Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych z Enzymologii
Ćwiczenie 10. Oznaczanie stę\
enia fosforanów.
1. Wstęp
Kolorymetria jest działem analizy chemicznej, w którym podstawę ilościowego
oznaczania substancji w roztworze stanowi prosta zale\
ność między intensywnością
zabarwienia roztworu, a stÄ™\
eniem zawartej w nim substancji (prawo Lamberta-Beera).
A = µ × C ×
µ × × l lub
µ × ×
µ × ×
gdzie:
A  absorbancja,
µ  molowy współczynnik absorpcji1,
C  stÄ™\
enie molowe substancji absorbujÄ…cej w roztworze,
l  droga optyczna (grubość warstwy roztworu),
I1  natÄ™\
enie światła padającego,
I2  natÄ™\
enie światła, które przeszło przez roztwór.
Metodami kolorymetrycznymi mo\
na oznaczać zarówno stę\
enia substancji barwnych, jak
i substancji bezbarwnych, które na drodze stechiometrycznej reakcji chemicznej
przeprowadza się w związki barwne. Reakcja barwna musi szybko przebiegać do końca,
a powstałe zabarwienie winno być dostatecznie trwałe, czyli niewra\
liwe na działanie światła
i mało zale\
ne od zmian pH, temperatury, nadmiaru odczynnika itp. Wa\
ne jest równie\
, aby
odczynnik reagował jedynie z substancją badaną i nie dawał barwy z \
adnÄ… innÄ… substancjÄ…
obecną w roztworze (tj. aby reakcja była specyficzna). W niektórych przypadkach, w celu
oznaczenia stÄ™\
enia próbki metodą kolorymetryczną potrzebny jest standard, który słu\
y do
przygotowania tzw. krzywej standardowej (wzorcowej).
Krzywa kalibracyjna (wzorcowa)
Krzywa kalibracyjna podaje zale\
ność między absorbancją a stę\
eniem lub licznością
substancji w próbce (jeśli roztwór podlega prawu Lamberta-Beera, krzywa kalibracyjna jest
linią prostą przechodzącą przez punkt przecięcia się osi układu współrzędnych).
Przygotowuje się ją przez wykonanie pomiarów absorbancji dla kilku lub kilkunastu stę\
eń
wzorca i wykreśla się krzywą odkładając na osi odciętych stę\
enia lub ilość substancji,
1
Je\
eli stÄ™\
enie wyra\
amy w gramach na litr roztworu, a grubość warstwy absorbującej w centymetrach,
to współczynnik ten nosi nazwę właściwego współczynnika absorpcji (E).
Ćwiczenie 10 Enzymologia 2010
1
Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych z Enzymologii
a na osi rzędnych  odpowiednie wartości absorbancji (Rys.1.). Stę\
enie substancji w próbie
badanej odczytuje się z krzywej kalibracyjnej przez interpolację, biorąc pod uwagę wartość
absorbancji tej próby.
Rys.1. Krzywa kalibracyjna
Nale\
y pamiętać, aby standard przygotowywać zawsze  na świe\
o i w identycznym buforze
jak oznaczana próbka [1].
Fosfor (gr. phosphoros  "niosący światło")
Fosfor nale\
y do grupy makroelementów. W organizmie człowieka znajduje się około 700 g
fosforu, z czego 75 % występuje w kościach, a pozostała cześć rozmieszczona jest w
mięśniach, układzie nerwowym, we krwi i innych płynach ustrojowych. Związki fosforu
odgrywajÄ… podstawowÄ… rolÄ™ w przemianach energetycznych ustroju, w utrzymaniu
równowagi kwasowo-zasadowej (działają jako bufory), wzmagają pobudliwość
nerwowo-mięśniową i są składnikami tak wa\
nych fizjologicznie związków jak: kwasy
nukleinowe, białka, koenzymy czy lipidy zło\
one [4, 5, 6, 7].
Oznaczanie grup fosforanowych
Grupy fosforanowe oznacza się wyłącznie metodami kolorymetrycznymi i tylko w formie
ortofosforanowej (V). Ogólna zasada oznaczania polega na wytwarzaniu się w środowisku
kwasowym w reakcji z molibdenianem (VI) amonu cztero(trójmolibdeniano)fosforanu
amonowego (NH4)3P(Mo3O10)4, który mo\
e być redukowany do błękitu molibdenowego
(mieszanina ni\
szych tlenków molibdenu) o niebieskim zabarwieniu. Poszczególne metody
ró\
nią się od siebie tylko warunkami redukcji. Jako reduktory stosowane są najczęściej:
eikonogen (kwas 1-amino-2-naftalo-4-sulfonowy), chlorek cyny(II), amidol, hydrochinon
i kwas askorbinowy [2, 3].
Ćwiczenie 10 Enzymologia 2010
2
Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych z Enzymologii
2. Cel ćwiczenia:
Zapoznanie się z metodą oraz określenie stę\
enia grup fosforanowych w próbce otrzymanej
do analizy.
3. Odczynniki, szkło, aparatura:
1 M HCl,
1 M KH2PO4 (roztwór wzorcowy),
10 % roztwór wodny kwasu askorbinowego,
0,42 % roztwór molibdenianu amonu w 0,5 M H2SO4 (1:6 v/v),
próbka do analizy,
Å‚az
nia wodna,
spektrofotometr,
kuwety pomiarowe,
parafilm,
zlewki,
probówki.
4. Sposób wykonania ćwiczenia
Uwagi:
Zanotować numer próbki otrzymanej.
Przed wykonaniem ćwiczenia umyć probówki dobrze wypłukując detergent
(niektóre detergenty mogą zawierać fosforany!).
Wykonać wszelkie obliczenia potrzebne do wykonania ćwiczenia (wyjaśnia
prowadzÄ…cy).
Próbki potrzebne do przygotowania krzywej standardowej oraz próbkę analizowaną
nale\
y przygotowywać równolegle.
Oprócz próbek wzorca i do analizy nale\
y przygotować dwa odnośniki potrzebne przy
zerowaniu aparatu ( próbka 0 ).
Krzywa standardowa:
Roztworem wzorcowym jest 1M roztwór KH2PO4.
W celu sporzÄ…dzenia krzywej standardowej nale\
y przygotować szereg rozcieńczeń
(6-10) roztworu wzorcowego (0,1  1 mM; 5-50 nmola) w objÄ™toÅ›ci koÅ„cowej 50 µl.
Wykonać test według podanego poni\
ej przepisu.
Ćwiczenie 10 Enzymologia 2010
3
Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych z Enzymologii
Przygotowanie próbki analizowanej:
Zaplanować cztery rozcieńczenia próby badanej, tak aby znalez
ć się w przedziale
krzywej standardowej .
Wykonanie testu:
Przygotować zaplanowane rozcieńczenia wzorca i próby badanej w wysokich
probówkach (proszę pamiętać o przygotowaniu 2 probówek na odnośnik potrzebny do
zerowania aparatu).
Do wszystkich probówek dodać po 300 µl 1M HCl.
Umieścić probówki we wrzącej łaz
ni wodnej i ogrzewać przez 15 minut.
Po ostudzeniu, dodać po 700 µl mieszaniny: 10 % wodnego roztworu kwasu
askorbinowego i 0,42 % roztworu molibdenianu amonu w 0,5 M H2SO4
(1:6 v/v).
Próbki przenieść do łaz
ni wodnej o temperaturze 45°C i inkubować przez 20 minut.
Do ka\
dej probówki dodać 1 ml wody destylowanej.
Odczytać absorbancję przy długości fali 820 nm wobec  próbki 0 .
Aby oznaczyć stę\
enie jonów fosforanowych w próbce, nale\
y wykreślić krzywą
standardową i na jej podstawie określić stę\
enie roztworu wyjściowego próby badanej.
5. Opracowanie wyników
Wyniki nale\
y opracować w postaci sprawozdania, które powinno składać się z pięciu części:
protokołu, przykładowych obliczeń, wyników z ich opracowaniem, obserwacji i wniosków.
W sprawozdaniu, proszę koniecznie wpisać imię i nazwisko wszystkich osób z trzyosobowej
grupy, dzień tygodnia i godzinę zajęć, datę wykonania ćwiczenia oraz nazwisko osoby, do
której są Państwo zapisani na zajęcia.
6. Literatura
1.  Ćwiczenia z biochemii pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz PWN W-wa 2003
2. Chen, P.S., Toribara, T.Y. i Warner, H., (1956)  Microdetermination of phosphorus.
Analyt.Chemistry 28:1756-58
3. Ames, B.N. i Dubin, D.T., (1960)  The Role of Polyamines in the Neutralization
of Bacteriophage Deoxyribonucleic Acid. J Biol Chem 235(3), 769-775
4. Yu, G.C. i Lee, D.B. (1987)  Clinical disorders of phosphorus metabolism.
West J Med. 147(5):569-76
5. Cashman, K.D. i Flynn, A. (1999)  Optimal nutrition: calcium, magnesium and
phosphorus. Proc Nutr Soc. 58(2):477-87
6. Berndt, T.J., Schiavi, S. i Kumar, R. (2005)  "Phosphatonins" and the regulation
of phosphorus homeostasis. Am J Physiol Renal Physiol. 289(6):F1170-82
7. Shaikh, A., Berndt, T. i Kumar, R. (2008)  Regulation of phosphate homeostasis
by the phosphatonins and other novel mediators. Pediatr Nephrol. 23(8):1203-10.
Ćwiczenie 10 Enzymologia 2010
4