Wykład VII

RNA i DNA różnia się znacznie długością.

DNA: dwuniciowe; 10⁴ par zasad dla chloroplastów, 10⁸ chromosom bakteryjny, 10⁸ - 10⁹ organizmy wyższe.

RNA: 75-90 nukleotydów dla tRNA, 4000 dla rRNA

Struktura globalna (III rzędowa) raczej przypomina strukturę białek niż DNA. Jeśli jednak chodzi o strukturę II rzędową, można łącznie rozpatrywać oba kwasy, bo różnice w lokalnej strukturze są niewielkie. Zasadnicza różnica pojawia się dopiero na poziomie III rzędowym

Typy struktury II rzędowej:

- Struktury heliakalne

Podwójne (diplexy)

Potrójne (triplexy)

Poczwórne (tetraplexy, kwadriplexy)

- pętle

Typu spinka do włosów

Inne, np. pętle wewnętrzne w strukturach heliakalnych (od wybrzuszenia na długości 1 nukleotydu, aż do większych fragmentów nie wykazujących parowania)

Podwójna helisa

Parowanie Watsona Cricka

3 podstawowe rodziny helis: A, B, Z

Watson i Crick określali struktury na podstawie dyfrakcji promieni rentgenowskich na włóknach (nie na kryształach, ta pojawiła się dopiero, gdy zaczęto syntetyzować krótkie fragmenty DNA i RNA, które można było wykrystalizować i określić z dokładnością do poszczególnych atomów). Przy dyfrakcji na włóknach dostaje się dyfraktogram, do którego trzeba założyć pewien model i porównując go do dyfraktogramu wyciągać informacje o strukturze.

Helisy kanoniczne (modelowe, regularne) - gdy brak danych o poszczególnych atomach. Wszystkie nukleotydy cząsteczki (obu nici) charakteryzują się jednym zestawem kątów dwuściennych. Konformacje wszystkich nukleotydów w takiej helisie są jednakowe.

Kąty dwuścienne: α β γ delta ε zeta phi - charakteryzują łańcuch fosfocukrowy;

Do kompletu trzeba by jeszcze podać wartość kąta pseudorotacji, wartość parametru maksymalnego wychylenia fi n. Kat delta jest wspólny dla łańcucha i dla pierścienia, więc wystarczy podać jego wartość + konformację (E lub S)

Zestaw kątów dwuściennych w jednoznaczny sposób charakteryzuje konformację nukleotydów w łańcuchu

DNA możliwe konformacje: ABZ

RNA : AZ

RNA nie występuje w konformacji B, bo zachodziłoby niekorzystne oddziaływanie steryczne grupy 2'OH rybozy z resztami fosforanowymi.

W rodzinie typu B DNA wyróżniamy typy C D i E

W rodzinie typu A DNA wyróżniamy A i A'

Z -> Z i Z'

A RNA i A DNA są bardzo podobne.

A i B - prawoskrętne; Z - lewoskrętne

A DNA i B DNA różnią się konformacją cukru

Na podstawie wartości kątów dwuściennych, długości wiązań i wartości kątów płaskich można już skonstruować model cząsteczki. Wygląd najlepiej scharakteryzować przez podanie parametrów heliakalnych. Helisy charakteryzują się tzw. pseudosymetrią, bo żadna operacja nie przeprowadza wszystkich atomów we wszystkie atomy w identyczny układ, ale jeden nukleotyd przeprowadza w inny nukleotyd (może być różny). Jest to tzw. pseudosymetria śruby.

Operacja linii śrubowej:

jeśli dokonamy przesunięcia wzdłuż osi o jeden skok równy p, (p- skok śruby (Å); DNA: B - 33,8Å; A - 30Å) i dokonamy obrotu o kąt t równy K/X x 360 st i przesuwając wzdłuż osi helisy o K/X x p, powodujemy przejście od jednego nukleotydu do drugiego. Przekręcamy o kąt t i przesuwamy o skok p. Motywem w przypadku helis A i B jest jeden nukleotyd. Śrubę kręcimy w prawo i przesuwamy do przodu

X - ilość par zasad przypadających na pełny skręt helisy.

Trochę inaczej jest dla lewoskrętnych helis typu Z:

Sąsiednie nukleotydy nie mają jednakowej konformacji. Najmniejszym motywem konformacyjnym są dwa sąsiednie nukleotydy na nici. W operacji symetrii linii śrubowej przeprowadza się 2 nukleotydy w 2 następne. Struktura wyraźnie mniej regularna. Symetria jest typu 6/5, a więc jeżeli przeprowadzimy obrót o kąt 5/6 z 360st, czyli o kąt 300 st w prawo i przesuniemy o 5/6 do przodu (30kilka Å), to tak jakbyśmy zrobili obrót o 1/6 w lewo i przesunęli się o 1/6 do tyłu.

Lewoskrętność jest więc tu potraktowana jako szczególny przypadek prawoskrętności (jeśli chodzi o symbol).

De facto 12 par zasad przypada na jeden skok: 6 dwójek. Długość helisy jest więc podobna do innych helis. Kąt oznaczamy jako -, a więc kręcimy w lewo o 60st i cofamy się wzdłuż osi.

Inne parametry helikalne: nachylenie pary zasad w stosunku do osi helisy; jest bliski 0 st dla B DNA i Z DNA; helisy typu A DNA - 18st.

Możemy określić odchylenie geometrycznego ośrodka pary zasad od osi helisy. W helisie typu B i Z zasady blisko położone w stosunku do osi, dla typu A są odsunięte od osi o ok. 4,4 Å

Wymiary dużej i małej bruzdy: szerokość S, głębokość G (Å). Z DNA - brak dużej bruzdy.

Lepiej jest operować parametrami heliakalnymi niż wyłącznie kątami dwuściennymi.

Stabilizacja struktury podwójnej helisy DNA:

- wiązania wodorowe

G ≡ C; A = T; A = U

- oddziaływania warstwowe pomiędzy sąsiadującymi parami zasad (staking)

- ładunek ujemny grup fosforanowych jest ekranowany przez dodatnio naładowane jony (Na⁺, K⁺, Mg⁺); w roztworze nici odpychają się elektrostatycznie od siebie, bo mają ładunek, każdy nukleotyd wnosi 1 ładunek ujemny. Dlatego ważne jest odpowiednie stężenie soli, odpowiednia siła jonowa.

Wiązania wodorowe i oddziaływania warstwowe są bardzo słabe, więc wzrost temp, zmiana pH i inne mogą wpłynąć na stabilizację helisy.

Wnioski:

1. Struktury heliakalne tworzą się w wyniku oddziaływania pomiędzy nićmi (wodorowe, warstwowe) i oddziaływania nici ze środowiskiem.

2. Struktury heliakalne tworzą się w zakresie określonych parametrów charakteryzujących środowisko: siła jonowa (obecność jonów dodatnich), odpowiednie pH i temp

Parametry warunkują typ helisy. Typ zależy też od składu zasad - sekwencji.

Struktura Z najczęściej tworzy się dla sekwencji bogatych w naprzemienne ustawienie G i C.

Podczas krystalizacji możemy dostać wszystkie formy zależnie od warunków zastosowanych. W roztworze krótkie fragmentu DNA głównie w formie B. Jeżeli damy duże stężenie G i C i duży nadmiar soli, utworzy się Z. RNA w roztworze głównie jako A, jeżeli damy naprzemienne sekwencje G C i dużo soli ->Z

W roztworze DNA może przejść z B do A jeśli dodamy etanolu do próbki.

Jednak zarówno w krysztale jak i roztworze stwierdzono, że struktury rzeczywiste odbiegają od struktur kanonicznych. Okazało się, że poszczególne nukleotydy mają nieco różne zestawy kątów dwuściennych.

Do opisu helis nieregularnych wprowadza się dodatkowe parametry, które opisują nieregularności we wzajemnych ustawieniach zasad. Zasady mogą być skręcone, rozsunięte, itd. Oś może wykazywać załamania, wygięcia.

Funkcjonalny DNA w chromatynie to przypuszczalnie zarówno A, B, jak i Z

Syn: od -90st do +90st

Anti: od +90st do 270st

Żeby ściśle sprecyzować konformację trzeba podać wartość kąta, ale sama informacja, że jest syn lub anti już nam mówi gdzie ta zasada w stosunku do cukru się znajduje. W roztworze równowaga dynamiczna.

+sc, -sc, ap

Kąty +60st, -60st i 180 st. Równowaga dynamiczna 3 konformerów w roztworze. Każda z konformacji ma skończoną wartość populacji. Podajemy ułamek ilości cząsteczek przebywających w danej konformacji lub procentową zawartość - populacja konformeru w równowadze dynamicznej.

Patrząc na grupę fosforanową możemy ją przypisać węglowi:

C5' - tu dominuje konformacja z ustawieniem transoidalnym fosforu i węgla C4', czyli ap; kąt który to określa to kąt β bliski 180st;

lub C3' - opisuje kąt ε; dominująca konformacja też ap, ale kąt odchylony od 180st do 220st.

Konformacje pierścienia cukrowego

Cukier nie jest płaski ,jego konformacje określa 5 kątów dwuściennych wokół poszczególnych wiązań w pierścieniu: 3 wiązania typu C - C i 2 wiązania C - O. Podanie 5 kątów dwuściennych jednoznacznie konformacje charakteryzuje. Można jednak wprowadzić upraszczający model, tzw. model pseudorotacji, który wynika z tego, że cukier tworzy układ pierścieniowy, a więc są narzucone pewne warunki na kąty. Ich suma jest równa 0 dla każdej konformacji. Niepłaskie konformacje jakie może przyjmować pierścień pięcioczłonowy:

Kopertowa E - jeden z atomów sterczy do góry (konformacja endo) lub do dołu (egzo).

Konformacje twistowe - 2 sąsiednie atomy wychylone z płaszczyzny pozostałych trzech, jeden w gór (endo) drugi w dół (egzo).

Pomiędzy nimi konformacje pośrednie; wszystkie dopuszczalne.

Można je zobrazować na tzw. kole pseudorotacji. Przyjmujemy początkową konformacje (np. twistową, gdzie 3'endo, 2'egzo, kąt e pseudorotacji = 0st). Następnie każdą konformację uzyskujemy kolejno wychylając każdy atom z pierścienia i przechodzimy przez wszystkie konformacje. Na tym kole każdej konformacji ciągłej można przypisać jedną określoną wartość kąta pseudorotacji e. Jeżeli dodatkowo wprowadzimy maksymalne wychylenie kątowe (struktury kopertowej) atomu jako phi max, wtedy 2 parametry (kąt pseudorotacji i parametr wychylenia) opisują jednoznacznie każdą konformację. Znaczna oszczędność opisu!

W cyklopentanie przejście z jednej konformacji w drugą, czyli ruch po kole pseudorotacji, jest rzeczywistym przejściem bez barier energetycznych. Gdy mamy do czynienia z podstawnikami i heteroatomami w środku pierścienia pojawiają się bariery przy przejściach.

Dla rybozy i deoksyrybozy istnieje możliwość wystąpienia dwóch konformacji. W konformacji gdzie atom 3' jest wychylony do góry, czyli do k. kopertowej, kąta e(p??) bliskiego 0st (de facto wynosi on ok. 18st). Druga konformacja, kąt e(p) zbliżony do 180 st (de facto 180-18=162st).

Konformacje pierścienia cukrowego w nukleotydach i zydach mieszczą się w pewnych zakresach, które nazywają się zakresem typu N (północny na kole pseudorotacji) i s (południe). Równowaga dynamiczna tych dwóch form.

Badając populacje musimy wymnożyć przez siebie typy konformacji dla każdego fragmentu nukleotydu i dostaniemy procent populacji jednaj konkretnej konformacji ogólnej dla całej cząsteczki.

W żadnej konformacji cząsteczka nie przebywa dłużej niż kilka nanosekund (10^-9s). Krótkie czasy przebywania wynikają z tego, że bariery na przejście są niskie, nie przekraczają 10 RT (miara ruchów cieplnych, ok. 2,5kJ/mol), więc nie przekraczają 25 kJ/mol.

Dla nukleotydów w łańcuchu polinukleotydowym dochodzą jeszcze 2 kąty opisujące połączenie α i zeta.

Mamy 6 kątów opisujących konformację łańcucha + 1 kąt i 2 paramtery opisujące konformację zasady i pierścienia cukrowego. Kąd delta należy zarówno do łańcucha, jak i cukru.

Konformacja całego łańcucha będzie podana wtedy, jeżeli dla każdego nukleotydu podamy zestaw 9 paramterów.

Często przyjmuje się identyczne konformacje dla każdego nukleotydu, de facto będą się one od siebie różniły. Możemy zdefiniować strukturę II rzędową, a po zwinięciu przestrzennym całej cząsteczki także str III rzędową. Więc str lokalna i globalna mieści się w tych 9 parametrach dla każdego nukleotydu. Najpierw ważna jest jednak znajomość kolejności zasad (I rzędowa), żebyśmy mogli cokolwiek mówić o str przestrzennych.

Wyznaczanie sekwencji zasad w łańcuchu nukleotydowym

Wyznaczenie pełnej sekwencji - podstawowe zadanie genomiki.

Pełna sekwencja człowieka 6x10⁹ par zasad (wyznaczone w 2000 roku).

Aby uzyskać pełną sekwencję takiej olbrzymiej cząsteczki najpierw trzeba ją pociąć na kawałki, uzyskać kawałki jednoniciowe długości nie przekraczającej kilkuset nukleotydów, w nich określić sekwencję przez chemiczne rozszczepienie (metoda ….-Gilberta) lub kontrolowane przerywanie replikacji (metoda Zangera).

Musimy zejść do krótkich fragmentów, żeby możliwy był elektroforetyczny rozdział, który jest warunkiem sekwencjonowania; działa tylko poniżej 500 nukleotydów.

Potem składamy kawałki metodą komputerową - Whole genome shotgun cloning.

Chemiczne rozszczepianie

5' koniec badanego DNA lub RNA należy wyznakować, tj. wprowadzić radioaktywny fosfor 32P. W ten sposób widzimy na żelu tylko fragmenty zawierające 5' koniec. Stosuje się polimerazę bakteriofagów, znakowane ATP do wprowadzenia 32P. Następnie dizeli się materiał (makroskopowy zbiór cząsteczek) na 4 i w każdej z próbek przeprowadza serię reakcji, które powodują selektywne cięcie od strony 5' ściśle określonego nukleotydu.

Jeżeli np. zastosujemy sekwencje reakcji, które przecinają wiązanie od strony 5' końca, czyli od G (w danym przykładzie) na lewo, uzyskamy zbiór fragmentów, które kończą się na nukleotyd poprzedzający G. Dobiera się tak warunki, żeby było średnio jedno cięcie na cząsteczkę. Interesują nas więc tylko te, które widzimy, tj. te które zaczynają się na 5' końcu, a kończą na nukleotydzie poprzedzającym G.

Przykładowa seria reakcji: metylacja G, grzanie powodujące depurynację, alkalizacja powoduje rozcięcie wiązania ……. i pojawienie się dwóch fragmentów. Jednego fragmentu nie widać, a drugi zaczyna się na 5' końcu, a kończy na C, poprzedzającej G. Cięcie jest selektywne, więc dostaniemy ileś kawałków kończących się na nukleotyd poprzedzający G. To samo robimy dla 3 pozostałych zasad i otrzymujemy fragmenty różnej długości, które puszczamy na elektroforezie. Patrząc na fragment najkrótszy, jednonukleotydowy, będzie to fragment, w którym cięcie nastąpiło pomiędzy pierwszą G, a drugą C. Ponieważ selektywność zachodzi w stosunku do C, wiemy, że drugim nukleotydem jest właśnie C, gdyż w reakcji specyficznej w stosunku do C dostaliśmy najkrótszy kawałek. Następnie mamy kawałek dwunukleotydowy GC poprzedzający T, a więc trzecim nukleotydem jest T. Dalej ACG, itd. Idąc kolejno po fragmentach o coraz większej długości i patrząc dla jakiego selektywnego cięcia to otrzymaliśmy otrzymujemy sekwencję z wyjątkiem pierwszego nukleotydu (ten trzeba określić niezależnie). Jednak 100% selektywność cięcia następuje tylko dla C i G. Dla A i T jeżeli dokonamy cięcia na lewo, czyli od strony 5', to jednocześnie przetną nam się kawałki na lewo od G i T. Ale oczywiście ponieważ te są wyznaczona selektywnie, więc jeżeli w tych dwóch liniach mamy w tym wypadku wszystkie możliwe kawałki pocięte na lewo od T i na lewo od C oraz na lewo od G i na lewo od A, to te które są ściśle selektywne na lewo od A wybieramy jako te, które nie mają odpowiedniego partnera przy selektywnym cięciu na lewo od G. A więc znając selektywne cięcie dla dwóch zasad, możemy wyznaczyć selektywne cięcie dla dwóch pozostałych.

Kontrolowane przerywanie replikacji.

Obecnie częściej stosowana. Nie wyznaczamy bezpośrednio sekwencji nici, która nas interesuje, tylko sekwencje nici komplementarnej i na jej podstawie odczytujemy sekw nici pierwotnej. Zamiast ciąć syntetyzujemy przy pomocy polimerazy nić potomną, komplementarną. Reakcję też przeprowadzamy w 4 naczyniach reakcyjnych. W każdym z naczyń oprócz 4 podstawowych trójfosforanów, nukleotydów: dATP, dGTP, dCTP, dTTP, mamy domieszany selektywnie (w każdym naczyniu inny) 2'3'deoksyanalog. Taki nukleotyd jest włączany w syntetyzowaną nić, ale ponieważ nie ma grupy 3'OH terminuje syntezę. Otrzymujemy w przypadkowy sposób fragmenty różnej długości kończące się na ściśle określone nukleotydy. Ponieważ polimeraza wymaga odpowiedniego polimera, musimy dobrać odpowiedni primer na początku. Jego sekwencję znamy. Przeprowadzamy 4 reakcje syntezy, rozdzielamy kawałki elektroforetycznie i każdy kawałek może mieć np. do primera przyczepioną etykietę fluoryzującą (każda w innej długości fali). Pod detektorem widzimy z jakim kawałkiem mamy do czynienia, jakim nukleotydem się kończy (dla każdej reakcji mieliśmy inny primer). Puszczamy elektroforetycznie, świecimy 4 długościami fali i odczytujemy sekwencję od najkrótszego do najdłuższego odcinka, wiedząc z długości fali detekcji o jaki nukleotyd chodzi.

Mamy sekwencje krótkich fragmentów DNA, które możemy poskładać w funkcjonalne cząsteczki DNA.

---