„

„

METODY WYKRYWANIA I

METODY WYKRYWANIA I

IDENTYFIKACJI ORAZ

IDENTYFIKACJI ORAZ

OCENY

OCENY

LEKOWRAZLIWŚCI

LEKOWRAZLIWŚCI

DROBNOUSTROJÓW”

DROBNOUSTROJÓW”

Odpowiednio zorganizowane i

Odpowiednio zorganizowane i

wyposażone laboratorium

wyposażone laboratorium

mikrobiologiczne powinno:

mikrobiologiczne powinno:

•

wykryć czynnik etiologiczny,

wykryć czynnik etiologiczny,

•

zidentyfikować go (przynajmniej do poziomu

zidentyfikować go (przynajmniej do poziomu

gatunku),

gatunku),

•

określić jego wrażliwość na antybiotyki.

określić jego wrażliwość na antybiotyki.

Podstawowe zasady, które muszą

Podstawowe zasady, które muszą

być zachowane przy pobieraniu

być zachowane przy pobieraniu

próbek do badania

próbek do badania

mikrobiologicznego:

mikrobiologicznego:

•

materiał musi pochodzić z

materiał musi pochodzić z

odpowiedniego

odpowiedniego

miejsca

miejsca

,

,

•

próbki powinny być pobierane w odpowiednim

próbki powinny być pobierane w odpowiednim

czasie

czasie

,

,

•

badana próbka musi mieć odpowiednią

badana próbka musi mieć odpowiednią

objętość

objętość

,

,

•

należy używać odpowiednich

należy używać odpowiednich

pojemników

pojemników

i

i

podłoży

podłoży

,

,

•

czas transportu

czas transportu

materiałów musi być jak

materiałów musi być jak

najkrótszy

najkrótszy

i w odpowiednich warunkach,

i w odpowiednich warunkach,

•

pojemnik z materiałem powinien być

pojemnik z materiałem powinien być

oznakowany

oznakowany

(czas pobrania materiału, rozpoznanie, leczenie)

(czas pobrania materiału, rozpoznanie, leczenie)

.

.

METODY

METODY

WYKRYWANIA

WYKRYWANIA

I

I

IDENTYFIKACJI

IDENTYFIKACJI

DROBNOUSTROJÓW

DROBNOUSTROJÓW

METODY

METODY

BEZPOŚREDNIE:

BEZPOŚREDNIE:

•

bakterioskopia bezpośrednia,

bakterioskopia bezpośrednia,

•

hodowla- metoda klasyczna

hodowla- metoda klasyczna

(

(

inkubacja 18-24h

inkubacja 18-24h

)

)

•

wykrywanie antygenów

wykrywanie antygenów

bakteryjnych testami lateksowymi,

bakteryjnych testami lateksowymi,

•

wykrywanie DNA lub RNA

wykrywanie DNA lub RNA

drobnoustroju (metody biologii

drobnoustroju (metody biologii

molekularnej).

molekularnej).

METODY POŚREDNIE:

METODY POŚREDNIE:

•

określenie poziomu swoistych

określenie poziomu swoistych

przeciwciał w surowicy lub płynach

przeciwciał w surowicy lub płynach

ustrojowych,

ustrojowych,

•

próby biologiczne na zwierzętach

próby biologiczne na zwierzętach

(rzadko).

(rzadko).

BAKTERIOSKOPIA

BAKTERIOSKOPIA

BEZPOŚREDNIA

BEZPOŚREDNIA

•

Cel

Cel

– wykazanie obecności bakterii w badanym

– wykazanie obecności bakterii w badanym

preparacie, dostarczenie informacji na temat kształtu

preparacie, dostarczenie informacji na temat kształtu

komórek bakteryjnych i ich charakterystycznych

komórek bakteryjnych i ich charakterystycznych

układów.

układów.

•

J

J

est stosunkowo proste i tanie, nie jest jednak metodą

est stosunkowo proste i tanie, nie jest jednak metodą

czułą

czułą

-

-

materiał musi zawierać minimum 10

materiał musi zawierać minimum 10

5

5

komórek

komórek

bakteryjnych

bakteryjnych

w 1 ml.

w 1 ml.

•

Z próbek materiałów od chorych sporządza się rozmazy

Z próbek materiałów od chorych sporządza się rozmazy

preparaty świeże i utrwalone, barwione i nie barwione.

preparaty świeże i utrwalone, barwione i nie barwione.

•

Metody barwienia stosowane w mikrobiologii klinicznej

Metody barwienia stosowane w mikrobiologii klinicznej

można podzielić na 2 podstawowe grupy:

można podzielić na 2 podstawowe grupy:

•

barwienie negatywne

barwienie negatywne

, gdzie barwi się tło, a

, gdzie barwi się tło, a

drobnoustroje pozostają bezbarwne (tusz chiński,

drobnoustroje pozostają bezbarwne (tusz chiński,

nigrozyna), preparat nie jest uprzednio utrwalony,

nigrozyna), preparat nie jest uprzednio utrwalony,

•

barwienie pozytywne

barwienie pozytywne

, wymagające użycia barwników

, wymagające użycia barwników

mających powinowactwo do drobnoustrojów, nie

mających powinowactwo do drobnoustrojów, nie

barwiących tła, preparat utrwalony.

barwiących tła, preparat utrwalony.

Inny podział obejmuje barwienie

Inny podział obejmuje barwienie

:

:

•

proste

proste

(np. błękitem metylenowym) oraz

(np. błękitem metylenowym) oraz

•

złożone

złożone

(np. metoda Grama, Ziehl-Nielsena).

(np. metoda Grama, Ziehl-Nielsena).

Najczęściej używaną w mikrobiologii klinicznej metodą

Najczęściej używaną w mikrobiologii klinicznej metodą

barwienia jest

barwienia jest

metoda Gram

metoda Gram

a

a

, której

, której

z

z

astosowanie

astosowanie

wprowadziło bardzo istotny z klinicznego punktu

wprowadziło bardzo istotny z klinicznego punktu

widzenia podział drobnoustrojów na Gram(+) i Gram(-)

widzenia podział drobnoustrojów na Gram(+) i Gram(-)

:

:

•

bakterie

bakterie

Gram(+)

Gram(+)

barwią się fioletem krystalicznym na

barwią się fioletem krystalicznym na

kolor granatowy

kolor granatowy

,

,

•

drobnoustroje

drobnoustroje

Gram(-)

Gram(-)

wybarwiają się tylko

wybarwiają się tylko

barwnikiem kontrastowym (fuksyna zasadowa lub

barwnikiem kontrastowym (fuksyna zasadowa lub

safranina) na różowo.

safranina) na różowo.

METODY HODOWLANE

METODY HODOWLANE

•

Są kosztowniejsze, ale dużo czulsze niż metody

Są kosztowniejsze, ale dużo czulsze niż metody

mikroskopowe

mikroskopowe

.

.

•

Materiał zawierający 10² – 10³ CFU/1 ml wykazuje wzrost

Materiał zawierający 10² – 10³ CFU/1 ml wykazuje wzrost

bakterii po posiewie na podłoża stałe, a 10 CFU w 1 ml

bakterii po posiewie na podłoża stałe, a 10 CFU w 1 ml

można wykryć po namnożeniu na podłożach płynnych.

można wykryć po namnożeniu na podłożach płynnych.

•

Badany materiał należy posiać na odpowiedni zestaw

Badany materiał należy posiać na odpowiedni zestaw

podłoży stałych i płynnych. Rodzaj stosowanych podłoży

podłoży stałych i płynnych. Rodzaj stosowanych podłoży

zależy od rodzaju badanego materiału i przewidywanej

zależy od rodzaju badanego materiału i przewidywanej

obecności w nim drobnoustrojów.

obecności w nim drobnoustrojów.

•

Posiew materiałów na podłoża stałe dokonywany jest przy

Posiew materiałów na podłoża stałe dokonywany jest przy

użyciu wyżarzonej uprzednio

użyciu wyżarzonej uprzednio

ezy

ezy

, którą nabiera się jałowo

, którą nabiera się jałowo

materiał zawierający bakterie. Najczęściej stosowana jest

materiał zawierający bakterie. Najczęściej stosowana jest

technika

technika

posiewu redukcyjnego

posiewu redukcyjnego

(posiew z izolacją).

(posiew z izolacją).

Technika wykonywania posiewu

Technika wykonywania posiewu

redukcyjnego.

redukcyjnego.

Technika wykonywania posiewu

Technika wykonywania posiewu

redukcyjnego.

redukcyjnego.

Podział

Podział

podłoży

podłoży

hodowlanych

hodowlanych

:

:

•

namnażające

namnażające

– bogate podłoża nie zawierające

– bogate podłoża nie zawierające

żadnych związków hamujących wzrost drobnoustrojów,

żadnych związków hamujących wzrost drobnoustrojów,

•

selekcyjno-różnicujące

selekcyjno-różnicujące

- wzbogacone są

- wzbogacone są

substancjami o działaniu hamującym na określone

substancjami o działaniu hamującym na określone

grupy drobnoustrojów i jednocześnie ułatwiającym

grupy drobnoustrojów i jednocześnie ułatwiającym

wzrost innym.

wzrost innym.

Inny podział podłoży

Inny podział podłoży

bakteriologicznych:

bakteriologicznych:

•

proste (woda peptonowa),

proste (woda peptonowa),

•

złożone:

złożone:

1.

1.

płynne (bulion cukrowy, bulion krwawy),

płynne (bulion cukrowy, bulion krwawy),

2. s

2. s

tałe

tałe

:

:

-

-

wzbogacone (agar krwawy, agar czekoladowy),

wzbogacone (agar krwawy, agar czekoladowy),

-

-

wzbogacone wybiórcze (agar krwawy z fioletem

wzbogacone wybiórcze (agar krwawy z fioletem

i

i

azydkiem),

azydkiem),

-

-

wybiórczo-różnicujące (MacConkey’a,

wybiórczo-różnicujące (MacConkey’a,

Chapmana,

Chapmana,

Sabourauda

Sabourauda

).

).

Identyfikacja drobnoustroju

Identyfikacja drobnoustroju

polega na:

polega na:

•

określeniu wyglądu kolonii,

określeniu wyglądu kolonii,

•

przygotowaniu preparatu mikroskopowego,

przygotowaniu preparatu mikroskopowego,

•

określeniu właściwości biochemicznych,

określeniu właściwości biochemicznych,

•

określeniu właściwości antygenowych,

określeniu właściwości antygenowych,

•

określeni

określeni

u

u

zjadliwości drobnoustroju.

zjadliwości drobnoustroju.

KOLONIA:

KOLONIA:

•

zbiór komórek wyrastających na podłożu stałym,

zbiór komórek wyrastających na podłożu stałym,

widoczny gołym okiem. Przyjmuje się, że jedna

widoczny gołym okiem. Przyjmuje się, że jedna

kolonia odpowiada jednej komórce bakteryjnej lub

kolonia odpowiada jednej komórce bakteryjnej lub

grzybiczej

grzybiczej

.

.

•

CECHY:

CECHY:

kształt,

kształt,

wielkość,

wielkość,

brzeg,

brzeg,

powierzchnia,

powierzchnia,

struktura,

struktura,

wyniosłość ponad powierzchnię,

wyniosłość ponad powierzchnię,

kolor,

kolor,

przejrzystość,

przejrzystość,

konsystencja,

konsystencja,

zapach,

zapach,

zawieszalność.

zawieszalność.

Właściwości biochemiczne

Właściwości biochemiczne

:

:

•

Fermentacyjne, enzymatyczne (proteaza, lipazy lecytynazy,

Fermentacyjne, enzymatyczne (proteaza, lipazy lecytynazy,

koagulaza,

katalaza

itp.)

stanowią

niejednokrotnie

koagulaza,

katalaza

itp.)

stanowią

niejednokrotnie

podstawową wskazówkę w rozpoznawaniu różnych gatunków

podstawową wskazówkę w rozpoznawaniu różnych gatunków

drobnoustrojów.

drobnoustrojów.

•

Szczególną przydatność ma zdolność fermentowania różnych

Szczególną przydatność ma zdolność fermentowania różnych

węglowodanów i alkoholi; wytwarzanie indolu, siarkowodoru

węglowodanów i alkoholi; wytwarzanie indolu, siarkowodoru

.

.

•

Wybrane cechy metaboliczne określa się za pomocą tzw.

Wybrane cechy metaboliczne określa się za pomocą tzw.

szeregów biochemicznych

szeregów biochemicznych

przygotowanych zgodnie z

przygotowanych zgodnie z

recepturą we własnym zakresie lub przy wykorzystaniu

recepturą we własnym zakresie lub przy wykorzystaniu

gotowych zestawów.

gotowych zestawów.

•

W skład zestawu może wchodzić kilka lub kilkanaście

W skład zestawu może wchodzić kilka lub kilkanaście

substratów do oceny zdolności ich rozkładu przez bakterie.

substratów do oceny zdolności ich rozkładu przez bakterie.

Testy z substratami

Testy z substratami

chromogennych enzymów

chromogennych enzymów

:

:

•

po dodaniu zawiesiny badanego szczepu

po dodaniu zawiesiny badanego szczepu

substrat jest rozkładany przez enzymy

substrat jest rozkładany przez enzymy

bakteryjne. W konsekwencji powstaje produkt

bakteryjne. W konsekwencji powstaje produkt

barwny lub taki, który uzyskuje zabarwienie

barwny lub taki, który uzyskuje zabarwienie

po dodaniu specjalnego odczynnika.

po dodaniu specjalnego odczynnika.

•

Testy te charakteryzują się 95% czułością i

Testy te charakteryzują się 95% czułością i

swoistością oraz umożliwiają identyfikację

swoistością oraz umożliwiają identyfikację

bakterii w czasie krótszym niż 4h.(

bakterii w czasie krótszym niż 4h.(

Neisseria

Neisseria

meningitidis, Enterococcus

meningitidis, Enterococcus

spp. )

spp. )

Analiza chromatografii gazowej

Analiza chromatografii gazowej

:

:

•

zasada

chromatografii

polega

na

uzyskaniu

zasada

chromatografii

polega

na

uzyskaniu

równowagi absorpcyjnej składników w 2 fazach –

równowagi absorpcyjnej składników w 2 fazach –

ruchomej

ruchomej

(obojętny gaz pełniący rol

(obojętny gaz pełniący rol

ę

ę

nośnika) i

nośnika) i

stacjonarnej

stacjonarnej

(płynna).

(płynna).

•

Pary badanej substancji wprowadza się do strumienia

Pary badanej substancji wprowadza się do strumienia

gazowego nośnika; poszczególne składniki badanej

gazowego nośnika; poszczególne składniki badanej

próbki

ulegają

rozdzieleniu,

zależnie

od

próbki

ulegają

rozdzieleniu,

zależnie

od

powinowactwa do fazy płynnej i opuszczają

powinowactwa do fazy płynnej i opuszczają

wykorzystywaną w badaniu kapilarową kolumnę.

wykorzystywaną w badaniu kapilarową kolumnę.

•

Porównanie czasu, w którym składniki opuszczają

Porównanie czasu, w którym składniki opuszczają

kolumnę (

kolumnę (

czas retencji

czas retencji

) z innymi czasami retencji

) z innymi czasami retencji

pozwala na identyfikacje badanego składnika.

pozwala na identyfikacje badanego składnika.

•

Uzyskane chromatogramy porównuje się ze znanymi

Uzyskane chromatogramy porównuje się ze znanymi

standardami.

standardami.

Badanie w

Badanie w

łaściwości

łaściwości

antygenowych

antygenowych

:

:

•

pozwala na

pozwala na

różnicowanie wielu bakterii na

różnicowanie wielu bakterii na

gatunki i serotypy.

gatunki i serotypy.

•

Służą do tego celu m.in. metody serologiczne,

Służą do tego celu m.in. metody serologiczne,

np. aglutynacja szkiełkowa, precypitacja

np. aglutynacja szkiełkowa, precypitacja

probówkowa i inne.

probówkowa i inne.

Odczyn precypitacji

Odczyn precypitacji

:

:

•

reakcja przeciwciało/antygen - pod wpływem

reakcja przeciwciało/antygen - pod wpływem

swoistego przeciwciała łączącego się z cząsteczką

swoistego przeciwciała łączącego się z cząsteczką

antygenu

powstają

kompleksy

antygen-

antygenu

powstają

kompleksy

antygen-

przeciwciało, które łącząc się w większe agregaty

przeciwciało, które łącząc się w większe agregaty

wytrącają się z roztworu w postaci precypitatu.

wytrącają się z roztworu w postaci precypitatu.

•

Reakcja ta jest wysoce swoista, ale czułość jest

Reakcja ta jest wysoce swoista, ale czułość jest

mniejsza niż np. reakcji aglutynacji.

mniejsza niż np. reakcji aglutynacji.

•

Najprostszą metodą precypitacji jest zmieszanie

Najprostszą metodą precypitacji jest zmieszanie

surowicy i antygenu w probówce. W obecności

surowicy i antygenu w probówce. W obecności

swoistych przeciwciał na dnie probówki obserwuje

swoistych przeciwciał na dnie probówki obserwuje

się charakterystyczny osad.

się charakterystyczny osad.

Odczyn aglutynacji

Odczyn aglutynacji

:

:

•

reakcja

przeciwciało/zawiesina

antygenów

-

reakcja

przeciwciało/zawiesina

antygenów

-

powstające kompleksy antygen-przeciwciało łącząc

powstające kompleksy antygen-przeciwciało łącząc

się (zlepiając) w większe agregaty powodują

się (zlepiając) w większe agregaty powodują

mętnienie pierwotnie jednorodnej zawiesiny.

mętnienie pierwotnie jednorodnej zawiesiny.

•

Uzyskany wynik wyraża się w postaci

Uzyskany wynik wyraża się w postaci

miana

miana

, tzn.

, tzn.

największego

rozcieńczenia

przeciwciał

największego

rozcieńczenia

przeciwciał

powodującego aglutynację.

powodującego aglutynację.

•

Ma zastosowanie w diagnostyce m.in. salmonellozy,

Ma zastosowanie w diagnostyce m.in. salmonellozy,

listeriozy

i

mononukleozy

oraz

wykrywania

listeriozy

i

mononukleozy

oraz

wykrywania

Rotawirusów oraz czynnika reumatoidalnego.

Rotawirusów oraz czynnika reumatoidalnego.

Odczyn wiązania dopełniacza

Odczyn wiązania dopełniacza

:

:

•

stosuje się najczęściej do wykrywania swoistych

stosuje się najczęściej do wykrywania swoistych

przeciwciał.

przeciwciał.

•

Dopełniacz

ma

zdolność

wiązania

Dopełniacz

ma

zdolność

wiązania

immunokompleksów. Wolny dopełniacz powoduje

immunokompleksów. Wolny dopełniacz powoduje

lizę krwinek czerwonych, które jako antygen

lizę krwinek czerwonych, które jako antygen

związały na swojej powierzchni przeciwciała

związały na swojej powierzchni przeciwciała

.

.

Jeśli

Jeśli

dopełniacz

zostanie

związany

przez

dopełniacz

zostanie

związany

przez

immunokompleksy nie wystąpi hemoliza.

immunokompleksy nie wystąpi hemoliza.

•

Stosowany jest w diagnostyce toksoplazmozy,

Stosowany jest w diagnostyce toksoplazmozy,

cytomegalii, odry, różyczki, brucelozy, zakażeń

cytomegalii, odry, różyczki, brucelozy, zakażeń

wirusem typu herpes, duru brzusznego, durów

wirusem typu herpes, duru brzusznego, durów

rzekomych oraz zakażeń o etiologii

rzekomych oraz zakażeń o etiologii

Mycoplasma.

Mycoplasma.

TESTY LATEKSOWE

TESTY LATEKSOWE

•

Zasada działania testów oparta jest o reakcję

Zasada działania testów oparta jest o reakcję

aglutynacji

zachodzącej

w

układzie

antygen-

aglutynacji

zachodzącej

w

układzie

antygen-

przeciwciało. Antygen znajduje się w badanym

przeciwciało. Antygen znajduje się w badanym

materiale klinicznym, zaś drugim elementem tego

materiale klinicznym, zaś drugim elementem tego

układu są monoklonalne przeciwciała przeciwko

układu są monoklonalne przeciwciała przeciwko

określonemu antygenowi (np. otoczce) opłaszczone

określonemu antygenowi (np. otoczce) opłaszczone

na nośniku (cząsteczki lateksu).

na nośniku (cząsteczki lateksu).

•

Dostępne na rynku testy lateksowe pozwalają nie

Dostępne na rynku testy lateksowe pozwalają nie

tylko na stwierdzenie obecności drobnoustrojów, ale

tylko na stwierdzenie obecności drobnoustrojów, ale

także na ich identyfikację.

także na ich identyfikację.

•

Mimo

iż

testy

lateksowe

przyśpieszają

i

Mimo

iż

testy

lateksowe

przyśpieszają

i

ukierunkowują

badanie

mikrobiologiczne,

nie

ukierunkowują

badanie

mikrobiologiczne,

nie

zwalniają z wykonania klasycznej diagnostyki metod

zwalniają z wykonania klasycznej diagnostyki metod

ą

ą

hodowli.

hodowli.

TEST ELISA

TEST ELISA

•

pozwala na jakościowe i ilościowe oznaczanie

pozwala na jakościowe i ilościowe oznaczanie

przeciwciał (we wszystkich klasach) i antygenów w

przeciwciał (we wszystkich klasach) i antygenów w

materiale biologicznym

materiale biologicznym

•

o

o

party

jest

na

zasadzie

chromatografii

party

jest

na

zasadzie

chromatografii

powinowactwa

powinowactwa

-

-

znany czynnik (antygen lub

znany czynnik (antygen lub

immunoglobulinę) absorbuje się na stałym podłożu.

immunoglobulinę) absorbuje się na stałym podłożu.

Do powstałej w ten sposób fazy stałej przyłącza się

Do powstałej w ten sposób fazy stałej przyłącza się

swoisty antygen lub przeciwciała (jeśli są obecne w

swoisty antygen lub przeciwciała (jeśli są obecne w

badanej próbce). Nie związany materiał usuwa się

badanej próbce). Nie związany materiał usuwa się

przez płukanie. Po wypłukaniu zbędnego materiału i

przez płukanie. Po wypłukaniu zbędnego materiału i

dodaniu odpowiedniego dla enzymu substratu

dodaniu odpowiedniego dla enzymu substratu

oznacza się spektrofotometrycznie intensywność

oznacza się spektrofotometrycznie intensywność

reakcji barwnej, która jest odzwierciedleniem

reakcji barwnej, która jest odzwierciedleniem

rozkładu substratu przez enzym. Na tej podstawie

rozkładu substratu przez enzym. Na tej podstawie

wnioskuje

się

o

zawartości

poszukiwanych

wnioskuje

się

o

zawartości

poszukiwanych

czynników w badanym materiale (antygenów lub

czynników w badanym materiale (antygenów lub

przeciwciał).

przeciwciał).

Olbrzymia rola, wysoka czułość i

Olbrzymia rola, wysoka czułość i

swoistość

swoistość

testów ELISA

testów ELISA

doprowadziła

doprowadziła

do wykonania testów fabrycznych,

do wykonania testów fabrycznych,

wysoko zautomatyzowanych, a nawet

wysoko zautomatyzowanych, a nawet

skomputeryzowanych.

skomputeryzowanych.

Testy ELISA wykorzystuje się w

Testy ELISA wykorzystuje się w

diagnostyce np. toksoplazmozy,

diagnostyce np. toksoplazmozy,

cytomegalii, różyczki, żółtaczki zakaźnej,

cytomegalii, różyczki, żółtaczki zakaźnej,

Chlamydia

Chlamydia

, wirusów

, wirusów

RSV

RSV

,

,

Rotawirusów

Rotawirusów

i

i

Helicobacter pylori

Helicobacter pylori

.

.

IMMUNOBLOTTING

IMMUNOBLOTTING

•

może być zastosowany do analizy antygenów

może być zastosowany do analizy antygenów

białkowych,

a

także

do

charakteryzowania

białkowych,

a

także

do

charakteryzowania

przeciwciał

przeciwciał

•

w

w

ykorzys

ykorzys

tywany

tywany

często do wykrywania swoistych

często do wykrywania swoistych

przeciwciał w surowicy chorych

przeciwciał w surowicy chorych

•

jest rozszerzeniem badań serologicznych, które

jest rozszerzeniem badań serologicznych, które

wykazują obecność swoistych antygenów różnych

wykazują obecność swoistych antygenów różnych

patogenów, a także swoiste przeciwciała reagujące z

patogenów, a także swoiste przeciwciała reagujące z

charakterystycznymi antygenami białkowymi tych

charakterystycznymi antygenami białkowymi tych

patogenów

patogenów

•

z

z

dużym powodzeniem jest stosowany w diagnostyce

dużym powodzeniem jest stosowany w diagnostyce

zakażeń wirusowych, bakteryjnych i zakażeń

zakażeń wirusowych, bakteryjnych i zakażeń

pierwotniakami

(np.

wirusem

cytomegalii,

pierwotniakami

(np.

wirusem

cytomegalii,

Helicobacter pylori, Campylobacter, Clostridium,

Helicobacter pylori, Campylobacter, Clostridium,

Escherichia coli, Staphylococcus oraz Toxoplasma

Escherichia coli, Staphylococcus oraz Toxoplasma

gondii

gondii

)

)

METODY BIOLOGII

METODY BIOLOGII

MOLEKULARNEJ

MOLEKULARNEJ

•

d

d

ecyzja o ich wdrożeniu do diagnostyki jest

ecyzja o ich wdrożeniu do diagnostyki jest

uzależniona od czułości, swoistości oraz

uzależniona od czułości, swoistości oraz

szybkości wykrywania określonego patogenu w

szybkości wykrywania określonego patogenu w

stosunku do metod konwencjonalnych

stosunku do metod konwencjonalnych

•

wyróżnia się metody oparte na analizie

wyróżnia się metody oparte na analizie

lipopolisacharydów i kwasów tłuszczowych,

lipopolisacharydów i kwasów tłuszczowych,

białek oraz kwasów nukleinowych

białek oraz kwasów nukleinowych

•

w

w

materiale klinicznym pobranym od chorego

materiale klinicznym pobranym od chorego

poszukuje się charakterystycznych dla danego

poszukuje się charakterystycznych dla danego

drobnoustroju

węglowodorów,

białek

czy

drobnoustroju

węglowodorów,

białek

czy

unikatowych sekwencji DNA lub RNA

unikatowych sekwencji DNA lub RNA

SONDY GENETYCZNE

SONDY GENETYCZNE

•

przygotowanie

materiału

i

denaturacja

przygotowanie

materiału

i

denaturacja

(oddzielenie nici DNA)

(oddzielenie nici DNA)

•

dodanie

znakowanej

sondy

i

hybrydyzacja

dodanie

znakowanej

sondy

i

hybrydyzacja

(rozpoznanie i łączenie się sondy z odszukanymi w

(rozpoznanie i łączenie się sondy z odszukanymi w

materiale

klinicznym

sekwencjami

materiale

klinicznym

sekwencjami

komplementarnymi)

komplementarnymi)

•

usunięcie nie związanej sondy

usunięcie nie związanej sondy

•

wykrycie związanej sondy (obecnie używane sondy

wykrycie związanej sondy (obecnie używane sondy

nie są w stanie wykryć pojedynczej matrycy w

nie są w stanie wykryć pojedynczej matrycy w

badanym materiale, ponieważ pojedynczy produkt

badanym materiale, ponieważ pojedynczy produkt

hybrydyzacji nie pozwala na otrzymanie czytelnego

hybrydyzacji nie pozwala na otrzymanie czytelnego

sygnału. Dlatego w celu zwielokrotnienia sygnału

sygnału. Dlatego w celu zwielokrotnienia sygnału

stosuje się szereg reakcji opierających się na

stosuje się szereg reakcji opierających się na

znakowaniu sondy produktem, który w obecności

znakowaniu sondy produktem, który w obecności

odpowiedniego enzymu wyzwala reakcję świetlną.)

odpowiedniego enzymu wyzwala reakcję świetlną.)

POLIMERAZOWA REAKCJA

POLIMERAZOWA REAKCJA

AMPLIFIKACJI

AMPLIFIKACJI

(PCR)

(PCR)

•

polega na enzymatycznym powieleniu

polega na enzymatycznym powieleniu

in vitro

in vitro

wybranego, ściśle gatunkowo-swoistego odcinka

wybranego, ściśle gatunkowo-swoistego odcinka

DNA

DNA

•

z

z

wielokrotnioną liczbę otrzymanych fragmentów

wielokrotnioną liczbę otrzymanych fragmentów

DNA wykrywa się w świetle UV na żelach

DNA wykrywa się w świetle UV na żelach

agarozowych, wybarwionych bromkiem etydyny

agarozowych, wybarwionych bromkiem etydyny

•

s

s

onda molekularna z użyciem techniki PCR jest

onda molekularna z użyciem techniki PCR jest

coraz

szerzej

stosowana

w

diagnostyce

coraz

szerzej

stosowana

w

diagnostyce

mikrobiologicznej, zwłaszcza zakażeń lub zarażeń

mikrobiologicznej, zwłaszcza zakażeń lub zarażeń

wywoływanych

przez

drobnoustroje

trudno

wywoływanych

przez

drobnoustroje

trudno

hodowlane lub występujące w materiale w bardzo

hodowlane lub występujące w materiale w bardzo

małych ilościach, wewnątrzkomórkowo, np.:

małych ilościach, wewnątrzkomórkowo, np.:

•

wirusy

wirusy

:

:

HIV 1 i HIV 2, HCV 1 i HCV 2,

HIV 1 i HIV 2, HCV 1 i HCV 2,

enterowirusy,

enterowirusy,

rotawirusy

rotawirusy

•

bakterie

bakterie

:

:

Mycobacterium spp., Borellia

Mycobacterium spp., Borellia

burgdorferi,

Chlamydia

spp.,

burgdorferi,

Chlamydia

spp.,

Mycoplasma spp., H. influenzae, Listeria

Mycoplasma spp., H. influenzae, Listeria

monocytogenes

monocytogenes

•

grzyby

grzyby

:

:

Cryptococus

neoformans

Cryptococus

neoformans

i

i

grzyby dimorficzne

grzyby dimorficzne

•

pierwotniaki

pierwotniaki

:

:

Giardia

lamblia,

Giardia

lamblia,

Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii

.

.

METODY OZNACZANIA

METODY OZNACZANIA

WRA

WRA

Ż

Ż

LIWOSCI

LIWOSCI

DROBNOUSTROJÓW NA

DROBNOUSTROJÓW NA

CHEMIOTERAPEUTYKI

CHEMIOTERAPEUTYKI

METODA (DYFUZYJNO -

METODA (DYFUZYJNO -

KRĄŻKOWA)

KRĄŻKOWA)

•

przy użyciu krążków nasyconych antybiotykami o

przy użyciu krążków nasyconych antybiotykami o

odpowiednich stężeniach

odpowiednich stężeniach

•

s

s

tosowane są 2 metody: wg

tosowane są 2 metody: wg

ICS

ICS

(

(

International

International

Collaborative Study

Collaborative Study

) lub zgodne z

) lub zgodne z

NCCLS

NCCLS

(

(

National Committetee for Clinical Laboratory

National Committetee for Clinical Laboratory

Standards

Standards

)

)

•

w

w

arunkiem otrzymania wiarygodnego wyniku jest

arunkiem otrzymania wiarygodnego wyniku jest

pełne wystandaryzowanie warunków w jakich

pełne wystandaryzowanie warunków w jakich

prowadzone jest badanie

prowadzone jest badanie

•

u

u

żywane podłoża muszą mieć odpowiednie pH i

żywane podłoża muszą mieć odpowiednie pH i

skład jonowy

skład jonowy

•

w

w

ażne jest również, aby podłoża rozlewane były

ażne jest również, aby podłoża rozlewane były

miarowo i miały odpowiednią grubość

miarowo i miały odpowiednią grubość

•

i

i

stotne znaczenie ma także gęstość hodowli

stotne znaczenie ma także gęstość hodowli

stosowana w badaniu

stosowana w badaniu

Metody przygotowania zawiesiny

Metody przygotowania zawiesiny

badanego szczepu (inokulum) do

badanego szczepu (inokulum) do

oznaczania:

oznaczania:

•

standardowa

standardowa

–

używa

się

hodowli

–

używa

się

hodowli

logarytmicznej w fazie wzrostu; polega na

logarytmicznej w fazie wzrostu; polega na

inkubacji przez 2-8 h w temp

inkubacji przez 2-8 h w temp

.

.

35-37

35-37

º

º

C

C

bulionowej zawiesiny 4-5 kropli badanego

bulionowej zawiesiny 4-5 kropli badanego

szczepu do uzyskania zmętnienia równego 0,5

szczepu do uzyskania zmętnienia równego 0,5

jednostki w skali McFarlanda

jednostki w skali McFarlanda

,

,

•

bezpośredniego zawieszania

bezpośredniego zawieszania

– zawiesiną

– zawiesiną

badanego szczepu sporządza się w jałowym

badanego szczepu sporządza się w jałowym

bulionie lub ja

bulionie lub ja

ł

ł

owej soli fizjologicznej do gęstości

owej soli fizjologicznej do gęstości

równej 0,5 jednostki w skali McFarlanda

równej 0,5 jednostki w skali McFarlanda

.

.

•

Bez względu na sposób przygotowania inokulum

Bez względu na sposób przygotowania inokulum

jego gęstość powinna dla większości bakterii

jego gęstość powinna dla większości bakterii

wynosić

wynosić

0,5 w skali McFarlanda

0,5 w skali McFarlanda

lub więcej dla

lub więcej dla

określonych gatunków bakterii np. Helicobacter

określonych gatunków bakterii np. Helicobacter

pylori.

pylori.

•

Tak wykonaną zawiesinę wymazuje się na

Tak wykonaną zawiesinę wymazuje się na

powierzchnię

agaru

Mueller-Hinton

i

po

powierzchnię

agaru

Mueller-Hinton

i

po

wyschnięciu układa się krążki bibułowe nasycone

wyschnięciu układa się krążki bibułowe nasycone

antybiotykami.

antybiotykami.

•

P

P

o całonocnej inkubacji mierzy się średnice stref

o całonocnej inkubacji mierzy się średnice stref

zahamowania wzrostu (w mm) i interpretuje ze

zahamowania wzrostu (w mm) i interpretuje ze

stosowanym standardem (NCCLS lub ICS).

stosowanym standardem (NCCLS lub ICS).

•

Wielkość

strefy

zahamowania

wzrostu

jest

Wielkość

strefy

zahamowania

wzrostu

jest

odwrotnie proporcjonalna do wartości MIC danego

odwrotnie proporcjonalna do wartości MIC danego

antybiotyku wobec badanego szczepu.

antybiotyku wobec badanego szczepu.

METODY ROZCIEŃCZENIOWE

METODY ROZCIEŃCZENIOWE

W PODŁOŻU STAŁYM LUB

W PODŁOŻU STAŁYM LUB

PŁYNNYM

PŁYNNYM

•

metody ilościowe

metody ilościowe

polegają

polegają

ce

ce

na sporządzaniu

na sporządzaniu

serii kolejnych rozcieńczeń badanego antybiotyku

serii kolejnych rozcieńczeń badanego antybiotyku

•

określają najmniejsze stężenia antybiotyków

określają najmniejsze stężenia antybiotyków

hamujące wzrost drobnoustrojów (

hamujące wzrost drobnoustrojów (

MIC

MIC

w mg/l)

w mg/l)

lub najniższe stężenie bakteriobójcze (

lub najniższe stężenie bakteriobójcze (

MBC

MBC

w

w

mg/l)

mg/l)

•

b

b

adane szczepy są inkubowane w probówkach

adane szczepy są inkubowane w probówkach

(hodowla płynna) lub na płytkach agarowych

(hodowla płynna) lub na płytkach agarowych

zawierających odpowiednie stężenie antybiotyku

zawierających odpowiednie stężenie antybiotyku

•

m

m

inimalnym stężeniem hamującym będzie to, w

inimalnym stężeniem hamującym będzie to, w

którym brak jest wzrostu drobnoustrojów

którym brak jest wzrostu drobnoustrojów

widocznego gołym okiem

widocznego gołym okiem

PODZIAŁ SZCZEPÓW

PODZIAŁ SZCZEPÓW

BAKTERYJNYCH

BAKTERYJNYCH

wg lekowrażliwości

wg lekowrażliwości

•

wrażliw

wrażliw

e

e

(S=sensitive), gdy wartość MIC ≤ od

(S=sensitive), gdy wartość MIC ≤ od

stężenia tego chemioterapeutyku osiąganego w

stężenia tego chemioterapeutyku osiąganego w

surowicy przy normalnym dawkowaniu leku

surowicy przy normalnym dawkowaniu leku

•

średniowrażliwe

średniowrażliwe

(I=intermediate), w leczeniu

(I=intermediate), w leczeniu

mogą być użyte antybiotyki, których stężenie w

mogą być użyte antybiotyki, których stężenie w

surowicy

może

być

podwyższone

przez

surowicy

może

być

podwyższone

przez

zwiększenie jednorazowych dawek leku

zwiększenie jednorazowych dawek leku

•

oporne

oporne

(R=resistant), których wartości MIC > od

(R=resistant), których wartości MIC > od

stężenia tego chemioterapeutyku osiąganego w

stężenia tego chemioterapeutyku osiąganego w

surowicy

surowicy

INNE

INNE

METODY

METODY

•

E-test

E-test

y

y

– gotowe p

– gotowe p

aski nasycone są antybiotykami w

aski nasycone są antybiotykami w

gradiencie stężenia, od najwyższego do najmniejszego,

gradiencie stężenia, od najwyższego do najmniejszego,

a podziałka pozwala na dokładne odczytanie wartości

a podziałka pozwala na dokładne odczytanie wartości

MIC

MIC

•

metody

metody

półautomatyczne

półautomatyczne

lub

lub

automatyczne

automatyczne

,

,

półilościowe

półilościowe

lub

lub

ilościowe

ilościowe

-

-

gotowe

panele

gotowe

panele

zawierające graniczne rozcieńczenia antybiotyków

zawierające graniczne rozcieńczenia antybiotyków

(

(

break-point

break-point

).

Panele

takie

są

odczytywane

w

).

Panele

takie

są

odczytywane

w

specjalnych urządzeniach ATB i Sceptor.

specjalnych urządzeniach ATB i Sceptor.

M

M

ogą być

ogą być

jednak stosowane wyłącznie w laboratoriach z

jednak stosowane wyłącznie w laboratoriach z

personelem wyszkolonym w dziedzinie mikrobiologii

personelem wyszkolonym w dziedzinie mikrobiologii

klinicznej. Pozwala to na korygowanie pojawiających się

klinicznej. Pozwala to na korygowanie pojawiających się

czasem absurdalnych wyników odczytu urządzenia

czasem absurdalnych wyników odczytu urządzenia