Ćwiczenie 4
Techniki posiewów mikrobiologicznych. Izolacja czystych kultur.
Zadanie 1.
Izolacja mikroorganizmów metoda posiewu redukcyjnego.
Wykorzystać przygotowaną hodowlę mieszaną szczepów: Serratia marcescens i Escherichia coli.
Z przygotowanej probówki z hodowlą mieszaną pobrać ezą, zanurzając oczko ezy w płynie hodowlanym, materiał mikrobiologiczny i nanieść wg schematu na płytkę z agarem odżywczym.
Posiew ten polega na trzykrotnym pociągnięciu ezą po agarze odżywczym.
Po pobraniu hodowli płynnej wykonać pierwsze pociągnięcie zygzakowate w jednej części płytki przy lekko uchylonym wieczku, zamknąć płytkę-ten posiew wykonujemy na ½ powierzchni płytki. Obrócić ją o 90 stopni.
Dobrze wyżarzyć ezę w płomieniu palnika, przestudzić w pobliżu ognia i wykonać drugie pociągnięcie, zaczynając od miejsca gdzie został zakończony poprzedni posiew, w ten sposób bakterie do następnego rozsiewu są pobrane z ostatniej rysy poprzedniego- ten posiew wykonujemy zygzakiem na ¼ płytki przy lekko uchylonym wieczku, zamknąć płytkę, trzeba uważać, żeby podczas rozsiewu nie wejść na pole płytki na którym już są mikroorganizmy z poprzedniego naniesienia. Obrócić o 90 stopni.
Dobrze wyżarzyć ezę w płomieniu, ostudzić w pobliżu palnika i wykonać trzecie pociągnięcie zaczynając od miejsca zakończenia drugiego zygzaka, umożliwia to pobranie bakterii i maksymalne oddalenie ich od siebie podczas wykonywania ćwiczenia. Ten posiew wykonujemy na ¼ płytki przy lekko uchylonym wieczku, zamknąć płytkę, także nie wolno zahaczyć o linie poprzedniego naniesienia.
Taka metoda izolowania czystej hodowli polega na tym, że przy każdym następnym pociągnięciu ezą po płytce rozprowadzamy bakterie po podłożu coraz bardziej rozrzedzając hodowlę wyjściową, to powinno zaowocować uzyskaniem na płytce wzdłuż linii ostatniego posiewu odległych od siebie pojedynczych kolonii.
Zadanie 2.
Izolacja mikroorganizmów metodą rozcieńczeń.
Wykorzystać przygotowaną hodowlę mieszaną szczepów: Serratia marcescens i Escherichia coli.
Metoda ta pozwala na rozizolowanie hodowli mieszanych przy pomocy innego rodzaju posiewu- posiewu głaszczką. Pierwszym etapem jest przygotowanie odpowiednich rozcieńczeń wyjściowej hodowli mikroorganizmów.
Przygotowanie rozcieńczeń.
Przygotować sześć probówek, ponumerować. Do probówek 1,2,4,5,6, wlać po 9 ml płynu fizjologicznego, do probówki nr 3 wlać 9.9 ml płynu fizjologicznego.
Hodowlę rozcieńczamy wlewając sterylnie 1 ml do prob. Nr1, zamieszać zawartość wdmuchując delikatnie powietrze do probówki.
Następnie tą samą pipetą sterylnie pobieramy 1 ml z prob. Nr 1. i przenosimy go do prob. Nr 2., mieszamy. Z probówki nr2. pobieramy 0.1 ml i przenosimy do prob. Nr3, mieszamy.
Z prob. Nr3 przenosimy 1ml do prob. Nr4., mieszamy, z prob. Nr 4 przenieść 1ml do probówki nr.5, wymieszać i pobrać 1ml i przelać do prob. Nr6.
Każdemu przeniesieniu 1ml towarzyszy rozcieńczenie 10 krotne hodowli, a przeniesieniu 0.1 ml prob. Nr3 100 krotne rozcieńczenie.
W probówce nr 1 hodowla wyjściowa jest rozcieńczona 10 x, co w mikrobiologii zapisuje się jako rozcieńczenie 10-1 .
Posiew głaszczką wykonujemy wykorzystując rozcieńczenia hodowli wyjściowej 10-6 Pobieramy sterylnie 0.1 ml odpowiedniego rozcieńczenia i wlewamy na płytkę z agarem odżywczym lekko uchylając wieczko płytki. Następnie sterylną głaszczką rozgłaskujemy mikroorganizmy po powierzchni płytki, przy lekko uchylonym wieczku, zamykamy płytkę, odwracamy ją i zostawiamy do inkubacji.
Dokładny rozcieńczenie i rozgłaskanie takiej hodowli na płytce z agarem odżywczym umożliwia rozizolowanie mikroorganizmów znajdujących się w wystarczająco rozrzedzonych hodowlach.