Preparatyka alkaloidów sporyszu

Ergotamina z przetrwalników sporyszu:

Odczynniki:

100 g kwasu winowego
50 g ziemi okrzemkowej
papierek wskaźnikowy uniwersalny
2000 ml trójchloroetanu,
bibuła filtracyjna
50 ml eteru etylowego

Preparatyka:

50 g surowca rozdrobnić w moździerzu i wymieszać na rzadką papkę z 10% wodnym roztworem
kwasu winowego całość macerować przez 10 godzin. Zarówno macerację, jak i dalszy proces
wyodrębniania prowadzić bez dostępu światła dziennego. Następnie surowiec przenieść do
perkolatora i wolno eluować 1% roztworem kwasu winowego (wystarcza 3000 ml
roztworu),Wyciąg przesączyć na lejku Buchnera przez ziemie okrzemkową, zmieszaną z 1%
roztworem kwasu winowego. Przesącz przy ciągłym mieszaniu doprowadzić za pomocą stężonego
amoniaku do pH 7. Wartość pH jest czynnikiem warunkującym przejście ergotaminy do
trójchloroetanu, inne alkaloidy w tych warunkach pozostają w roztworze wodnym. Zobojętniony
wyciąg wyczerpywać dwukrotnie trójchloroetanem, biorąc na 5 części wyciągu 1 część
rozpuszczalnika. Połączone roztwory organiczne przesączyć i dodać wyliczoną z zawartości
ergotaminy w surowcu stechiometryczną ilość 2% kwasu winowego.Rozpuszczalnik oddestylować
pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 30°C - 35°C do objętości kilku ml.W czasie
zagęszczania krystalizuje winian ergotaminy, który należy zebrać na saczku G 2 i przemyć eterem
etylowym

Uwagi:

Zawartość ergotaminy w surowcu wynosi 0,3% do 0,4%.
Metoda tą, uzyskuje się 90% ergotaminy w stosunku do
oznaczonej analitycznie zawartości. Winian ergotaminy
należy chronić przed światłem, wilgocią i wysoką temperaturą.
Przechowuje się w ampułkach z ciemnego szkła wypełnionych
gazem obojętnym np. azotem lub dwutlenkiem
węgla.

Piśmiennictwo
K.Macek, S.Vanecek, Pharmazie, 10, 422 (1955)
H.Speichert, praca doktorska pt. Badania sporyszu, Poznań, 1961
H. Gertid i Z. Kowalewski, Preparatyka fitochemiczna

Wyodrębnianie alkaloidów sporyszowych

Surową mieszaninę pochodnych-DNF można otrzymać bezpośrednio z surowca roślinnego, jak
ilustruje to przykład wyodrębniania ze sporyszu.

1g nieodtłuszczonego sporyszu mieszano z równą ilością piasku, po czym ekstrahowano przez
trzykrotne jednogodzinne wytrząsanie z wodą (po 12ml). Po dodaniu 2ml czterochlorku węgla i
krótkim wirowaniu oddzielano warstwę wodną. Połączone wodne ekstrakty zakwaszono 1n
kwasem solnym, odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem (w temp. do 60*C) do objętości 15-
20ml, po czym zobojętniono wodorowęglanem sodowym. W celu usunięcia wpływu jonów metali
dodano 0,6g wodorowęglanu sodowego i 0,1g EDTA (kwas etylenodwuaminoczterooctowy), po
czym mieszając dodano 15kropli 1-fluoro-2,4-dwunitrobenzenu w 30ml acetonu i wytrząsano przez
3h. Dla usunięcia nadmiaru odczynnika dodano roztworu 0,2g kwasu 4-hydroksybenzoesowego i
wodorowęglanu sodowego w 5ml wody i ponownie wstrząsano przez 3h. Po przemyciu w
rozdzielaczu wodą ekstrahowano trzykrotnie eterem. Wyciąg eterowy przemyto 1%-owym
amoniakiem i wodą. Po wysuszeniu (Na2SO4) i oddestylowaniu rozpuszczalnika pozostałość
rozpuszczono w 1ml acetonu i wprowadzono do krótkiej kolumny zawierającej 4-5g bezwodnego
siarczanu sodu. Po usunięciu acetonu strumieniem powietrza kolumnę tę połączono z krótką rurką
do chromatografii wypełnioną 6ml zasadowego tlenku glinu (Woelm), umieszczając na wierzchu
4ml bezwodnego siarczanu sodu. Do rozwijania chromatogramu stosowano mieszaninę chlorek
metylenu/czterochlorek węgla (1:1), którą wprowadzono do górnej kolumny z siarczanem sodu.
Pierwsze 15ml eluatu stanowi frakcję 1 (DNF-pochodne monoalkiloamin i DNF-pochodna
amoniaku). Z kolei rozwijano chlorkiem metylenu (20ml). Po zebraniu 6ml eluatu frakcja 2-DNF-
amoniaku zbierano frakcję 3bis-DNF-histaminy i DNF-etanoloaminy.

Temperatury topnienia pochodnych-DNF-amin.

Amina tt.*C

Metyloamina 175*C
Dwumetyloamina 74*C
Etyloamina 115*C
Dwuetyloamina 69*C
n-Propyloamina 95*C
izo-Propyloamina 95*C
n-Butyloamina 89*C
izo-Butyloamina 79*C
2-Metylobutyloamina 49*C
izo-Amyloamina 91*C
Etanoloamina 92*C
B-Fenyloetyloamina 155*C
Tyramina 156*C
Pirolidyna 102*C
Piperydyna 95*C
Tryptamina 217*C

Wyodrębnienie związków jednorodnych z frakcji amin oddzielonych za pomocą soli Reineckego
lub innych opisanych poprzednio odczynników uzyskuje się stosując chromatografię kolumnową i
rozdzielenie między nie mieszające się rozpuszczalniki.

Piśmiennictwo:
Z.Jerzmanowska "Substancje roślinne metody wyodrębniania", PWN, Warszawa 1969

Sporządzanie wyciągu sporyszowego suchego
Wyciąg sporyszowy suchy

Syn.: Extractum Fungi Secalis. Extractum Ergotae.

Postać i właściwości. Czerwonobrunatny proszek o swoistym zapachu i słodkawo-kwaśno-
gorzkawym smaku; z wodą daje mętny roztwór. Powinien zawierać nie mniej niż 0,085% i nie
więcej niż 0,115% alkaloidów obliczonych jako ergotamina.

Przygotowanie.

Secale cornutum (sito IV) ............... 100 cz.
Aether Petrolei seu Benzinum ............ q. s.
Acidum tartaricum ....................... 0,4 cz.
Spiritus 95° ............................ 460 ,,
Aqua .............................. 540 ,,
Saccharum .............................. q.s.

100 cz. grubo sproszkowanego sporyszu umieścić w perkolatorze i zalać eterem naftowym lub
benzyną tak, aby płyn zwilżył dokładnie surowiec i utworzył nad nim warstwę wysokości 1 cm.
Pozostawić na 24 godziny i oddzielać płyn wyciągowy badając go tak długo, dopóki 5 ml płynu
wyciekającego z perkolatora, po odparowaniu na szkiełku zegarkowym, pozostawi zaledwie
dostrzegalną pozostałość. Surowiec silnie wycisnąć i uwolnić od resztek eteru naftowego lub
benzyny w temperaturze nie wyższej niż 40°. Następnie zwilżyć surowiec 40 cz. mieszaniny
spirytusu 95° z wodą, w której rozpuszczono kwas winowy po czym wytrawić przez perkolację
przepisaną mieszaniną spirytusu 95° z wodą.
Koniec wytrawienia stwierdzić w sposób następujący: 1 ml perkolatu po zmieszaniu z 2 ml
odczynnika Allporta i odstawieniu na 30 minut nie powinien zabarwić się na kolor słaboniebieski.
Zebrany płyn wyciągowy zagęścić pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze nie wyższej niż
40°, dodać 15 cz. cukru i odparować w tych warunkach do stanu suchego. W otrzymanym wyciągu
suchym oznaczyć zawartość alkaloidów; w razie potrzeby dodać tyle cukru, aby wyciąg zawierał
0,1% alkaloidów.
Oznaczanie zawartości. Odważyć z dokładnością do 0,01 g około 4 g suchego wyciągu
sporyszowego, rozpuścić w 10 ml mieszaniny 1 cz. wody i 1 cz. spirytusu 95°, wykłócać przez 10
minut, a następnie ogrzewać przez 5 minut na łaźni wodnej ogrzanej do temp. 45°, po czym
ochłodzić i przesączyć. Odmierzyć 7 ml przesączu i przepuścić do kolby ssawkowej przez kolumnę
chromatograficzną, zawierającą 10 g tlenku glinowego. Kolumnę popłukać 1 ml wody, a następnie
70 ml eteru, dolewając go tyle, aby kolumna była zawsze napełniona. Zawartość kolby próżniowej
przenieść do rozdzielacza, popłukać kolbę próżniową kilkunastoma mililitrami eteru. Ciecz w
rozdzielaczu wykłócać w ciągu 10 minut, po odstaniu się cieczy oddzielić warstwę wodną. Warstwę
eterową wykłócać w rozdzielaczu z 1% roztworem kwasu winowego, biorąc kolejno po 50, 10 i 10
ml. Z połączonych kwaśnych wyciągów usunąć eter przez ogrzanie do temperatury około 35° pod
zmniejszonym ciśnieniem, a następnie dopełnić je wodą do 100 ml w kolbie miarowej.
Do 1 ml tego roztworu dodać 2 ml odczynnika Allporta, odstawić na 30 minut (przy świetle
dziennym) i porównywać zabarwienie z wzorcami barwnymi umieszczonymi również w
probówkach ze szkła bezbarwnego o jednakowym przekroju wewnętrznym. Probówki oglądać w
świetle padającym, na tle białej bibuły.
Wzorce barwne otrzymuje się przez zmieszanie podanej w tabeli ilości "roztworu C" z
odpowiednią ilością świeżo przegotowanej i ostudzonej wody. Jeżeli np. 1 ml badanego roztworu
po dodaniu 2 ml odczynnika Allporta ma po upływie pół godziny to samo zabarwienie co wzorzec
IV, to w 1 ml tego roztworu znajduje się 0,05 mg alkaloidów sporyszu obliczonych jako
ergotamina.

----------------------------------------------------------------
Wzorzec nr I II III IV V
----------------------------------------------------------------
ml r-ru C 0,64 0,88 1,08 1,25 1,40
ml H2O 2,36 2,12 1,92 1,75 1,60
----------------------------------------------------------------
mg alkaloidów
w 1 ml 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06

Zawartość probówki nie powinna być jaśniejsza od wzorca IV, czyli sporysz powinien zawierać nie
mniej niż 0,05% alkaloidów obliczonych jako ergotamina.
Zawartość wody nie większa niż 3%

Uwaga. Jeżeli zawartość probówki badanej jest ciemniejsza niż wzorzec V, należy roztwór z kolby
miarowej rozcieńczyć wodą w stosunku 2+1 lub 1+1, do rozcieńczonego roztworu dodać 2 ml
odczynnika Allporta.

Odczynniki
Podstawowy roztwór siarczanu miedziowego. Rozpuścić 20 g siarczanu miedziowego w 30 ml
rozcieńczonego kwasu solnego i dopełnić wodą do 100 ml.
Roztwór A. Rozpuścić w kolbie miarowej na 100 ml 16 g azotanu amonowego w niewielkiej ilości
wody, dodać 3 ml podstawowego roztworu siarczanu miedziowego, 6 ml amoniaku i dopełnić wodą
do 100 ml. Przyrządzać ex tempore.
Roztwór B. Rozpuścić w kolbie miarowej na 100 ml 6,5 g azotanu kobaltowego i dopełnić wodą do
kreski.
Roztwór C. Zmieszać 30 ml roztworu A i 4 ml roztworu B.
Przyrządzać ex tempore i używać dopiero po upływie 30 minut od chwili zmieszania.
Odczynnik Allporta
0,125 g aldehydu p-dwumetyloaminobenzoesowego rozpuścić w oziębionej mieszaninie 65 ml
kwasu siarkowego i 35 ml wody i dodać 0,1 ml 5% roztworu chlorku żelazowego. Używać
następnego dnia po przyrządzeniu. Odczynnik nadaje się do użytku tylko w ciągu 7 dni.

Przechowywanie.
Przechowywać w naczyniach szczelnie zamkniętych, nad tlenkiem wapniowym, w chłodnym
miejscu. Chronić od światła.
Należy do wykazu B.
Najwyższa dawka jednorazowa 0,5 g.
Najwyższa dawka dzienna 1,5 g.

Literatura:
Muszyński J.: Farmakopea polska III, Warszawa 1954, PZWL, str. 228-229 (monografia Extractum
Secalis cornuti siccum ).

Izolacja alkaloidów sporyszowych
Sposób wyodrębniania alkaloidów sporyszowych ze sporyszu

PRZYKŁADY

Przykład 1

Około 20,000 kg sporyszu (rasy ergokrystynowej GAL 130) ekstrahowano w przeciwprądzie za
pomocą mieszaniny toluenu i etanolu 87:13 (v/v) w ekstraktorze ciągłym typu karuzelowego.
Otrzymano w przybliżeniu 64 m3 ekstraktu pierwotnego. Następnie ekstrakt pierwotny
ekstrahowano w ekstraktorze ciągłym Westfalia za pomocą mieszaniny etanolu i wody 1:1 (v/v),
zawierającej 0.2% (w/w) chlorowodoru. Otrzymano w przybliżeniu 28 m3 wodnego ekstraktu.
Wodny ekstrakt zalkalizowano do pH około 7.3 za pomocą 5% (w/w) roztworu wodnego
wodorotlenku sodu i ekstrahowano za pomocą toluenu w ekstraktorze ciągłym Westfalia.
Otrzymano około 16 m3 toluenowego ekstraktu. Toluenowy ekstrakt odparowano do około 1000 kg
i otrzymany krystaliczny produkt odsączono, przemyto za pomocą toluenu i suszono przez 3
godziny w suszarni próżniowej w 60°C i 50 mbar, do uzyskania 152 kg pierwszego rzutu surowej
ergokrystyny. Ciecze macierzyste odparowano do około 400 kg i dodano 1500 l technicznego
heksanu. Wytrącony krystaliczny produkt odsączono, przemyto za pomocą technicznego heksanu i
wysuszono, do uzyskania 89 kg drugiego rzutu surowej ergokrystyny.
Wyniki analityczne:

-------------------------------------------------------
Pierwszy rzut Drugi rzut
-------------------------------------------------------
Analiza przez miareczkowanie 93.1% 92.6%
-------------------------------------------------------
Ergokrystyna 30.9% 20.0%
-------------------------------------------------------
Ergokrystynina 59.3% 36.6%
-------------------------------------------------------
alfa-ergokryptyna 2.4% 10.5%
-------------------------------------------------------
alfa-ergokryptynina 3.9% 17.2%
------------------------------------------------------
Suma innych alkaloidów 2.6% 15.7%
-------------------------------------------------------

Przykład 2
Około 20,000 kg sporyszu (rasy ergotaminowej GAL 404) ekstrahowano w przeciwprądzie za
pomocą mieszaniny toluenu i etanolu 84:16 (v/v) w ekstraktorze ciągłym typu karuzelowego, i
otrzymano 78 m3 ekstraktu pierwotnego. Ekstrakt pierwotny ekstrahowano w ekstraktorze ciągłym
Westfalia za pomocą mieszaniny etanolu i wody 6:4 (v/v), zawierającej 0.2% (w/w) chlorowodoru i
otrzymano 18 m3 wodnego ekstraktu. Wodny ekstrakt zalkalizowano przez wzrost jego pH do 7.3
przez dodanie 5% (w/w) roztworu wodnego wodorotlenku sodu. Następnie ekstrahowano go za
pomocą toluenu w ekstraktorze ciągłym Westfalia. Otrzymano 30 m3 toluenowego ekstraktu.
Toluenowy ekstrakt odparowano do około 1000 kg i otrzymany krystaliczny produkt odsączono,
przemyto za pomocą toluenu, i suszono przez 3 godziny w suszarni próżniowej w 60°C i 50 mbar,
uzyskujac około 181 kg pierwszego rzutu surowej ergotaminy. Ciecze macierzyste odparowano do
około 100 kg i krystaliczny produkt odsączono, przemyto za pomocą toluenu, i wysuszono,
uzyskując w ten sposób 19 kg drugiego rzutu surowej ergotaminy.

Wyniki analityczne:

-------------------------------------------------------
Pierwszy rzut Drugi rzut
-------------------------------------------------------
Analiza przez miareczkowanie 95.0% 90.6%
-------------------------------------------------------
Ergotamina 24.7% 31.5%
------------------------------------------------------
Ergotaminina 71.7% 51.5%
-------------------------------------------------------
Suma innych alkaloidów 3.6% 17.0%
-------------------------------------------------------

Przykład 3

Około 20,000 kg sporyszu (rasy ergotoksynowej GAL 310) ekstrahowano w przeciwprądzie za
pomocą mieszaniny toluenu i etanolu 87:13 (v/v) w ekstraktorze ciągłym typu karuzelowego.
Otrzymano w przybliżeniu 69 m3 ekstraktu pierwotnego. Ekstrakt pierwotny ekstrahowano w
ekstraktorze ciągłym Westfalia za pomocą mieszaniny etanolu i wody 1:1 (v/v), zawierającej 0.2%
(w/w) chlorowodoru otrzymujac 27 m3 wodnego ekstraktu. Wodny ekstrakt zalkalizowano przez
wzrost pH wodnego ekstraktu do około 7.3 za pomocą 5% (w/w) wodnego wodorotlenku sodu.
Następnie ekstrahowano go za pomocą toluenu w ekstraktorze ciągłym Westfalia do otrzymania
około 17 m3 toluenowego ekstraktu. Toluenowy ekstrakt odparowano do około 800 kg i dodano
1800 l technicznego heksanu. Wytrącony krystaliczny produkt odsączono, przemyto za pomocą
technicznego heksanu, i suszono przez 3 godziny w suszarni próżniowej w 60°C i 50 mbar
uzyskujac 151 kg surowej ergotoksyny.

Wyniki analityczne:
---------------------------------------
Analiza przez miareczkowanie 94.4%
---------------------------------------
Ergokornina 18.1%
---------------------------------------
Ergokorninina 29.2%
---------------------------------------
alfa-ergokryptyna 11.7%
---------------------------------------
alfa-ergokryptynina 18.5%
---------------------------------------
Beta-ergokryptyna 6.3%
---------------------------------------
Beta-ergokryptynina 11.6%
---------------------------------------
Suma innych alkaloidów 4.6%
---------------------------------------
Temperatura procesu ekstrakcyjnego jest przeważnie nieograniczona, ponieważ zwykle niechciana
izomeryzacja ergopeptyn, która może zajść w wysokiej temperaturze, nie wstrzymuje krystalizacji
pożądanego produktu. Niemniej jednak, temparatura wyższa niż około 50°C jest nie ekonomiczna.
W wybranej odmianie sporysz ekstrahuje się za pomocą mieszaniny toluen/etanol w zakresie
temperatury pomiędzy około 20,25,30,35,40,45, do 50°C, przy wybranej temperaturze otoczenia.

Piśmiennictwo: Process for isolation of ergot alkaloids from ergot, EP 1 742 953 B1, Inventors:
CVAK, Ladislav 746 01 Opava (CZ); HOLAN, Jiri 747 05 Opava (CZ); RODER, Lubomir 746 01
Opava (CZ).