TWORZENIE TRANSGENICZNEJ KUKURYDZY

O ZWIĘKSZONEJ ZAWARTOŚCI

PROWITAMINY A

Autorzy: Bartosz Zieliński i Patryk Konarski

Na podstawie:

„Generation of transgenic maize with enhanced

provitamin A content”

Maneesha Aluru, Yang Xu, Rong Guo, Zhenguo Wang, Shanshan Li, Wendy White, Kan Wang and

Steve Rodermel

Kukurydza

Kukurydza zwyczajna: należy do gatunku roślin
jednorocznych z rodziny wiechlinowatych. Należy do zbóż.
Pochodzi z Meksyku. Praktycznie nie występuje w formie
dzikiej. Największymi producentami są Stany Zjednoczone,
Chiny i Brazylia.

Roślina lecznicza: surowiec zielarski: Znamię kukurydzy
(stosuje się jako lek moczopędny oraz w pewnym stopniu
przeciwzapalny i rozkurczowy w przypadku trudności w
oddawaniu moczu. W zapaleniu miedniczek nerkowych i
pęcherza oraz w obrzękach wywołanych niewydolnością
krążenia i nerek. Stosuje się je również jako lek żółciopędny i
pomocniczo w zapaleniu wątroby) i skrobia kukurydziana.

Roślina uprawna: cechuje ją duża wydajność i wartość
pokarmowa. W krajach słabo rozwiniętych jest podstawą
wyżywienia, w krajach wysoko rozwiniętych - stosowana jest
głównie jako pasza dla zwierząt gospodarskich.

Sztuka kulinarna: nasiona mogą być spożywane po
ugotowaniu lub uprażeniu). Stanowi istotny składnik kuchni
meksykańskiej. Wykorzystywana jest do produkcji mrożonek
i konserw, a także kukurydzianych płatków i oleju
kukurydzianego.

Prowitamina A

Prowitamina to związek chemiczny, który w wyniku reakcji chemicznej (np.
enzymatycznej lub fotochemicznej) w organizmie ulega przekształceniu w witaminę.

Źródła prowitamin dla człowieka:

- dieta;
- mikroflora przewodu pokarmowego;
- substancje endogenne z czynnikiem zewnętrznym.

Głównym źródłem aktywnych form witaminy A w organizmie jest spożywana z
pokarmem pochodzenia roślinnego prowitamina A (głównie β-karoten). Innym
bogatym źródłem witaminy A jest wątroba zwierząt. Dużo prowitaminy A zawierają
m.in. pomidory i marchew, poza tym witamina A znajduje się w nabiale i jajach. W
organizmie ludzkim enzymem odpowiedzialnym za przekształcenie β-karotenu w
retinal jest dioksygenaza β-karotenowa.

O czym praca?

Niedobór witaminy A ma wpływ na ponad 250mln ludzi na świecie i jest
jednym z najbardziej popularnych odżywczych niedoborów w krajach
rozwiniętych, skutkując znacznymi stratami społeczno – ekonomicznymi.

Karotenoidy prowitaminy A takie jak beta karoten pochodzą z roślin
jadalnych i są głównym źródłem witaminy A dla większości ludzkiej
populacji. Kilka lat intensywnych badań poskutkowały produkcją Golden
Rise II, który zawierał dostatecznie wysoki poziom karotenoidów
prowitaminy A by zwalczyć jej niedobór.

W tej pracy koncentrujemy się na populacji transgenicznej kukurydzy ze
wzbogaconą prowitaminą A w jej ziarnach. Nad ekspresją bakteryjnych
genów crtB i crtI, pod kontrolą „promotora super gama - zein” do
ekspresji specyficznego bielma, w wyniku czego następuje 34krotny
wzrost karotenoidów z nagromadzeniem beta karotenu w bielmie
kukurydzy. Ekspresja analizowanych genów sugeruje, że wzrastające
nagromadzenie beta karotenu wynika z powodu wzrastającej regulacji
endogennych likopenów . Te eksperymenty mają na celu
zaprojektowanie sposobów stworzenia transgenicznej kukurydzy bogatej
w prowitaminy A, co pomoże łagodzić niedobory.

Szlaki biosyntezy
karotenoidów
w kukurydzy

PSY – syntaza fitoenu
PDS – desaturaza fitoenu
ZDS –desaturaza karotenu,
CRTISO – izomeraza
karotenoidu,
beta LCY – beta cyklaza,
epsilon – LCY – epsilon cyklaza,
HYD – hydroksylaza karotenu,
CRTB – bakteryjny homolog
PSY,
CRTI – bakteryjny homolog PDS
i ZDS

Transformacja

Niedojrzale zarodki embriotyczne germplazmu Hi-II zostają
przetransportowane z plazmidami w dwóch odmiennych
kombinacjach używając standardowego protokołu dla
transformacji biolistic.

Dwoma różnymi kombinacjami plazmidów były
pBAR184+pRB+pRI i pBAR184+pRBS+pRIS. Plazmid pBAR184
niesie gen acetylotransferaze fosfinotrycynową bakterii
Streptomyces hygroscopicus, pod kontrolą promotora
ubikwintynowego.

Plazmid DNA został wprowadzony do niedojrzałych embrionów
przez bombardowanie mikrocząsteczkowe.

Transformanty były wybrane w oparciu o ich odporność na
herbicyd Bailophos (produkowany przez bakterię Streptomyces
hygroscopicus).
Genomowe DNA zostało wyizolowane z transformowanych
kalusów. Integracja transgeniczna została potwierdzona dla
wszystkich linii kalusowych odpornych na Bialophos przez PCR
w użyciu primerów gen-specyficznych.

Regeneracja

Na każdą przeprowadzoną transformację
przypada 20 zregenerowanych roślin.
Zregenerowane rośliny T0 były
skrzyżowane z germplazmem Hi-II aby
wygenerować nasiona T1.
Aby wygenerować nasiona T2, T3 i T4
najintensywniej zabarwione
pomarańczowożółte nasiona z linii
transgenicznej T1, T2 i T3 zostały wybrane
i posadzone. Dorosłe rośliny zostały
zapylone.

Analiza składu karotenoidów
na HPLC

(wysokosprawna chromatografia cieczowa)

Karotenoidy zostały wyekstrahowane z wysuszonych
ziaren 40 dni po wysianiu. Używając modyfikacji
metody Granado. 1 Gram startych ziaren inkubowano z
6ml metanolu zawierającego 0,1 butylowanego
hydroksytoluenu mieszając 15 min w 50 stopniach
Celsjusza. Po ochłodzeniu równa objętość
tetrahydrofuranu została dodana i karotenoidy zostały
wyekstrachowane poprzez mieszanie. 0,5 ml odważki
metanolu z ekstraktem THF zostały saponifikowane
poprzez dodanie 1ml 40% zasady potasowej w
metanolu zawierającym 0,1M pyrogallolu, następnie
zmieszano. KOH został usunięty poprzez wymywanie
2ml wody. Po dodaniu b-apo-8’-karotenalu karotenoidy
zostały rozdzielone w 5ml chlorku heksanu badz
metylenu. Faza górna została osuszona pod wyciągiem.
Wysuszony ekstrakt został zrekonstruowany w 100 ul
eteru metylo-tetra-butylowego (MTBE) z 300ul
metanolu. 100ul roztworu zostało wprowadzone do
systemu HPLC w 5 stopniach Celsjusza.

Określenie kopii transgenu

Genomowe DNA zostało
wyizolowane z zamarzniętych
liści T2 i T4. Genomowe DNA z
gerplazmów kukurydzy B73 oraz
Hi-II zostało wykorzystane jako
próby negatywne.
Około 10 ug genomowego DNA
zostało strawione XhoI by określić
liczbę kopii transgenu (ów).
Strawione fragmenty DNA zostały
poddane rozkładowi
elektroforetycznemu.

Ekstrakcja RNA i analiza RT – PCR

Komórkowe RNA zostało wyizolowane z nasion rozwijającej się
transgenicznej kukurydzy T4.
Następnie potraktowano je DNAzą wolną od RNAzy by usunąć
skażenie genomowym DNA, po czym oceniono jakość RNA
poprzez elektroforezę.
Następnie wykonano reakcję PCR używając primerów
genspecyficznych. Reakcje zostały przeprowadzone w użyciu
około 1ug całego RNA, 10 uM każdego primeru, 200uM dNTP
oraz dwóch jednostek polimerazy Taq.
Po początkowej denaturacji trwającej 2 minuty, cykl PCR
został powtórzony 31 razy, zawierając 1 minutę denaturacji w
94 stopniach Celsjusza, następnie 1 minutę wyżarzania i
ostatecznie minutę wydłużania w 72 stopniach Celsjusza. Cały
eksperyment RT-PCR został powtórzony dwukrotnie z różnymi
ekstraktami RNA.

Rezultat

By ocenić efekty nadekspresji crtB oraz crtI na
akumulację karotenoidów w kukurydzy Hi-II, zostały
stworzone cztery odmienne konstrukty plazmidowe: pRB,
pRI, pRBS i pRIS.

Plazmidy pRB oraz pRI
zawierają bakteryjne
geny crtB i crtI
przyłączone do peptydu
sygnałowego
wyekstrachowanego z
groszku. Peptyd ten
umożliwia namierzanie
plastydu; jest usuwany z
prekursora w trakcie lub
chwilę po wprowadzeniu
do organellum.
Sekwencje kodujące
zostały umieszczone pod
kontrolą endospermo-
specyficznego gamma –
zein promotora.

Pzein – gamma – zein promotor
Spzein – super gamma – zein promotor

Rezultat

By ocenić efekty nadekspresji crtB oraz crtI na
akumulację karotenoidów w kukurydzy Hi-II, zostały
stworzone cztery odmienne konstrukty plazmidowe: pRB,
pRI, pRBS i pRIS.

Pzein – gamma – zein promotor
Spzein – super gamma – zein promotor

Plazmidy pRBS i pRIS
zawierają super gamma –
zein promotor, który
uzyskany jest przez
duplikacje gamma – zein
promotora. Powielenie to
powoduje zwiększoną
aktywność promotora.

Podsumowanie

Wiele różnych metod zostało podjętych w celu zwiększenia
zawartości prowitaminy A w roślinach uprawnych, takich jak
pomidory, ziemniaki i ryż. Działo się to poprzez manipulowanie
różnych genów ze szlaku karotenoidów. Jednakże, "Golden Rice 2
" jest jedynym, jednoliściennym, w którym wykazano, że
gromadzą się znaczne ilości prowitaminy w celu spełnienia
wymogów dziennego spożycia by pokonać VAD (niedobór
witaminy A).

Na podstawie badań, zmiany crtI, wydają się być obiecującym
kolejnym krokiem w celu zwiększenia prowitaminy A zawartej w
kukurydzy. Podsumowując, obecne wyniki stanowią ważny
pierwszy krok w tworzeniu wysokiej zawartości prowitamin A w
kukurydzy w celu zwalczania VAD w rozwoju krajów. W
połączeniu z klasyczną hodowlą, transgeniczne podejście
powinno być potężnym narzędziem do walki z VAD.

Dziękujemy za uwagę!