Metody
izolacji
RNA
Metody
izolacji
RNA
Struktura RNA
RNA różni się od
DNA:
•
RNA jest (zazwyczaj)
jednoniciowe
•
W cząsteczce RNA cukrem
jest ryboza zamiast
deoksyrybozy
•
Jedna z pirymidyn w
cząsteczce RNA jest uracyl
(U) zamiast tyminy (T)
W komórkach prokariotycznych i eukariotycznych
występują trzy główne rodzaje RNA: mRNA, tRNA i
rRNA. Rybosomalny RNA stanowi 75%
komórkowego RNA i składa się z trzech frakcji o
stałych sedymantacji 25-28S, 18S, 5S i 5,8S
wystepujących w rybosomach eukariotycznych
oraz 23S, 16S i 5S w rybosomach
prokariotycznych . Cząsteczki tRNA są małe i
odpowiedzialne sa za dostarcznie odpowiedznich
aminokwasów do rybosomów podczas syntezy
białka.ok. Z kolei mRNA koduje białka i stanowi
ok. 1-5% całkowitego RNA komórki . Wszystkie
rodzaje RNA sa bezpośrednio zaangażowane w
proces realizacji informacji genetycznej.
Intensywne badania RNA zostały rozpoczęte
jeszcze przed „erą DNA”, a ich
pierwszym etapem była izolacja i
oczyszczanie.
Izolacja RNA jest znacznie trudniejsza niż DNA
W izolowaniu RNA krytyczne znaczenie ma kontrolowanie
aktywności rybonukleaz komórkowych (enzymy
degradujące RNA), które mogą doprowadzić do
degradacji preparatu. Można wyróżnić dwie główne drogi
postępowania mające na celu uniknięcie degradacji RNA
przez rybonukleazy uwolnione w czasie lizy komórek, tj.
1)wprowadzenie inhibitorów Rnaz
2) Zastosowanie metod, które powodują dezintegracje
komórki z jednoczesną inaktywacją Rnaz.
Należy także wystrzegać się wprowadzenia rybonukleaz
z zewnątrz, szczególnie zwracając uwagę na sprzęt
labolatoryjny.
Następujące uwagi mogą pomóc w uniknięciu
problemów z zanieczyszczeniem Rnazami:
1)
Jednorazowy sterylny sprzęt laboratoryjny wykonany z tworzyw
sztucznych jest zasadniczo wolny od Rnaz i może być stosowany
bezpośrednio do izolowania przechowywania RNA
2)
Sprzęt laboratoryjny wielokrotnego użytku wykonany ze szkła trzeba
inkubować w temp. 180st.C przez co najmniej 8godz., natomiast
sprzęt wykonany z tworzyw sztucznych, polietylenu i polipropylenu-
płukać chloroformem.
3)
Sprzęt laboratoryjny można również umieszczać w 0,1% roztworze
pirowęglanu dietylenu, który jest silnym inhibitorem Rnaz. Po tym
zabiegu należy przeprowadzić kilkakrotnie płukanie w sterylnej wodzie i
ogrzewanie w temp. 100st.C przez 5 min.
4)
Zbiorniki aparatów do elektroforezy, w których będzie przeprowadzana
analiza RNA, powinny być myte w roztworze detergentu, płukane w
wodzie, a następnie przemywane etanolem i wypełniane 3% roztworem
H2O2
5)
Dobrym zwyczajem jest wydzielenie sprzętu do pracy z RNA,
oznaczenie go i przechowywanie w odrębnym miejscu.
Wyróżnić można kilka metod izolacji RNA:
1- izolacja specyficznego RNA poprzez frakcjonowanie
całkowitego RNA komórki
2 -bezpośrednia izolacja specyficznego RNA,
ograniczona jest wyłącznie do tych komórek, które
syntetyzują określony RNA w zwiększonej ilości
3- izolacja poli(A)RNA
4- izolacja RNA z polirybosomów
5- izolacja całkowitego RNA komórki, a dopiero w
drugim etapie uzyskiwanie określonego RNA (cDNA)
metoda PCR
Głównym zadaniem przy opracowywaniu nowych
metod izolacji RNA stało się uproszczenie procedury
izolacji przy jednoczesnym maksymalnym
zabezpieczeniu RNA przed degradacją. Izolacja
niezdegradowanego RNA jest bardzo ważna,
ponieważ w dalszych etapach badań wymaga się
stosowania wyłącznie wysokocząsteczkowego
materiału.
Obecnie najczęściej stosowana jest izolacja
całkowitego RNA komórki, natomiast pozostałych
metod używa się rzadziej, szczególnie metody
izolacji RNA z polirybosomów.
Najczęściej stosowana jest metoda
wg. Chomczyńskiego i Sacchi
dr Piotr
Chomczyński
Izolowanie RNA z trzustki ( P. Chomczyński i N.
Sacchi)
ZASADA: Izotiocyjanian guanidyny należy do
substancji najefektywniej denaturujących białka. Jest
on także silnym inhibitorem rybonukleaz. Opisana
metoda opiera się na ekstrakcji izotiocyjaninem
guanidyny i mieszniną fenol/chloroform w środowisku
kwasowym. Wiązania dwusiarczkowe w białkach są
zrywane przez 2-merkaptoetanol.
Wydajność procedury wynosi ok. 1.8
mikrogramaRNA/mg. tkanki
Izolowanie RNA z krwi ( Y Zhang, J.J. Yunis)
ZASADA: Ekstrakcję w tej metodzie przeprowadza się
roztworem zawierającym izotiocyjanian guanidyny,
który powoduje dezintegrację komórek krwi oraz
hamuje działanie nukleaz, co pozwala na zachowanie
integralności RNA. Opisana procedura jest szybka i nie
wymaga stosowania drogich odczynników.
Wydajność procedury wynosi ok. 1-5 mikrograma
RNA /100 mikrolitrów krwi
Izolowanie mRNA ssaków ( J. Sambrook i wsp.)
ZASADA: Większość mRNA komórek ssaków, w
przeciwieństwie do tRNA i rRNA, zawiera na swym
końcu 3’ odcinek poliadenylowy, poly(A). Cząsteczki
mRNA można więc wydzielić z całkowitej puli RNA
przez chromatografie powinowactwa z użyciem
celulozy oligo(dT)
Izolowanie jądrowego kwasu rybonukleinowego
z wątroby szczura
ZASADA: Z wątroby szczura izoluje się jądra
komórkowe. Z zawiesiny jąder wytrąca się następnie
substancje towarzyszące przez wytrząsanie z
roztworem fenolu zawierającym 8-hydroksychinolinę.
Z fazy wodnej wytrąca się etanolem frakcje kwasów
nukleinowych, osad traktuje się dezoksyrybunukleazą
i z trawionej mieszaniny wytrąca się etanolem kwas
rybonukleinowy.
Izolowanie przenośnikowego kwasu
rybonukleinowego (tRNA) z Escherichia coli
ZASADA: Komórki E. coli myje się buforem TRIS i wytrąca z
ich zawiesiny substancje towarzyszące przez wytrząsanie z
wodnym roztworem fenolu. Z fazy wodnej wytrąca się frakcje
kwasów nukleinowych etanolem, rozpuszczając je następnie w
1M roztworze chlorku sodu. W celu usunięcia rybosomalnego
RNA roztwór wiruje się przez 30 min. Przy 15000 obrotach, z
supernatantu wytrąca się tRNA etanolem i rozpuszcza go w
0,5M roztworze Tris, pH 8,8. Aby usunąć związane aminokwasy
roztwór ten inkubuje się przez 45minut w temp. 37st. C. Po
dodaniu chlorku sodu do osiągnięcia stężenia 0,4M RNA
wytrąca się etanolem, rozpuszcza w 0,5M roztworze octanu
sodu o pH 7,0, frakcjonuje izopropanolem w celu usunięcia
kwasu dezoksyrybonukleinowego i wytrąca tRNA wysokim
stężeniem alkoholu. Po rozpuszczeniu w wodzie destylowanej,
dializie i liofilizacji tRNA przechowuje w postaci stałej.
Izolowanie rybosomalnego RNA z tkanki
zwierzęcej –wątroba szczura
ZASADA : Kwasy rybonukleinowe ekstrahuje się
mieszaniną fenol-m-krezol z supernatantu po
wirowaniu przy 6000g homogenatu wąrtoby szczura.
W wyciągu tym, w obecności naftaleno-15-
dwusulfonianu, można oddzielić rybosomalny kwas
rybonukleinowy od towarzyszącego informacyjnego
RNA. Preparat ten oznacza się wysokim stopniem
czystości.
PODSUMOWANIE
Literatura:
•
Słomski Ryszard- Analiza DNA teoria
i praktyka. Wydawnictwo UP w
Poznaniu 2008
•
Bradley J. „Genetyka medyczna”
•
Brown T.A. „Genomy”
Dziękuję za uwagę