Laboratorium 4.

Izolacja czystych kultur

Escherichia Coli – pojedyncze kolonie są lekko wypukłe na środku i ciemniejsze, mają gładkie brzegi, barwa kremowa/ecru, kolonie błyszczące; ().

Serratia marcescens (pałeczka cudowna / pałeczka krwawa) – wytwarza czerwony barwnik (prodigiozyna) pod wpływem rozproszonego światła (17-, optimum ), pojedyncza kolonia wygląda jak kropla krwi, rozwija się na prawdziwym, suszonym mięsie, suszonych szynkach, wędzonych, suszonych rybach (ale tylko na tradycyjnych, nie sklepowych); cuda typu „Matka Boska płacze krwawymi łzami” – bakterie te mają idealne warunki do życia w kaplicach, kościołach (temperatura + rozproszone światło) i dlatego potrafią się tam świetnie rozwinąć;

Rozizolowanie bakterii:
1. posiew redukcyjny hodowli mieszanej E. Coli i S. Marcescens (1 płytka)
2. metoda szeregu rozcieńczeń (2 płytki, 6 sterylnych probówek)

10^-1 10^-2 10^-3 10^-4 10^-5 10^-6

Do 6 sterylnych probówek wlewa się sterylnie podane ilości płynu fizjologicznego. Do 1 probówki wlać 1 ml bakterii z hodowli wyjściowej. Otrzymujemy tam 10krotne rozcieńczenie (zapis: 10^-1). Bardzo starannie wymieszać. Do 2 probówki pobrać 1 ml bakterii z probówki 1. Otrzymujemy w stosunku do hodowli wyjściowej rozcieńczenie 100krotne. Wymieszać. Do probówki 3 pobrać 0,1 ml (100μl) z probówki 2. Otrzymujemy rozcieńczenie 10000 krotne. Wymieszać. Do 4 1ml z 3. Do 5 1ml z 4. Do 6 1ml z 5. Z dwóch ostatnich probówek pobieramy po 100 μl bakterii i wykonujemy posiew głaszczką szklaną. Na płytce należy zapisać rozcieńczenie.

Płyn fizjologiczny – 0,9% roztwór NaCl – roztwór izotoniczny w stosunku do bakterii – nie mogą w nim się rozmnażać, ale przeżyją kilka godzin;
płyn Ringera – prawie to samo; 0,86% roztwór NaCl;

W metodzie szeregu rozcieńczeń pierwsze rozcieńczenie musi być 10 krotne. Kolejne już wybieramy dowolnie (10krotne, 100krotne, mieszane).

Laboratorium 5.

Metody liczenia drobnoustrojów

Wyniki poprzedniego doświadczenia:
Z płytki, na którą posiana została hodowla rozcieńczona do 10^-6, wyrosło 120 kolonii E.Coli, więc w 100μl było 120 komórek bakterii.
120x10=1200 – liczba bakterii w 1 ml.
120x10x10⁶~=1,2x10⁹ komórek w 1 ml hodowli wyjściowej!
wynik zawsze podaje się w sztukach/ml! (bądź gram zamiast mililitra)

Płytka, na którą została posiana hodowla rozcieńczona do 10^-7:
12x10x10⁷=1,2x10⁹ kom/ml
Średnia arytmetyczna
nie liczy się, gdy jest więcej niż 300 kolonii na płytce

E. Coli – duże kolonie
S. Marcescens – małe, drobne kolonie

10^-7: E.Coli: 4
S. Marcescens: 11
10^-6: E.Coli: 30-40

Ćwiczenie:
Zrobić szereg rozcieńczeń:

10^-1 10^-3 10^-5 10^-6

Zrobić posiew głaszczką z probówek 10^-5 i 10^-6 (jedna osoba jedną, druga drugą).
Wyniki:
10^-6 12 12 x 10⁷ = 1,2 x 10^{8 komórek} / _ml

2. Wykonać następujące rozcieńczenia:
2x 4x 10x
3ml 3ml skorzystać z rozcieńczenia hodowla
3ml 3ml z ćwiczenia 1 płyn fizj.
Po wykonaniu należy odczytać gęstość optyczną dla tych rozcieńczeń + dla hodowli wyjściowej (nierozcieńczanej). Używamy długości światła 550 nm.

3. Obejrzeć komorę Thoma pod mikroskopem – znaleźć duże i małe kwadraty, a następnie spróbować policzyć Saccharomyces Cerevisiae. Należy ustawić ostrość na sucho na mikroskopie- żeby zobaczyć te kwadraty.
Obiektyw imersyjny – nie da się nim oglądać tego, co jest „w powietrzu” czyli bakterii, trzeba nalać do niego specjalnego oleju.
Mikroskop – od najmniejszego do największego zbliżenia, śruba makro tylko raz, żeby znaleźć, potem mikro dla znalezienia ostrości i przy przestawianiu przybliżeń na kolejne.

Potem dać kroplę Saccharomyces cerevisiae (drożdże piekarskie) – nieruchliwe, spokojne, tak jak erytrocyty czy leukocyty i spróbować je policzyć – 1-2 kwadraty. Profesjonalnie liczy się 5 dużych kwadratów i wyciąga średnią (czyli 80 małych!). Jeśli na krawędziach między kwadratami są również bakterie, to liczy się dwie krawędzie.
E. Coli nie da się policzyć, bo biegają.
Wyniki:
10^-1: 0,021
4x: 0,087
2x: 0,135
0: 0,200

Metody liczenia drobnoustrojów:
1) Metoda szeregu rozcieńczeń (metoda pośrednia)
2) Metoda zmętnieniowa (metoda pośrednia)
3) Bezpośrednia metoda liczenia drobnoustrojów

Ad 2)
im bardziej mętna hodowla (im więcej bakterii) tym mniej światła przejdzie i tym więcej zostanie odbite (rozproszone, załamane…) - („brudne okno”); mierzy się ilość odbitego światła (tego, które nie przeszło), używa się jednej długości światła; martwe komórki też dają zmętnienie!
sposób na sprawdzenie, czy bakterie żyją – sprawdzamy gęstość optyczną raz, a za godzinę drugi raz – jeśli jest większa, to znaczy, że bakterie żyją i się rozmnażają, przez co jest ich więcej;
sposób na sprawdzenie wpływu określonego związku/ substancji, np. leku czy dodatku do żywności, na bakterie (toksyczność – jeśli zabije bakterie, może szkodzić i nam); przygotowuje się dwie próbki – jedna to bakterie, a druga bakterie z danym związkiem – jeśli w próbce bakterii z danym związkiem jest ich mniej niż w kontrolnej, tzn. że ten związek je zabija;
Gęstość Optyczna (O.D.) – pot. „zmierz absorbancję bakterii”
550/560 nm – takiej długości światła używa się najczęściej, ale może być też 580 czy nawet 600nm, byle cały czas była używana jedna i ta sama długość;

Krzywa standardowa
krzywa zależności wartości O.D. 550 od liczby bakterii;
z ćw. 1 oszacujemy ilość bakterii i dla niej wyznaczamy gęstość optyczną; krzywa nie uwzględnia martwych komórek; jest prawdziwa tylko dla DANEJ BAKTERII W DANYCH WARUNKACH! Np. dla E. Coli na bulionie odżywczym.

liczba bakterii może być zlogarytmowana

Ad 3)
w komorach Thoma / Fuchsa
komory Thoma:
1 szkło ma 2 komory; tworzą siatkę 16 kwadratów (4x4);
0,1 mm – głębokość komory, można obliczyć objętość, nanosi się bakterie na siatkę i przykrywa szkiełkiem nakrywkowym, żeby nadmiar wypłynął;

środek krzyża składa się z kwadratu podzielonego na 16 dużych kwadratów, które również są podzielone na 16 małych kwadratów;
duże kwadraty są oddzielone od siebie dodatkowymi liniami (podwójne wgłębienia)

TEORIA
Czysta kultura – hodowla złożona z jednego gatunku drobnoustrojów, czyli hodowla wyprowadzona z jednej komórki bakteryjnej (klon);

Metody izolacji czystych kultur:

I Metody bezpośrednie:
1. Za pomocą mikromanipulatora – bezpośrednio pod mikroskopem pobiera się mikropipetką jedną komórkę bakteryjną i umieszcza w kropelce jałowej pożywki;
2. Za pomocą mikropipetki pasterowskiej.

II Metody pośrednie:
1. Metoda płytkowa – 3 odmiany:
-rozsiewu
-płytek lanych
-wysiewu powierzchniowego
2. Metoda rozcieńczeń – polega na sporządzeniu kolejnych rozcieńczeń badanego płynu, aż do uzyskania takiego rozcieńczenia, gdzie teoretycznie będzie się znajdowała nie więcej niż jedna bakteria.

Klon – uzyskana jedną z powyższych metod czysta hodowla i pochodzące od niej populacje mikroorganizmów;

Szczepy – różne klony należące do tego samego gatunku, a wyprowadzone z poszczególnych czystych kultur izolowanych niezależnie od siebie;

Całkowitą ilość bakterii można także określić metodą mikroskopową w specjalnie kalibrowanych komorach, np. Thoma, Fuchsa- Rosethala;
Często stosowana jest też metoda określania ilości bakterii przy pomocy turbidymetrii lub nefelometrii;
Można też wykorzystać fakt, że ilość azotu i fosforu w danym gatunku bakterii jest mniej więcej stała. Oznaczając ilość azotu organicznego i/lub fosforu w zawiesinie bakterii można oszacować ich ilość.

Inne metody:
- liczenie komórek bakterii na filtrach membranowych (gł. wodne środowiska ubogie w drobnoustroje);
- oznaczanie suchej masy drobnoustrojów (promieniowce i grzyby nitkowate);
- biluminescencja i chemiluminescencja – miarą biomasy jest stężenie ATP;
- radiometria – dostarczanie mikroorganizmom substratu znakowanego izotopem promieniotwórczym, poziom radioaktywności charakteryzuje intensywność wzrostu drobnoustrojów;