Pytania zamknięte wielokrotnego wyboru
na podstawie wykładów
Wykład szósty - Wprowadzanie do komórki zrekombinowanego DNA
Przygotowanie DNA (wstawki) do klonowania polega na:
trawienie wybraną nukleazą nierestrykcyjną
trawienie wybranym enzymem restrykcyjnym
przeprowadzeniu elektroforezy sprawdzającej jakość trawienia
przeprowadzeniu sekwencjonowania sprawdzającego jakość trawienia
Przygotowanie wektora plazmidowego do klonowania polega na:
trawienie wybraną nukleazą nierestrykcyjną
trawienie wybranym enzymem restrykcyjnym
przeprowadzeniu elektroforezy sprawdzającej jakość trawienia
przeprowadzeniu sekwencjonowania sprawdzającego jakość trawienia
W mieszaninie ligacyjnej wstawka (insert) powinna:
stanowić molowy nadmiar względem ilości cząsteczek wektora
stanowić molowy niedomiar względem ilości cząsteczek wektora
równoważyć molowo ilość cząsteczek wektora
być dodana w stosunku 3:1 względem ilości cząsteczek wektora
Można wprowadzić zrekombinowany wektor do bakterii na drodze:
transformacji
replikacji
elektrotransformacji
koniugacji
Stan kompetencji:
determinuje zdolność do transformacji
jest uwarunkowany genetycznie
może być sztucznie generowany
nie ma wpływu na transformację
Wydajność transformacji metodą chemiczną zależy od:
ilości DNA
wielkości cząsteczki plazmidu
konformacji DNA
czystości DNA
Elektorporacja polega na:
przepuszczeniu przez zawiesinę komórek długiego (1-5 sek) pulsu prądu o bardzo wysokim napięciu (1250-2500 V)
przepuszczeniu przez zawiesinę komórek długiego (1-5 sek) pulsu prądu o bardzo wysokim natężeniu (1250-2500 A)
przepuszczeniu przez zawiesinę komórek krótkiego (5-10 msek) pulsu prądu o bardzo wysokim napięciu (1250-2500 V)
przepuszczeniu przez zawiesinę komórek krótkiego (5-10 msek) pulsu prądu o bardzo wysokim natężeniu (1250-2500 A)
Zaletami elektroporacji są:
wysoka przeżywalność komórek
wysoka wydajność transformacji
możliwość wprowadzania dużych cząsteczek DNA
możliwość sadystycznego spełnienia naukowca na biednych bakteriach
Wykład siódmy - Hybrydyzacja
Sonda molekularna to:
specyficzny, odpowiednio przygotowany fragment DNA lub RNA posiadający znacznik
niespecyficzny fragment DNA lub RNA posiadający znacznik
specyficzny, odpowiednio przygotowany fragment DNA lub RNA nieposiadający znacznika
niespecyficzny, odpowiednio przygotowany fragment DNA lub RNA nie posiadający znacznika
Sondę molekularną można znakować za pomocą:
błękitu metylenowego
radioizotopów
fluorochromów
przeciwciał
Do wyznakowania końców cząsteczek kwasów nukleinowych używa się:
fragmentu Klenowa polimerazy I
terminalnej transferazy
kinazy polinukleotydowej
fosfatazy alkalicznej
Podaj właściwą kolejność przygotowania targetu DNA do szukania komplementarnych odcinków:
1. Izolacja genomowego DNA → 2. Rozdział w żelu agarozowym → 3. Transfer na specjalną membranę (stały nośnik)→ 4. Podział na mniejsze fragmenty np. przez trawienie
1. Izolacja genomowego DNA → 2. Podział na mniejsze fragmenty np. przez trawienie → 3. Rozdział w żelu agarozowym → 4. Transfer na specjalną membranę (stały nośnik)
1. Izolacja genomowego DNA → 2. Podział na mniejsze fragmenty np. przez trawienie → 3. Transfer na specjalną membranę (stały nośnik) → 4. Rozdział w żelu agarozowym
1. Izolacja genomowego DNA → 2. Transfer na specjalną membranę (stały nośnik) → 3. Podział na mniejsze fragmenty np. przez trawienie → 4. Rozdział w żelu agarozowym
W metodzie Southern blotting:
kwas nukleinowy musi być zdenaturowany, ale sonda molekularna nie musi być zdenaturowana
kwas nukleinowy nie musi być zdenaturowany, ale sonda molekularna musi być zdenaturowana
ani kwas nukleinowy, ani sonda molekularna nie muszą być zdenaturowane
kwas nukleinowy i sonda molekularna muszą być zdenaturowane
Metodę Southern blotting wykorzystujemy w celu:
wykryciu określonego fragmentu DNA, który ma sekwencję komplementarną do sekwencji sondy molekularnej (identyczną)
wykryciu określonego fragmentu DNA, który ma sekwencję komplementarną do sekwencji sondy molekularnej (nieidentyczną)
wykryciu określonego fragmentu DNA, który ma sekwencję taką samą jak sonda molekularna (identyczną)
wykryciu określonego fragmentu DNA, który ma sekwencję taką samą jak sonda molekularna (nieidentyczną)
W metodzie Southern blotting najczęściej stosuje się membranę:
agarozową
nitrocelulozową
poliakrylamidową
nylonową
Tworzenie hybryd pomiędzy ssDNA jest odwracalne i zależy od:
stężenia kwasów nukleinowych
siły jonowej
temperatury
czas trwania hybrydyzacji
Maksymalną wydajność hybrydyzacji osiąga się:
w temperaturze 2-5C niższej od Tm (temperatura topnienia)
w temperaturze 20-25C niższej od Tm
w temperaturze 20-25C wyższej od Tm
w temperaturze równej Tm
Wykład ósmy - PCR
Reakcja PCR:
to reakcja replikacji DNA w probówce
umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA
jest szeregiem powtarzanych cykli
oczyszcza DNA
Denaturację DNA w reakcji PCR przeprowadza się w temperaturze:
72C
94-96C
100C
55C
Dołączenie primerów do miejsca komplementarnego matrycy w reakcji PCR przeprowadza się w temperaturze:
50-65C
92-96C
100C
pokojowej
Wydłużanie primera od końca 3'-OH przez polimerazę DNA w reakcji PCR zachodzi najefektywniej w temperaturze:
68-75C
50-65C
37C
100C
Nowo syntetyzowane nici pierwszorzędowych produktów reakcji PCR:
nie mają określonej długości
mają określoną długość
połowa nie ma ściśle określonej długości
są bardzo krótkie o różnej długości
Właściwe i zamierzone fragmenty DNA w reakcji PCR powstają po raz pierwszy w cyklu:
1
2
3
4
Przyjmuje się, że do syntezy fragmentów o wielkości 1 kpz wymagany czas elongacji wynosi:
30 s
1 min
2 min
5 min
Teoretyczna wydajność reakcji po “n” cyklach wynosi:
2n specyficznych cząsteczek DNA
n^2 specyficznych cząsteczek DNA
2^n specyficznych cząsteczek DNA
2n^2 specyficznych cząsteczek DNA
Startery używane do reakcji PCR:
mogą zawierać zmodyfikowane nukleotydy
powinny być wysoko specyficzne dla danej sekwencji
nie powinny tworzyć struktur typu szpilki do włosów
nie powinny zawierać około 50% par GC
Bufor reakcyjny do reakcji PCR:
jest specyficzny dla danej polimerazy
zawiera jony dwuwartościowe, co umożliwia działanie polimerazy
zawiera jony jednowartościowe, co poprawia amplifikację fragmentów DNA
stabilizuje pH mieszaniny reakcyjnej
Stężenie poszczedólnych dNTP w mieszaninie reakcyjnej zwykle wynosi:
100-150 uM
150-200 uM
200-250 uM
250-300 uM
Termostabilna polimeraza, która posiada aktywność sprawdzającą to:
Taq
Pfu
Deep Vent
Scm
Ilość matrycy potrzebnej do wydajnej amplifikacji:
musi być większa od ilości starterów
zależy od jej złożoności
nie zależy od jej złożoności
jest stała
W reakcji Hot Start-PCR głównym czynnikiem warunkującym specyficzność reakcji jest:
ilość jonów Mg2+
skład buforu reakcyjnego
niskie stężenie dNTP
temperatura
Zastosowania PCR to:
diagnostyka chorób
znakowanie fragmentów DNA
wypas trzody chlewnej na alpejskich łąkach
cykliczne sekwencjonowanie
Wykład dziewiąty - Genomika
Genomika to:
nauka obejmująca badania genomu na różnych jego poziomach
technika badawcza umożliwiająca konstruowanie genomów
nauka o technikach badawczych pozwalających na określeniu charaterystyki genów
to samo, co analityka genomowa
Genomika funkcjonalna to:
transkryptomika
badanie, którego celem jest uzyskanie mapy fizycznej genomu
proteomika
odpowiedzi A i C są prawidłowe
Badanie profili transkrypcyjnych organizmu jest:
bardziej skomplikowane niż badanie genomu
mniej skomplikowane niż badanie genomu
bardziej skomplikowane niż badanie proteomu
mniej skomplikowane niż badanie proteomu
Proteom jest jeszcze bardziej skomplikowany niż transkryptom, ponieważ:
cząsteczki białek, już po syntezie, ulegają różnorodnym modyfikacjom, które w zasadniczy sposób zmieniają właściwości białka
to białka, a nie cząsteczki kwasów nukleinowych budują nasz organizm
skomplikowany wzór modyfikacji nie jest bezpośrednio zakodowany w genie odpowiadającym danemu białku
modyfikacje są główną przyczyną tego, że liczba różnych rodzajów białek w organizmie wielokrotnie przewyższa liczbę genów zawartych w jego genomie
Wielkość genomu i zakres jego zmienności:
nie odzwierciedla w pełni złożoności organizmu
odzwierciedla w pełni złożoność organizmu
nic nie mówi nam złożoności organizmu
jest cechą skorelowaną ze złożonością organizmu
Genomy eukariotyczne w przeciwieństwie do prokariotycznych:
posiadają koliste chromosomy (w przeciwieństwie do chromosomów liniowych)
posiadają centromer
wykazują dużą gęstość genów przerzedzonych nielicznymi intronami
nie posiadają powtarzających się sekwencji
Wykład dziesiąty - Mapowanie genomów
Celem genomiki strukturalnej jest:
określenie działania komórki na poziomie ekspresji genów
stworzenie podstaw do budowy genów
stworzenie jak najdokładniejszej mapy fizycznej genomu
analiza bioinformatyczna genomu
Strategia hierarchiczna polega na:
podzieleniu genomu na mniejsze fragmenty, a następnie ułożenie ich (kontigów) w odpowiednim porządku
podzieleniu genomu na mniejsze fragmenty, które sklonowane zostaną do wektorów i stworzą bibliotekę genową, a następnie ułożenie tych wektorów (kontigów) w odpowiednim porządku
podzieleniu genomu na mniejsze fragmenty, które sklonowane zostaną do wektorów, a ich ułożenie w odpowiednim porządku utworzy bibliotekę genową
podzieleniu genomu na kilka dużych fragmentów, które sklonowane zostają jako wektorów i tworzą bibliotekę genową
Biblioetki genomowe to:
uporządkowany zbiór klonów pokrywający cały genom
uporządkowany zbiór klonów pokrywający tylko geny (bez intronów)
uporządkowany zbiór klonów pokrywający tylko introny (bez genów)
nieuporządkowany zbiór klonów pokrywający cały genom
Ilość klonów w bibliotece genomowej zależy od:
wielkości genomu
wielkości pojedynczego kontigu
wielkości wektora
stężenia enzymu do klonowania
Zaletami biblioteki fagowej:
łatwość przechowywania - długi okres przetrwania fagów
możliwość tworzenia wstawki o dużej długości – maksymalnie nawet do 800 kpz
dobry screening - mniejsze tło hybrydyzacji łysinkowej niż kolonijnej
dobra reprezentatywność sekwencji genomowych - w bibliotece jest większość sekwencji genomu, z którego ją otrzymano
Wektor P1:
zawiera miejsce pac (odpowiednik cos faga lambda), które jest niezbędne do upakowania in vitro zrekombinowanych cząsteczek DNA w główki faga
zawiera miejsce loxP, rozpoznawane przez fagową rekombinazę cre
zawiera polilinker
zawiera gen oporności na kanamycynę
Najmniej stabilny z wymienionych jest system bibliotek genomowych oparty o:
PAC
BAC
YAC
P1
Mapowanie restrykcyjne:
polega na „spacerach po chromosomie”
polega na trawieniu poszczególnych klonów biblioteki DNA enzymem (najczęściej czwórowym) i porównywanie wzorów trawienia
polega na trawieniu poszczególnych klonów biblioteki DNA enzymem (najczęściej ósemkowym) i porównywanie wzorów trawienia
polega na trawieniu poszczególnych klonów biblioteki DNA enzymem (najczęściej szóstkowym) i porównywanie wzorów trawienia
Etykietka typu SDS:
powinna być unikalna w całym genomie
powinna stanowić ok. 10% genomu
powinna być możliwa do powielenia w reakcji PCR
powinna być wyznakowana (fluorochromem, radioizotopem, itp.)
Etykietki typu EST:
wykazują bezpośredni związek z genami ulegającymi ekspresji w genomie, ponieważ pochodzą z mRNA
mają takie same zalety jak etykietki SDS
muszą być krótkie, żeby mieć pewność, że nie są odseparowane intronem
stosowane są przede wszystkim w analizie genomów prokariotycznych
Strategia przypadkowej fragmentacji genomu „shotgun”:
łatwo radzi sobie z problemem sekwencji powtórzonych
polega na obligatoryjnym klonowaniu w wektory (np. pUC)
nie wymaga tworzenia bibliotek i kontigów klonów
szybko uzyskujemy prawie pełną sekwencję genomu
Fragmenty DNA po sonifikacji w „shotgun” są wielkości:
0,3-1,5 kpz
1,6-2 kpz
5-8,2 kpz
10-12 kpz
Rozdział dwunasty - Sekwencjonowanie
W metodzie chemicznej degradacji cząsteczki:
DNA zakończone określonym nukleotydem otrzymuje się przez działanie odczynnikami tnącymi nić DNA specyficznie w miejscu określonego nukloetydu
DNA zakończone określonym nukleotydem otrzymuje się przez działanie odczynnikami tnącymi nić DNA losowo
uzyskuje się pulę cząsteczek, wyznakownych na końcu 5’ a różniących się długością na końcu 3’
uzyskuje się pulę cząsteczek, wyznakownych na końcu 3’ a różniących się długością na końcu 5’
W celu usunięcia zmetylowanego pierścienia guanozynowego stosuje się:
siarczan dimetylu
piperydynę
piperynę
hydrazynę
Kluczowym etapem metody Sangera jest:
przyłączanie polimerazy do syntetyzowanej nici DNA
wbudowanie 3'-ddNTP
wbudowanie dNTP
odcięcie grupy hydroksylowej w miejscu 3' nukleotydu
Polimeraza używana w sekwencjonowaniu Sangera musi cechować się:
wysoką procesywnością
wysoką termostabilnością
brakiem aktywności egzonukleazy 5’-3’
brakiem aktywności egzonukleazy 3’-5’
Sekwencjonowanie cykliczne:
inaczej zwana jest pirosekwencjonowaniem
należy do metod NGS (ang. next generation sequencing)
opiera się na użyciu ddNTP
wykorzystuje fragment Klenowa polimerazy I
W cyklicznym sekwencjonowaniu jedna matryca umożliwia nam:
1 reakcję
2 reakcje
3 reakcje
4 reakcje
Obecnie cykliczne sekwencjonowanie można przeprowadzić w jednej probówce. Jest to możliwe dzięki zastosowaniu znakowania:
immunoenzymatycznego
fluorescencyjnego
izotopowego
enzymatycznego
Metody NGS:
wykorzystują ddNTP
cechują się ogromną przepustowością
wykorzystują zjawisko chemiluminescencji
są zależne od temperatury
Wykład trzynasty - Transkryptomika
Analiza bioinformatyczna:
pozwala pokazać różnice w poziomie i czasie ekspresji genów
jest pierwszym etapem po uzyskaniu kompletnej sekwencji nukleotydowej genomu
musi być potwierdzona eksperymentalnie
nie musi być potwierdzona eksperymentalnie
Metodą ustalenia czy dany fragment zawiera sekwencję ulegającą ekspresji jest:
Real Time-PCR
RT-PCR
hybrydyzacja typu Northern
hybrydyzacja typu Southern
Analiza trankryptomu komórki:
mówi nam, że w konkretnym regionie znajduje się gen (a nie np. pseudogen)
umożliwia lokalizację granicy intron-ekson w przypadku genów nieciągłych
pozwala na identyfikację sekwencji regulatorowych i przypisanie im funkcji
pozwala pokazać różnice w poziomie i czasie ekspresji genów
W hybrydyzacji typu Northern:
informację na temat ekspresji genu otrzymuje się na podstawie hybdrydyzacji RNA:DNA
informację na temat ekspresji genu otrzymuje się na podstawie hybdrydyzacji DNA:DNA
informację na temat ekspresji genu otrzymuje się na podstawie hybdrydyzacji RNA:RNA
informację na temat ekspresji genu otrzymuje się na podstawie hybdrydyzacji DNA:białko
Gen reporterowy:
jest wykorzystywany jako sonda molekularna
jest genem poprzedzającym intron
jego ekspresję można łatwo zaobserwować
jego ekspresji nie można zaobserwować
Po fuzji transkrypcyjnej gen reporterowy będzie:
miał wzór ekspresji taki jak promotor genu badanego
wyglądał jak słoń
miał wzór ekspresji inny niż gen badany
miał wzór ekspresji taki sam jak gen badany
Do detekcji genu reporterowego wykorzystuje się:
test fluorescencyjny
test histochemiczny
test cytologiczny
test enzymatyczny
Macierz DNA wykorzystywana jest do globalnej analizy transkryptomu. Stanowią ją ułożone na stałym podłożu cząsteczki DNA reprezentujące:
wybrany materiał genetyczny
cały genom
kodujące odcinki genomu, czyli geny
antygeny białkowe
Czym różni się sonda od targetu?
Sonda to kwas nukleinowy o znanej sekwencji, unieruchomiony na nośniku, zaś target to kwas nukleinowy, zwykle wyznakowany, unieruchomiony na nośniku, który poddajemy badaniu
Sonda to wolny kwas nukleinowy o znanej sekwencji, zaś target to wolny kwas nukleinowy, zwykle wyznakowany, który poddajemy badaniu
Sonda to kwas nukleinowy o znanej sekwencji, unieruchomiony na nośniku, zaś target to wolny kwas nukleinowy, zwykle niewyznakowany, który poddajemy badaniu
Sonda to wolny kwas nukleinowy o znanej sekwencji, zaś target to wolny kwas nukleinowy, zwykle wyznakowany i unieruchomiony na nośniku, który poddajemy badaniu
Mikromacierze DNA różnią się od siebie:
pojemnością
gęstością sond
zastosowaniem
rodzajem sondy
Mikromacierz oligonukleotydową cechuje się:
dużą specyficznością wiązania i wykrywania „targetu”
małą specyficznością wiązania i wykrywania „targetu”
sondami w postaci długich odcinków DNA
sondami w postaci bardzo krótkich odcinków DNA
Podstawowe zastosowanie macierzy cDNA to:
karmienie szatana
porównywanie poziomu ekspresji genów pomiędzy różnymi próbkami
oznaczenie ilości mRNA genów w pojedynczej próbce
oznaczenie ilości mRNA genów w kilkunastu próbkach
Technologię macierzy stosuje się do:
karmienia szatana, bo on chce więcej
wykrywania rearanżacji w genomach
badania profili ekspresji genów
wykrywanie mutacji
Rozdział czternasty - Badanie funkcji genu
„Knock-out” genowy:
to proces celowej rekombinacji genu polegającej na wprowadzeniu do komórki wektora wirusowego
to proces celowej rekombinacji genu polegającej na wymianie genu z DNA chromosomowego na transgen wprowadzany w wektorze wirusowym
to proces celowej rekombinacji genu polegającej na wymianie genu z DNA chromosomowego na transgen wprowadzany w wektorze bakteriofagowym
to proces losowej rekombinacji genu polegającej na wymianie genu z DNA chromosomowego na transgen wprowadzany w wektorze wirusowym
Do „knock-out'u” genowego można doprowadzić za pomocą:
infekcji wczesnego zarodka zrekombinowanym wektorem pochodzenia wirusowego
zastosowania zarodkowych komórek macierzystych ES
mikroiniekcji zrekombinowanych komórek węzła zarodkowego do blastocelu embriona
mikroiniekcji in vitro DNA do jednego z przedjądrzy zapłodnionej komórki jajowej przed pierwszym jej podziałem
Rekombinaza Cre:
działa na miejsce loxP, wklejając miejscowo frament DNA
działa na miejsce loxP, wycinając miejscowo fragment DNA
działa na miejsce Xho, wklejając miejscowo frament DNA
działa na miejsce Xho, wycinając miejscowo fragment DNA
Nadekspresja genu pozwala:
umożliwia izolację białka z organizmu
umożliwia powstanie odporności na białko w toksycznym stężeniu
określić ilość białka w organizmie
dostrzec zmiany fenotypowe w organizmie
Potranskrypcyjnie wyciszanie genu może zachodzić poprzez:
wprowadzenie antysensownego RNA
wprowadzenie komórki na drogę apoptozy
interferencję RNA
zadziałanie antygenami
Degradację mRNA powodują:
rRNA
siRNA
dsRNA
ssRNA
Zastosowania interferencji RNA to:
zahamowanie syntezy niechcianych białek
precyzyjne i ukierunkowane blokowanie ekspresji genów
rekombinacja genów odpornościowych
terapia genowa (np. nowotworów)
Rozdział piętnasty - Proteomika
Proteomika to:
nauka umożliwiająca badanie wszystkich białek komórkowych
nauka umożliwiająca badanie wszystkich RNA w komórce
nauka umożliwiająca badanie wszystkich DNA w komórce
nauka umożliwiająca badanie wszystkich kwasów nukleinowych w komórce
Zadania proteomiki funkcjonalnej to:
określenie struktury białek
określanie składu i funkcji kompleksów makromolekularnych
analiza oddziaływań białek z innymi białkami, kwasami nukleinowymi, ligandami niskocząsteczkowymi
badanie powiązań pomiędzy kaskadami przemian biochemicznych
EMSA pozwala określić:
miejsce wiązanie białka do DNA, a także precyzyjne określić pozycję wiązania
miejsce wiązanie białka do DNA
czy białko wiąże się z DNA
z iloma cząsteczkami DNA wiąże się białko
Footprinting pozwala określić:
miejsce wiązanie białka do DNA, a także precyzyjne określić pozycję wiązania
miejsce wiązanie białka do DNA
czy białko wiąże się z DNA
z iloma cząsteczkami DNA wiąże się białko
Test prezentacji na fagu opiera się na:
pokazaniu oddziaływania jakiegoś zidentyfikowanego (znanego) białka z innym białkiem (znanym)
pokazaniu oddziaływania jakiegoś zidentyfikowanego (znanego) białka z białkiem nieznanym (X)
pokazaniu oddziaływania jakiegoś zidentyfikowanego (nieznanego) białka z innym białkiem nieznanym (X)
pokazaniu oddziaływania jakiegoś zidentyfikowanego (znanego) białka z DNA
Fuzja genowa to:
połączenie wektorów
połączenie fragmentów różnych genów
połączenie dwóch podjednostek DNA
połączenie sekwencji DNA z białkiem
System dwuhybrydowy:
służy do badania interakcji białko-białko (tzw. przynęta i zdobycz)
pozwala precyzyjnie zmapować interakcje białko-białko
podobnie jak alfa-komplementacja opiera się na łączeniu dwóch cząsteczek białek
wykorzystuje geny reporterowe
Bezpośrednie oddziaływanie dwóch białek możemy pokazać przez:
testy immunoenzymatyczne
alfa-komplementację badanych białek
przyłączenie genu na dane białko w miejsce promotora genu reporterowego
pośrednie połączenie dwóch domen czynnika transkrypcyjnego
Białko fuzyjne zbudowane jest z:
dwóch badanych białek
badanego białka sprzężonego z domeną aktywującą czynnika transkrypcyjnego
badanego białka sprzężonego z domeną wiążącą czynnika transkrypcyjnego
badanych białek sprzężonych z obiema domanami czynnika transkrypcyjnego
Macierze peptydowe:
zawierają szereg peptydów o różnych sekwencjach
przeznaczone są do równoczesnych analiz białek danego organizmu
łatwo utrzymać w formie poprawnie zwiniętych peptydów
wykorzystuje się do badania oddziaływań fragmentów białek zinnymi białkami i DNA
Opracował Jakub Knurek