Venter E.C., Church D.L., Han-

son N.D.: Modification of the double-disk tests for detection of

Enterobacteriaceae producing extended-spectrum and AmpC

β

-lactamases. J. Clin. Microbiol., 2003, 41(8), 3933- 3935.

22. Sundsfjord A., Simonsen G., Haldorsen B., Haaheim H., Hjel-

mevoll S.O., Littauer P., Dahl K.H.: Genetic methods for detec-

tion of antimicrobial resistance. APMIS, 2004, 815-837.

23. Gonlugur U., Bakici M.Z., Akkurt I., Efeoglu T.: Antibiotic

susceptibility patterns among respiratory isolates of gram-ne-

gative bacilli in a Turkish university hospital. BMC Microbio-

logy, 2004, 4, 32.

24. Luzzaro F., Mezzatesta M., Mugnaioli C., Perilli M., Stefani S.,

Amicosante G., Rossolini G.M., Toniolo A.: Trends in produc-

tion of extended-spectrum β-lactamases among enterobacteria

of medical interest: Report of the Second Italian Nationwide

Survey. J. Clin. Microbiol., 2006, 44(5), 1659-1664.

25. Spanu T., Luzzaro F., Perilli M., Amicosante G., Toni-

olo A., Fadda G. and The Italian ESBL Study Group:

Occurrence of extended-spectrum β-lactamases in

members of the family Enterobacteriaceae in Italy: im-

plications for resistance to β-lactams and other anti-

microbial drugs. Antimicrob. Agents Chemother., 2002, 46(1),

196-202.

Adres do korespondencji:

Zakład Diagnostyki Mikrobiologicznej

ul. Waszyngtona 15a

15-276 Białystok