Zestaw 62

Pytanie1: Cykl kwasu cytrynowego - przebieg, regulacje

• Pełni zasadniczą rolę jako wspólny szlak końcowy utleniania węglowodanów, białek i tłuszczów

• Cykl odgrywa także znaczącą rolę w glukoneogenezie, transaminacji, dezaminacji i lipogenezie.

• Mimo, że większosc tych przemian zachodzi w wielu różnych tkankach podstawowym organem metabolicznym jest wątroba i jej uszkodzenia najbardziej rzutują na procesy metaboliczne zachodzące w organizmie człowieka.

• Cykl Krebsa jest integralna częścią procesu, w wyniku którego przeważajaca cześć energii swobodnej, uwalnianej podczas utleniania węglowodanów, lipidów i aminokwasów staje się dostępna.

• Enzymy cyklu znajdują się zawieszone w macierzy mitochondrialnej lub są połączone z wewnętrzną stroną wewnętrznej błony mitochondrium (dehydrogenaza bursztynianowa), co ułatwia przekazywanie powstających równoważników redukcyjnych na odpowiednie enzymy łańcucha oddechowego.

• Każdy obrót cyklu umożliwia powstanie 12 cząsteczek ATP

1. 3 - w reacji z udziałem dehydrogenazy izocytrynianowej (powstanie NADH)

2. 3- w reakcji z udziałem kompleksu dehydrogenazy alfa-ketoglutaranowej (powstanie NADH)

3. 1- w reakcji z udziałem syntetazy bursztynylo-CoA (fosforylacja substartowa GDP do GTP)

4. 2- w reakcji z udziałem dehydrogenazy burstynianowej (powstanie FADH2)

5. 3 - w reakcji z udziałem dehydrogenazy jabłczanowej (powstanie NADH)

• cykl jest amfiboliczny (uczestniczy w przemianach anabolicznych jak i kataboliznych)

Regulacja:

1) Aktywność cyklu jest bezpośrednio zależna od podaży utlenionych kofaktorów dehydrogenaz (np. NAD), a podaz ta bezposrednio zależy od dostępności ATP

2) Najbardziej prawdopodobnym miejscem regulacji są reakcje nieodwracalne, a wiec katalizowane przez kompleks dehydrogenazy pirogronianowej, syntazy cytrynianowej, dehydrogenazy izocytrynianowej i alfa-ketoglutaranowej. Wszystkie te dehydrogenazy są aktywowane przez jony Ca2+, którego stężenie zwiększa się w czasie wysiłku i skurczu mięśni.

Syntaza cytrynianowa jest hamowana allosterycznie przez ATP i acylo-CoA, a aktywowana przez ADP

Kompleks dehydrogenazy alfa-ketoglutaranowej analogicznie jak kompleks dehydrogenazy pirogronianowej

Dehydrogenaza bursztynianowa jest hamowana przez szczawiooctan.

3) Arsenin blokuje cykl na poziomie przekształcenia alfa-ketoglutaranu w bursztynylo-CoA

4) cztery witaminy z grupy B wchodzą w skład kluczowych enzymów cyklu Krebsa

1. ryboflawina ( w formie FADu w dehydrogenazie alfa-ketoglutaranowej i dehydrogenazie bursztynianowej)

2. niacyna ( w formie NADu w dehydrogenazie izocytrynianowej, dehydrogenazie alfa-ketoglutaranowej i dehydrogenazie jabłczanowej)

3. tiamina (B1 w postaci difosfotiaminy jako koenzym dekarboksylacji)

4. kwas pantotenowy (jako część koenzymu A)

Pytanie 2: Białkowe składniki błon biologicznych.

• Białka są związane z dwuwarstwą lipidową

• Wyróżniamy białka integralne i peryferyjne

• Białka integralne są asymetrycznie wbudowane w dwuwarswtę lipidową i dzieje się to dzięki asymetrycznej orientacji białka w błonie w czasie jego wbudowywania do warstwy lipidowej.

• Białka peryferyjne nie oddziaływują bezpośrednio z fosfolipidami. Są one słabo związane z odpowiednimi białkami integralnymi i mogą zostać uwolnione przez działanie soli o wysokiej sile jonowej. Np. spektryna, białko cytoszkieletu erytrocytów jest związana z ankiryną, przez co odgrywa ważną rolę w utrzymaniu jego dwuwklęsłego kształtu.

Wiele cząsteczek receptorów hormonalnych jest białkami integralnymi, specyficzne zaś hormony polipeptydowe, ktróe oddziaływują z tymi receptorami można uznać za białka peryferyjne. Takie białka peryferyjne mogą nawet organizować rozmieszczenie białek integralnych np. ich receptorów w płaszczyźnie dwuwarstwy.

• Ze wzrostem płynności błon zwiększa się ruchliwość boczna integralnych białek. Dobrym przykładem jest receptor insulinowy. Gdy stężenie nienasyconych kwasów tłuszczowych wzrasta, zwiększa się płynność błony, a co za tym idzie receptor wiąże więcej insuliny.

• Lipidy błon tworząc przestrzenne przedziały stanowią półprzepuszczalne bariery, natomiast specyficzne białka pośredniczą w charakterystycznych funkcjach błon takich jak:

• transport cząsteczek

• przekazywanie informacji

• przemiana energii

Lipidy zapewniają odpowiednie środowisko do działania tych białek.

• Błony biologiczne wykazują duże zróżnicowanie pod względem zawartości białka (mielina 18% bo ma izolować, a błona mitochondrium 75%, bo zawiera liczne pompy, furtki molekularne, receptory i enzymy).

• Białka nie ulegają dyfuzji poprzecznej w przeciwieństwie do tłuszczy, które ulegają dyfuzji flip-flop.

• Synteza błony nie może odbywać się de novo

Kanały błonowe

1) Umożliwiają szybki przepływ jonów przez błony w kierunku termodynamicznie korzystnym

2) Kanał receptora acetylocholinowego typu N (nikotynowego) pośredniczy w przekazywaniu sygnałów nerwowych przez synapsę. Acetylocholina uwolniona do synapsy powoduje otwarcie jednego rodzaju kanału kationowego, którym Na+ wpływa do komórki, a K+ z niej wypływa. Wpływ Na+ do komórki jest bardziej intensywny, gdyż gradient stężenia Na+ w poprzek błony jest większy.

3) Impuls nerwowy bez użycia mediatora może aktywować kanał jonowy. Tak się właśnie dzieje w przypadku kanałów bramkowanych napięciem dla Na+ i K+ (tzw. szybkie kanały Na+ i wolne kanały K+)

4) Kanały łączące komórki służą jako przejście łączące wnętrza graniczących ze sobą komórek. Poprzez takie połączenia mogą przechodzić małe cząsteczki hydrofilowe oraz jony. Te połączenia są ważne dla komunikacji między komórkowej, bo dzięki nim może nastąpić szybka reakcja na bodźce.

5) Wszystkie kanały błonowe choć spełniają wiele różnorodnych funkcji maja pare cech wspólnych ( ich konstrukcja oparta jest na asocjacji wielu homologicznych podjednostek, por przebiega zgodnie z osią symetrii kanału, por jest wyścielony przez alfa-helisy, a boczne łańcuchy wystające z tych elementów oraz szerokość najwęższego miejsca kanału decydują o selektywności kanału.

6) Kanały umożliwiają przepływ jonów w obu kierunkach. Może on się odbywać na zasadzie symportu (aktywne przenoszenie glukozy i aminokwasów opierajace się o siłę sodomotoryczną), antyportu (wymiennik Na+- Ca2+)

Pompy błonowe

1) Hydroliza ATP jest siłą napędową i dostarcza energii do transportu jonów wbew gradientowi stężeń.

2) wytwarzają gradient jonowy Na+-K+ który kontroluje objętość komórki, warunkuje pobudzenie nerwów i mięśni oraz jest siłą napędową aktywnego transportu cukrów i aminokwasów.

3) W jednym cyklu pracy ATPaza Na+-K+usuwa 3 cząsteczki Na+ na zewnątrz i wprowadza 2 cząsteczki K+ do wewnątrz. Gdy Na+ łączy się z cytozolową stroną pompy, ATP fosforyluje jej boczny łańcuch asparaginianu. Fosforylacja powoduje awersję miejsca wiążącego i uwolnienie Na+ po stronie zewnątrzkomórkowej. Następujące potem związanie K+ indukuje hydrolizę przyłączonej grupy fosforanowej, co powoduje ewersję miejsca wiążącego do orientacji początkowej i uwalnia K+ do środka komórki.

4) podanie steroidów kardiotonicznych powoduje zastrzymanie pompy Na+-K+

Pytanie 3: Rodzaje elektroforez stosowanych w pracowniach biochemicznych.

Elektroforeza - technika analityczna, rzadziej preparatywna, stosowana w chemii i biologii molekularnej, zwłaszcza w genetyce. Jej istotą jest rozdzielenie mieszaniny związków chemicznych na możliwie jednorodne frakcje przez wymuszanie wędrówki ich cząsteczek w polu elektrycznym.Cząsteczki różnych substancji różnią się zwykle ruchliwością elektroforetyczną. Parametr ten jest w przybliżeniu wprost proporcjonalny do ładunku elektrycznego cząsteczki i odwrotnie proporcjonalny do jej wielkości. Zależy także od kształtu cząsteczki.Istnieje wiele wariantów tej techniki. W zależności od ośrodka, w którym następuje rozdział wyróżnić można elektroforezę bibułową (dziś już przestarzałą i praktycznie nie używaną), żelową i kapilarną.

W elektroforezie żelowej środowiskiem w którym przemieszczają się badane substancje jest żel elektroforetyczny wykonany z agaru, poliakrylamidów lub skrobi (metoda historyczna), uformowany w płytkę długości kilkunastu centymetrów (rzadziej słupek - elektroforeza dyskowa). Kroplę roztworu analizowanej mieszaniny nanosi się w zagłębienie w żelu (studzienkę) zanurzonym w buforze pH. Wzdłuż krawędzi żelu, zwykle na dwóch przeciwległych bokach płytki, biegną elektrody, do których przykłada się stałe napięcie elektryczne rzędu 50- 2000 V. Ze względu na zróżnicowaną ruchliwość elektroforetyczną, różne cząsteczki w różnym stopniu oddalają się podczas analizy od miejsca naniesienia próby. Stopniowo ulegają więc rozdzieleniu.Technika ta jest najczęściej stosowana do rozdzielania DNA, RNA lub białek wyekstrahowanych z komórek. Jest też czasami stosowana jako jedna z technik pomiaru masy cząsteczkowej i badania polidyspersji polimerów syntetycznych. Jeśli badaczowi zależy na ograniczeniu wpływu kształtu cząsteczek na szybkość ich elektroforetycznej wędrówki i na ściślejszym powiązaniu ich ruchliwości z masą cząsteczkową, to może badane substancje poddać denaturacji, np. przy pomocy detergentu SDS (w przypadku białek) lub mocznika (w przypadku DNA lub białek).

Elektroforeza kapilarna, zwana też elektroforezą w wolnym buforze służy najczęściej do rozdziału niewielkich cząsteczek (podobnie jak HPLC). Metoda ta jest często stosowana w biologii molekularnej do analizy DNA, znacznie rzadziej do rozdziału peptydów. Rozdział mieszanin prowadzony jest w cienkiej (wewn. średnica 25-100 µm) i długiej (0.5-1 m) rurce szklanej, przypominającej z wyglądu światłowód. Rurka ta wypełniana jest buforem.Próbka wprowadzana jest do wlotu rurki, po czym jest do niej przykładane wysokie napięcie elektryczne (do 30 kV). U wylotu kapilary zamontowany jest detektor, który rejestruje wychodzenie z rurki kolejnych związków chemicznych. Bufor płynie przez kapilarę ze stałą szybkością w stronę jednej z elektrod. Dla układu wodnego jest to zwykle katoda.Technika ta umożliwia rozdzielanie anionów i kationów soli organicznych i nieorganicznych.

Odmianą elektroforezy kapilarnej jest micelarna elektrokinetochromatografia (MEKC). W tej technice w buforze rozdziałowym znajduje się rozpuszczony detergent jonowy (np. siarczan dodecylu sodu - SDS) w takim stężeniu, aby tworzyć trwałą emulsję. Emulsja ta składa się z miceli, które są hydrofobowe wewnątrz i naładowane elektrycznie na swojej powierzchni.

Micele te dzięki swemu ładunkowi poruszają się z inną prędkością niż reszta buforu, a w ich wnętrzach zamknięte są cząsteczki związków chemicznych tworzących analizowaną mieszaninę. Pozwala to rozdzielać związki chemiczne, które nie przyjmują ładunku elektrycznego nawet po przyłożeniu dużego napięcia. Metoda ta umożliwia rozdział i analizę niemal wszystkich związków chemicznych rozpuszczalnych w wodzie.

---