ELEKTROFOREZA PREPARATYWNA W ŻELU AGAROZOWYM
1. zagadnienia z poprzednich zajęć (+ materiały - będziemy kończyć omawianie roztworów i zagadnień
związanych z restryktazami)
2. ruchliwość DNA w żelu
3. rola składników zawartych w 6xSB
4. różnica w długości fali podczas obserwowania żeli analitycznych i preparatynych
Ruchliwość DNA w żelu:
Czynnik dsDNA liniowy dsDNA superskręcony
Długość Im dłuższy tym mniejsza ruchliwość Im dłuższy tym mniejsza ruchliwość
Stężenie agarozy Im wyższe tym mniejsza ruchliwość Im wyższe tym mniejsza ruchliwość
Napięcie Im wyższe tym większa ruchliwość* Im wyższe tym większa ruchliwość*
Bromek etydyny Im wyższe stężenie bromku tym **
mniejsza ruchliwość
Stopień superskręcenia - Im większy, tym większa ruchliwość
*przy zbyt wysokim napięciu wydziela się dużo ciepła, struktura żelu może ulec zniszczeniu
** u bakterii DNA jest skręcone ujemnie, w prawo (plektonemicznie), a bromek etydyny dodaje dodatnie
skręty. Superskręcone DNA wędruje w żelu szybciej niż liniowe, więc do pewnego momentu ruchliwość
będzie spadać wraz ze wzrostem stężenia bromku (rozwijanie skrętów ujemnych do liniowego DNA) a
potem wraz ze wzrostem stężenia bromku zacznie wzrastać ruchliwość (bo gdy już będzie liniowe DNA
zaczną być wprowadzane dodatnie superskręty)   uśmiechnięty wykres zależności ruchliwości od
stężenia bromku, ale  smutny żel.
6xSB
- błękit bromofenolowy
- ksylenocyjanol
- ficoll
Funkcje:
- zwiększenie gęstości próbki
- nadanie koloru probce
- zawiera barwniki, które poruszają się w kierunku anody z przewidywalnymi szybkościami: błękit
bromofenolowy migruje w żelu agarozowym (0,5-1,4%) w ~ z tą samą szybkością, co liniowy dsDNA o
długości 300 pz, a ksylenocyjanol ~ liniowy dsDNA o długości 4000 pz
Żele preparatywne oglądamy przy długości fali 365 nm, ze względu na to, że będziemy dalej używać
zawartego w żelu DNA i nie chcemy, żeby zmutowało(powstawanie par T-T itp.) pod wpływem UV. Fala
o długości 365 nm ma mniejszą energię niż 254 nm i ponad to jest adsorbowana bezpośrednio przez
bromek etydyny, w przeciwieństwie do 254 nm, która jest przekazywana na bromek przez DNA. Żele
analityczne oglądamy przy 254 nm, bo nie będziemy wykorzystywać dalej zawartego w żelu DNA więc
jest nam wszystko jedno czy zmutuje, a przy 254 nm jest większa czułość niż przy 365 nm.
Agaroza jest liniowym polimerem składającym się z naprzemiennych reszt D oraz L-galaktozy
połączonych alfa-(1->3) i beta-(1->4) wiązaniami glikozydowymi.
Czynniki wpływające na stopień migracji DNA w żelu agarozowym:
-wielkość DNA-duże cząsteczki migrują wolniej niż małe z racji większych oporów tarcia oraz
występowania w żelu porów
-stężenie agarozy
-konformacja DNA-mobilność poszczególnych form DNA zależy od: stężenia i rodzaju agarozy,
przyłożonego napięcia, siły jonowej buforu, gęstości skręceń w formie superskręconej
-obecność bromku etydyny-interkalacja bromku etydyny w DNA powoduje spadek ujemnego ładunku i
wzrost sztywności
-przyłożone napięcie (powinno być 5-8 V/cm)
-rodzaj agarozy
-bufor do elektroforezy-przy braku jonów przewodnictwo jest małe i DNA migruje wolno, gdy siła jonowa
jest duża przewodnictwo jest dobre i generuje to znaczną ilość ciepła-żel i DNA mogą się zdenaturować
Bufory do elektroforezy
-TAE: Tris-acetate (octan), EDTA (pH 8.0; TAE)-nazywany również buforem E, najmniejsza pojemność
buforowa, jeżeli elektroforeza jest prowadzona długo anodowa porcja żelu staje się kwasowata i
bromofenol zmienia swoje zabarwienie z niebieskawo-filoetowego na żółte, dsDNA migruje w nim 10%
szybciej niż w TBE czy TPE, zdolność rozdzielcza jest lepsza dla dużych cząsteczek DNA i gorsza dla
małych
-TBE: Tris-borate (boran)
-TPE: Tris-phosphate (fosforan) (pH 7.5-7.8)
Gel-loading buffers
-zwiększają gęstość próbki zapewniając, że DNA wpadnie do studzienki
-dodają kolor ułatwiając proces nanoszenie na żel
-zawierają barwniki, które migrują w żelu: bromofenol jak 300 pz, ksylenocyjanol jak 4000 pz
Bromek etydyny
Zawiera 3 grupy pierścieniowe, które interkalują w DNA, jedna cząsteczka bromku etydyny interkaluje
na 2,5 pz. Po wniknięciu leży prostopadle do osi i tworzy wiązania van der Waalsa z parami zasad
leżacymi ponad oraz poniżej. Promieniowanie UV przy długości 254 nm jest absorbowane przez DNA i
przekazywane do barwnika, 366 nm jest absorbowane bezpośrednio przez barwnik. Służy do wykrywanie
jedno i dwuniciowych cząsteczek DNA i RNA, powinowactwo do jednoniciowych jest słabe dlatego
fluorescencja jest słaba. Nie używamy go przy żelach poliakrylamidowych, ponieważ jest inhibitorem
polimeryzacji akrylamidu. W obecności bromku etydyny prążki są mniej wyraz
ne.
Bromek wędruje w żelu w przeciwną stronę do DNA. DNA jest ujemnie naładowany więc wędruje do
anody (elektrody dodatniej).
W przypadku naszego ćwiczenia elektroforeza preparatywna służyła wyizolowaniu tylko zlinearyzowanego
wektora. Wyeliminowano zanieczyszczenia, EDTA i wszelkie aktywności enzymatyczne (BamHI,
fosfatazę).
Bufor do elektroforezy preparatywnej musi być świeży, a żel agarozowy idelanie czysty.
Defosforylacja nie przebiega w 100%
Żeby sprawdzić jaki mamy stosunek transformantów do rekombinantów robimy 2 posiewy:
Aby zapobiec religacji wektora używamy 2 enzymów restrykcjnych, które tworzą inne końce. Mimo
wszystko należy się zdefosforylować nawet przy takim trawieniu kierunkowym (bo kilka cząsteczek
wektora może zostać strawione tylko przez 1 enzym i wtedy już są komplementarne końce).