TWORZENIE TRANSGENICZNEJ  KUKURYDZY 

O ZWIĘKSZONEJ  ZAWARTOŚCI 

PROWITAMINY A

Autorzy: Bartosz Zieliński i Patryk Konarski

Na podstawie: 

„Generation of transgenic maize with enhanced

provitamin A content”

Maneesha Aluru, Yang Xu, Rong Guo, Zhenguo Wang, Shanshan Li, Wendy White, Kan Wang and

Steve Rodermel

Kukurydza

Kukurydza zwyczajna: należy do gatunku roślin 
jednorocznych z rodziny wiechlinowatych. Należy do zbóż. 
Pochodzi z Meksyku. Praktycznie nie występuje w formie 
dzikiej. Największymi producentami są Stany Zjednoczone, 
Chiny i Brazylia.

Roślina lecznicza: surowiec zielarski: Znamię kukurydzy 
(stosuje się jako lek moczopędny oraz w pewnym stopniu 
przeciwzapalny i rozkurczowy w przypadku trudności w 
oddawaniu moczu. W zapaleniu miedniczek nerkowych i 
pęcherza oraz w obrzękach wywołanych niewydolnością 
krążenia i nerek. Stosuje się je również jako lek żółciopędny i 
pomocniczo w zapaleniu wątroby) i skrobia kukurydziana. 

Roślina uprawna: cechuje ją duża wydajność i wartość 
pokarmowa. W krajach słabo rozwiniętych jest podstawą 
wyżywienia, w krajach wysoko rozwiniętych - stosowana jest 
głównie jako pasza dla zwierząt gospodarskich. 

Sztuka kulinarna: nasiona mogą być spożywane po 
ugotowaniu lub uprażeniu). Stanowi istotny składnik kuchni 
meksykańskiej.  Wykorzystywana jest do produkcji mrożonek 
i konserw, a także kukurydzianych płatków i oleju 
kukurydzianego.

Prowitamina A

Prowitamina to związek chemiczny, który w wyniku reakcji chemicznej (np. 
enzymatycznej lub fotochemicznej) w organizmie ulega przekształceniu w witaminę.

Źródła prowitamin dla człowieka:

- dieta;
- mikroflora przewodu pokarmowego;
- substancje endogenne z czynnikiem zewnętrznym.

Głównym źródłem aktywnych form witaminy A w organizmie jest spożywana z 
pokarmem pochodzenia roślinnego prowitamina A (głównie β-karoten). Innym 
bogatym źródłem  witaminy A jest wątroba zwierząt. Dużo prowitaminy A zawierają 
m.in. pomidory i marchew, poza tym witamina A znajduje się w nabiale i jajach. W 
organizmie ludzkim enzymem odpowiedzialnym za przekształcenie β-karotenu w  
retinal jest dioksygenaza β-karotenowa.

O czym praca?

Niedobór witaminy A ma wpływ na ponad 250mln ludzi na świecie i jest 
jednym z najbardziej popularnych odżywczych niedoborów w krajach 
rozwiniętych, skutkując znacznymi stratami społeczno – ekonomicznymi. 

Karotenoidy prowitaminy A takie jak beta karoten pochodzą z roślin 
jadalnych i są głównym źródłem witaminy A dla większości ludzkiej 
populacji. Kilka lat intensywnych badań poskutkowały produkcją Golden 
Rise II, który zawierał dostatecznie wysoki poziom karotenoidów 
prowitaminy A by zwalczyć jej niedobór. 

W tej pracy koncentrujemy się na populacji transgenicznej kukurydzy ze 
wzbogaconą prowitaminą A w jej ziarnach. Nad ekspresją bakteryjnych 
genów crtB i crtI, pod kontrolą „promotora super gama - zein” do 
ekspresji specyficznego bielma, w wyniku czego następuje 34krotny 
wzrost karotenoidów z nagromadzeniem beta karotenu w bielmie 
kukurydzy. Ekspresja analizowanych genów sugeruje, że wzrastające 
nagromadzenie beta karotenu wynika z powodu wzrastającej regulacji 
endogennych likopenów . Te eksperymenty mają na celu 
zaprojektowanie sposobów stworzenia transgenicznej kukurydzy bogatej 
w prowitaminy A, co pomoże łagodzić niedobory.

Szlaki biosyntezy 
karotenoidów 
w kukurydzy

PSY – syntaza fitoenu
PDS – desaturaza fitoenu
ZDS –desaturaza  karotenu,
CRTISO – izomeraza 
karotenoidu,
beta LCY – beta cyklaza,
epsilon – LCY – epsilon cyklaza,
HYD – hydroksylaza karotenu,
CRTB – bakteryjny homolog 
PSY,
CRTI – bakteryjny homolog PDS 
i ZDS

Transformacja

Niedojrzale zarodki embriotyczne germplazmu Hi-II zostają 
przetransportowane z plazmidami w dwóch odmiennych 
kombinacjach używając standardowego protokołu dla 
transformacji biolistic.

Dwoma  różnymi kombinacjami plazmidów były 
pBAR184+pRB+pRI i pBAR184+pRBS+pRIS. Plazmid pBAR184 
niesie gen acetylotransferaze fosfinotrycynową bakterii 
Streptomyces hygroscopicus, pod kontrolą promotora 
ubikwintynowego.

Plazmid DNA został wprowadzony do niedojrzałych embrionów 
przez bombardowanie mikrocząsteczkowe. 

Transformanty były wybrane w oparciu o ich odporność na 
herbicyd Bailophos (produkowany przez bakterię Streptomyces 
hygroscopicus). 
Genomowe DNA zostało wyizolowane  z transformowanych 
kalusów. Integracja transgeniczna została potwierdzona dla 
wszystkich linii kalusowych odpornych na Bialophos przez PCR 
w użyciu primerów gen-specyficznych.

Regeneracja

Na każdą przeprowadzoną transformację 
przypada 20 zregenerowanych roślin. 
Zregenerowane rośliny T0  były 
skrzyżowane z germplazmem Hi-II aby 
wygenerować nasiona T1. 
Aby wygenerować nasiona T2, T3 i T4  
najintensywniej zabarwione 
pomarańczowożółte nasiona z linii 
transgenicznej T1, T2 i T3 zostały wybrane 
i posadzone. Dorosłe rośliny zostały 
zapylone.

Analiza składu karotenoidów 
na HPLC 

(wysokosprawna chromatografia cieczowa)

Karotenoidy zostały wyekstrahowane z wysuszonych 
ziaren 40 dni po wysianiu. Używając modyfikacji 
metody Granado.  1 Gram startych ziaren inkubowano z 
6ml metanolu zawierającego 0,1 butylowanego 
hydroksytoluenu mieszając 15 min w 50 stopniach 
Celsjusza. Po ochłodzeniu równa objętość 
tetrahydrofuranu została dodana i karotenoidy zostały 
wyekstrachowane poprzez mieszanie. 0,5 ml odważki 
metanolu z ekstraktem THF zostały saponifikowane 
poprzez dodanie 1ml 40% zasady potasowej w 
metanolu zawierającym 0,1M pyrogallolu, następnie 
zmieszano. KOH został usunięty poprzez wymywanie 
2ml wody. Po dodaniu b-apo-8’-karotenalu karotenoidy 
zostały rozdzielone w 5ml chlorku heksanu badz 
metylenu. Faza górna została osuszona pod wyciągiem. 
Wysuszony ekstrakt został zrekonstruowany w 100 ul 
eteru metylo-tetra-butylowego (MTBE) z 300ul 
metanolu. 100ul roztworu zostało wprowadzone do 
systemu HPLC w 5 stopniach Celsjusza.

Określenie kopii transgenu

Genomowe DNA zostało 
wyizolowane z zamarzniętych 
liści T2 i T4. Genomowe DNA z 
gerplazmów kukurydzy B73 oraz 
Hi-II zostało wykorzystane jako 
próby negatywne. 
Około 10 ug genomowego DNA 
zostało strawione XhoI by określić 
liczbę kopii transgenu (ów). 
Strawione fragmenty DNA zostały 
poddane rozkładowi 
elektroforetycznemu.

Ekstrakcja RNA i analiza RT – PCR

Komórkowe RNA zostało wyizolowane z nasion rozwijającej się 
transgenicznej kukurydzy T4. 
Następnie potraktowano je DNAzą wolną od RNAzy by usunąć 
skażenie genomowym DNA, po czym oceniono jakość RNA 
poprzez elektroforezę. 
Następnie wykonano reakcję PCR używając primerów 
genspecyficznych. Reakcje zostały przeprowadzone w użyciu 
około 1ug całego RNA, 10 uM każdego primeru, 200uM dNTP 
oraz dwóch jednostek polimerazy Taq. 
Po początkowej denaturacji trwającej 2 minuty, cykl PCR 
został powtórzony 31 razy, zawierając 1 minutę denaturacji w 
94 stopniach Celsjusza, następnie 1 minutę wyżarzania i 
ostatecznie minutę wydłużania w 72 stopniach Celsjusza. Cały 
eksperyment RT-PCR został powtórzony dwukrotnie z różnymi 
ekstraktami RNA.

Rezultat

By ocenić efekty nadekspresji crtB oraz crtI na 
akumulację karotenoidów w kukurydzy Hi-II, zostały 
stworzone cztery odmienne konstrukty plazmidowe: pRB, 
pRI, pRBS i pRIS.

Plazmidy pRB oraz pRI 
zawierają bakteryjne 
geny crtB i crtI 
przyłączone do peptydu 
sygnałowego 
wyekstrachowanego z 
groszku. Peptyd ten 
umożliwia namierzanie 
plastydu; jest usuwany z 
prekursora w trakcie lub 
chwilę po wprowadzeniu 
do organellum. 
Sekwencje kodujące 
zostały umieszczone pod 
kontrolą endospermo-
specyficznego gamma – 
zein promotora.

Pzein – gamma – zein promotor
Spzein – super gamma – zein promotor

Rezultat

By ocenić efekty nadekspresji crtB oraz crtI na 
akumulację karotenoidów w kukurydzy Hi-II, zostały 
stworzone cztery odmienne konstrukty plazmidowe: pRB, 
pRI, pRBS i pRIS.

Pzein – gamma – zein promotor
Spzein – super gamma – zein promotor

Plazmidy pRBS i pRIS 
zawierają super gamma – 
zein promotor, który 
uzyskany jest przez 
duplikacje gamma – zein 
promotora. Powielenie to 
powoduje zwiększoną 
aktywność promotora.

Podsumowanie

Wiele różnych metod zostało podjętych w celu zwiększenia 
zawartości prowitaminy A w roślinach uprawnych, takich jak 
pomidory, ziemniaki i ryż. Działo się to poprzez manipulowanie 
różnych genów ze szlaku karotenoidów. Jednakże, "Golden Rice 2 
" jest jedynym, jednoliściennym, w którym wykazano, że 
gromadzą się znaczne ilości prowitaminy w celu spełnienia 
wymogów dziennego spożycia by pokonać VAD (niedobór 
witaminy A). 

Na podstawie badań, zmiany crtI, wydają się być obiecującym 
kolejnym krokiem w celu zwiększenia prowitaminy A zawartej w 
kukurydzy. Podsumowując, obecne wyniki stanowią ważny 
pierwszy krok w tworzeniu wysokiej zawartości prowitamin A w 
kukurydzy w celu zwalczania VAD w rozwoju krajów. W 
połączeniu z klasyczną hodowlą, transgeniczne podejście 
powinno być potężnym narzędziem do walki z VAD.

Dziękujemy za uwagę!