Reaktywne formy tlenu (RFT)

Reactive oxygen species (ROS)

Stres oksydacyjny w komórkach roślinnych, H

2

O

2

jako cząsteczka sygnalna

Cząsteczki sygnałowe

– reaktywne formy tlenu (ROS):

H

2

O

2

(nadtlenek wodoru)

O

2

-.

(rodnik ponadtlenkowy)

OH

-

(rodnik hydroksylowy)

– reaktywne formy azotu (RNS):

NO (tlenek azotu)

ONOO

-

(rodnik peroksynitrylowy)

GSNO (nitrozoglutation)

Co to są reaktywne formy tlenu ?

• Tlen cząsteczkowy jest utleniaczem: reagując ze związkami

organicznymi, utlenia je, pobierając od nich elektrony, a sam

ulega redukcji.

• Całkowita redukcja O

2

oznacza przyłączenie 4 protonów i

4 elektronów, powstają wówczas 2 cząsteczki H

2

O.

• Cząsteczka tlenu, nie zawsze ulega pełnej, 4-elektronowej

redukcji.

Rodnik

– atom lub cząsteczka zdolna do

samodzielnego istnienia, mająca 1 lub więcej

niesparowanych elektronów.

Wolne rodniki

są reaktywne, ponieważ dążą do

sparowania elektronów (pozbycia się nadmiaru, lub

przyłączenia dodatkowego elektronu).

Reaktywne formy tlenu

są produktami kolejnych

stopni redukcji cząsteczki tlenu.

Reaktywne formy tlenu (ROS)

• wolne rodniki

• nie

rodnikowe

pochodne tlenu

O

2

.-

ponadtlenkowy

.

OH

hydroksylowy

H

2

O

2

nadtlenek wodoru

O

3

ozon

1

O

2

tlen singletowy

Anionorodnik ponadtlenkowy

O

2

-

–Stosunkowo szybko

reaguje ze związkami zawierającymi grupy tiolowe, i białkami
zawierającymi centra żelazowo-siarkowe

Szybko reaguje ze związkami redukującymi: askorbinianem, NADH,
jonami metali Fe i Cu, a więc też z metaloproteinami.

Jest dość trwały w fizjologicznym pH, może dyfundować na znaczne
odległości, jak też przenikać przez błony komórkowe (niezbyt łatwo).

Rodnik hydroksylowy •HO

-

jeden z najbardziej

reaktywnych utleniaczy.

Ma bardzo wysoki potencjał redoks, a więc silne właściwości utleniające.
Reaguje praktycznie ze wszystkimi substancjami występującymi w
organizmie i to bardzo szybko.

Nadtlenek wodoru H

2

O

2

– Cząsteczka sygnalna

Nie jest zbyt reaktywną formą tlenu

. Przy pH zbliżonym do

obojętnego może utleniać grupy tiolowe, indolowe,

imidazolowe, fenolowe i tioestrowe.

Biologicznie istotne znaczenie ma utlenianie grup tiolowych

oraz utlenianie jonów metali przejściowych (Fe

2+

do Fe

3+

i Cu

+

do Cu

2+

), co prowadzi do powstawania rodnika

hydroksylowego.

Fe

2+

+ H

2

O

2

→

•

OH + OH

-

+ Fe

3+

Cu

+

+ H

2

O

2

→

•

OH + OH

-

+ Cu

2+

H

2

O

2

–

jest stosunkowo mało reaktywny, łatwo

przenikający przez błony biologiczne, może się

pojawiać w dużych odległościach od miejsca

powstania.

Ozon

Ozon w stratosferze (15-50 km od powierzchni Ziemi)

pochłania promieniowanie nadfioletowe C (200-280 nm) i

nadfioletowe B (280-320)

Ozon w atmosferze zadymionych miast – jako

składnik smogu - ma działanie niszczące jak inne

reaktywne formy tlenu

Niektóre efekty działania ROS na komórki i ich

składniki:

• Utlenianie związków niskocząsteczkowych: glutation,

askorbinian, NADH

• Inaktywacja enzymów

• Inaktywacja białek transportowych

• Uszkodzenia kwasów nukleinowych

• Peroksydacja lipidów błonowych

• Zahamowanie fosforylacji oksydacyjnej

• Zaburzenia wewnątrzkomórkowej homeostazy Ca

2+

• Zaburzenia struktury cytoszkieletu (polimeryzacja aktyny,

rozerwanie mikrofilamentów)

• Powstawanie mutacji

Miejsca produkcji ROS w komórce

roślinnej

Chloroplasty

Mitochondria

Peroksyzomy

, Endoplazmatyczne Reticulum,

Glioksyzomy

Błona komórkowa (oksydazy NADPH),

Apoplast (peroksydaza)

Główne źródła ROS w fotosyntetyzującej

komórce mezofilowej roślin o fotosyntezie C3

Uproszczony schemat powstawania ROS w komórce mezofilowej rośliny o

fotosyntezie C3 zmodyfikowane w.g. Ślesak i inni 2007 Acta Biochim. Pol. 54: 39-50.

mitochondrium

peroksysom

chloroplast

PSII

PSI

O

2

•-

H

2

O

2

SOD

Wiązanie CO

2

fotooddychanie

glikolan

gliksalan

glicyna

H

2

O

2

glicyna

seryna

NADH

NADH

Cykl

TCA

O

2

•-

H

2

O

2

Oksydaza

NADPH

O

2

•-

H

2

O

2

Peroksydazy ściany komórkowej

światło

Ściana komórkowa

4030 nmol m

-2

s

-1

10 000 nmol m

-2

s

-1

200 nmol m

-2

s

-1

Stężenie ROS w komórce roślinnej

• Produkcja ROS w

nie pobudzanych

komórkach

240 µM s

-1

O

2

-

• W czasie stresu
produkcja ROS
240-720 µM s

-1

O

2

-

• stężenie H

2

O

2

0,5 µM

• stężenie H

2

O

2

5 -15 µM

W czasie jakich reakcji powstają ROS w

odpowiedzi na stres ?

• Fotooddychanie
• Oddychanie mitochondrialne
• Oksydaza NADPH

(błony komórkowe, plazmalema)

• Peroksydazy w apoplaście
• Peroksydacja lipidów

Stres oksydacyjny to stan

braku równowagi

pomiędzy produkcją

reaktywnych form tlenu

(ROS), a zdolnością do

ich szybkiej detoksykacji,

detoksykacji powstających

toksycznych produktów

lub naprawy wyrządzonych

szkód.

Nadprodukcja i

nagromadzanie ROS

powoduje oksydacyjne

uszkodzenia składników

komórki, a szczególnie

białek, lipidów i DNA.

Co to jest stres oksydacyjny?

Mechanizmy

detoksykacji ROS i

naprawy uszkodzeń

ROS

Stres

oksydacyjny

Zmodyfikowane w.g. Bartosz 2003

Źródła powstawania ROS w komórkach

roślinnych

ROS

Miejsce syntezy i reakcja w której powstaje ROS

Tlen singletowy

1

O

2

Chloroplast, fotoukład PSII

Anionorodnik

ponadtlenkowy O

2

•-

Mitochondria – łańcuch transportu elektronów

Chloroplasty – reakcja Mehlera, fotoukład PSII

Ściana komórkowa- peroksydazy ściany komórkowej

Błona komórkowa – oksydaza NADPH

Nadtlenek wodoru H

2

O

2

Peroksysomy – fotooddychanie

Chloroplasty – łańcuch transportu elektronów

Glioksysomy - β-oksydacja kwasów tłuszczowych

Ściana komórkowa – redukcja anionorodnika

ponadtlenkowego

Rodnik hydroksylowy

•

HO

Chloroplast – fotoukład PSII, reakcja Fentona redukcja

H

2

O

2

w obecności Fe

2+

Stresy

stymulują produkcję ROS w komórce

roślinnej wywołując

wtórny stres oksydacyjny

.

Poziom stresu zależy od funkcjonowania systemu

antyoksydacyjnego.

ROS

susza

Intensywne PAR

Uszkodzenia mechaniczne, zranienie

metale ciężkie

niska lub wysoka temperatura

patogeny

nodulacja

starzenie

lignifikacja

postanoksja,

posthypoksja

Stres

oksydacyjny

Enzymy komórkowego systemu

antyoksydacyjnego

•

Dysmutaza ponadtlenkowa
(SOD),

•

Katalaza (CAT),

•

Peroksydaza glutationowa,
(GPX)

•

Peroksydaza askorbinianowa
(APX),

•

Reduktaza glutationowa (GR)

•

Reduktaza
monodehydroksyaskorbinian
u (MDHAR)

•

Reduktaza
dehydroksyaskorbinianu(DHA
R)

Systemy antyoksydacyjne współdziałające

w usuwaniu ROS w chloroplastach tzw. cykl

Halliwella-Asady (askorbinianowo-

glutationowy).

SOD

APX

MDHAR

GR

DHAR

askorbinian

H

2

O

2

H

2

O

CAT

Podstawowe mechanizmy enzymatyczne

usuwania ROS w komórkach roślinnych

enzym

Usuwana forma

ROS (produkt

reakcji)

Lokalizacja

komórkowa

Dysmutaza ponadtlenkowa

O

2

•-

(H

2

O

2

)

Chl, Cyt, Mit,

Per

katalaza

H

2

O

2

(H

2

O)

Mit? Per

peroksydaza

H

2

O

2

(H

2

O)

Wiele lokalizacji

cykl

glutationowo/askorbinianowy

H

2

O

2

(H

2

O)

Chl, Mit, Per

peroksydaza glutationowa

H

2

O

2

(H

2

O)

Chl, cyt, ER, Mit

Reduktaza glutationowa, redukuje GSSG do GSH i zapewnia funkcjonowanie

peroksydazy glutationowej

Reakcje katalizowane przez podstawowe

enzymy systemu antyoksydacyjnego

Dysmutaza ponadtlenkowa:
O

2

•-

+O

2

•-

+ 2H+ → H

2

O

2

+ O

2

Katalaza:
2H

2

O

2

→ 2H

2

O+ O

2

Peroksydaza glutationowa:

2GSH+ H

2

O

2

→GSSG+2H

2

O

Reduktaza glutationowa
GSSG+NADPH + H

+

→2GSH+H

+

GSSG – utleniona forma glutationu (związek niebezpieczny dla komórki bo utlenia

grupy tiolowe białek, prowadząc do powstawania mostków disulfidowych.

GSH - zredukowana forma glutationu (antyoksydant).

Peroksydaza askorbinianowa:

askorbinian + H

2

O

2

→ dehydroaskorbinian + 2 H

2

O

Enzymy antyoksydacyjne i opis ich aktywności

katalitycznej

katalaza

Odpowiada za zmiatanie H

2

O

2

, do swej aktywności

nie wymaga antyoksydantów cząsteczkowych

Peroksydaza
glutationowa

Odpowiada za zmiatanie H

2

O

2

,

wymaga obecności GSH

Odpowiada za zmiatanie O

2

•-

, nie potrzebuje

antyoksydantów cząsteczkowych

Dysmutaza ponadtlenkowa

Reduktaza glutationowa

Zapewnia odtwarzanie GSH z

GSSG, zużywa NADPH

• ASKORBINIAN (ASA- witamina C)

• GLUTATION (GSH)

• TOKOFEROL (α-tokoferol-witamina E)

• FLAWONOIDY

• KAROTENOIDY

Stosunek zawartości zredukowanej formy

antyoksydanta do utlenionej formy antyoksydanta

jest sygnałem modulującym mechanizmy

zmiatania ROS.

Antyoksydanty cząsteczkowe

(nieenzymatyczne) pełniące rolę zmiataczy lub

wychwytywaczy ROS

Stężenie H

2

O

2

w komórce

jest kontrolowane przez
system antyoksydacyjny,
który składa się z:
■

szeregu enzymów

i

■

antyoksydantów

.

Transport H

2

O

2

przez:

• peroksypory
• akwaporyny

ROS odgrywają podwójną

rolę - cząstek

toksycznych i

sygnalnych.

ROS pełnią funkcję cząsteczek sygnałowych

H

2

O

2

uczestniczy w regulacji

szeregu procesów

fizjologicznych np. takich jak:

• Ruchy aparatów szparkowych

indukowane obecnością kwasu

abscysynowego (ABA)

• Reakcja grawiropiczna korzeni

w odpowiedzi na auksynę (IAA)

• Kiełkowanie nasion
• Starzenie liści i nasion
• Reakcja rośliny na patogeny

bodziec

ROS

Czynnik

transkrypcyjny

Fosfatazy +

Kinazy MAP

Odpowiedź

fizjologiczna

Aktywacja genu

Udział stresu oksydacyjnego w biotycznych i

abiotycznych stresach

• Stres abiotyczny – wzrost produkcji ROS, natychmiastowa

aktywacja systemu antyoksydacyjnego

, zmiatanie ROS

• Stres biotyczny – nadprodukcja ROS (oksydaza NADPH),

wygaszenie systemu antyoksydacyjnego

, miejscowa

realizacja PDC (programowanej śmierci komórki),

POWSTANIE NEKROZ, oraz uruchomienie mechanizmów

obronnych

Różnica: strategia modulowania aktywnością

systemu antyoksydacyjnego

Podsumowanie

Toksyczna i regulacyjna funkcja ROS

ROS

Błony komórkowe

Endoplazmatyczne

reticulum

chloroplasty

mitochondria

peroksysomy

Funkcja sygnałowa

Działanie toksyczne

Kaskadowa reakcja

z udziałem kinaz

białkowych MAP

Aktywacja czynników

transkrypcyjnych

Indukcja stresu
oksydacyjnego

Uszkodzenia białek, kwasów
nukleinowych lipidów
błonowych

Modyfikacja

ekspresjii genów

Utrata funkcji organelli
komórkowych

Uszkodzenie lub

śmierć komórki

Odpowiedź fizjologiczna

komórki

Zmodyfikowane
w.g. Szymańska i
Strzałka 2010.
Postępy Biochemii
56: 182- 190.

Johansson, 2004

Sygnałowe funkcje ROS

związane są nie tylko z

odpowiedzią na stres

Przejściowy wzrost produkcji ROS
(sygnał ?) i białek utlenionych przed
zakwitnięciem rośliny

Zawartości białek utlenionych

w trakcie rozwoju rośliny

(Arabidopsis) jest zmienna.

ROS

pełnią wiele sygnałowych funkcji

(nie tylko toksycznych) w roślinie:

• wtórne przekaźniki podczas stresu
• powodują powstawanie białek utlenionych

SYGNAŁOWYCH podczas kiełkowania,
kwitnienia…i innych procesów życiowych.

Życie jest bilansem pomiędzy aktywnością

ROS i antyoksydantami

Hallaiwell 2006, Plant Physiol. 141, 312-322

Skutki stresu oksydacyjnego w chloroplastach

Niekorzystne

czynniki środowiska

Stres oksydacyjny

Odporność = mechanizmy naprawcze

a/ system antyoksydacyjny:
• Glutation
• Askorbinian
• Karotenoidy antoksydanty
• Tokoferol

b/ enzymy antyoksydacyjne:
SOD, GR, APOX, GPOX

Uszkodzenia (destrukcja chloroplastów)

1. Pęcznienie chloroplastów

2. Akumulacja skrobi

3. Destrukcja błon otaczających
chloroplasty

4. Destrukcja barwników asymilacyjnych

naturalne

antropogeniczne

Zapobieganie

hamowania fotosyntezy

Hamowania fotosyntezy

Sygnał ROS jest kontrolowany przez

procesy syntezy i zmiatania ROS

Istnieje równowaga pomiędzy syntezą ROS i aktywnością

komórkowego systemu antyoksydacyjnego

(oba procesy

zachodzą zawsze).

Zakłócenie tej równowagi prowadzi do powstania

stresu

oksydacyjnego,

t.z.n. zmiatanie ROS nie nadąża za

produkcją ROS.

Procesy biologiczne regulowane

przez H

2

O

2

-Stres abiotyczny

-Zamykanie aparatów szparkowych w

odpowiedzi na ABA

-Stres biotyczny -infekcja patogenu –

indukcja PCD

-Allelopatia

Neill et al. 2002, Laloi et al. 2004

ROS (H

2

O

2

)

i

RNS (NO)

biorą udział w

regulacji tych samych procesów:

- indukują reakcje obronne przeciwko patogenom,

- indukują programowaną śmierć komórki (PCD),

- kontrolują procesy wzrostu i rozwoju (kiełkowanie).

Prokukcja

NO

w komórce roślinnej

NO jest produkowany

:

- na drodze enzymatycznej
(syntaza NO (NOS), reduktaza
azotanowa (NR), reduktaza
nitrozowa (Ni-NOR)

- na drodze nie enzymatycznej
(uwalnianie z azotynów)

Neill et al. 2008. J. Exp. Bot. 59:25-35.

Nitrate
reductase (NR)

Arginine

mitochondria
peroxisomes
cytoplasm
chloroplasts

NO

NO synthase
(AtNOS1/AtNOA1)

cytoplasm

NO

2

-

NO

2

-

NO

2

-

NO

2

-

chloroplast

mitochondria

Plasma
membrane
(root)

Nitrite:NO
reductase
(Ni-NOR)

Usuwanie

NO

z komórki

NO

reaguje z rodnikiem

ponadtlenkowym i powstaje
rodnik peroksynitrylowy

NO

reaguje z glutationem –

powstaje S-nitrozoglutation
(GSNO).

NO

może być metabolizowany

przy udziale hemoglobin.

Neill et al.. 2008. J. Exp. Bot. 59:25-35.

haemoglobins

NO

NO

2

-

, NO

3

-

O

2

GSNO

GSSG + NH

2

GSNO reductase

glutathione

ONOO

-

(peroxynitrite)

O

2

-

.

(superoxide)

aminokwasy

nitrozylacja

nitracja

utlenianie

cysteiny do:
SS-, SOH-,
SO

2

-, SO

3

-

tyrozyny
histydyny
tryptofanu

R-NO

2

S-nitrozylacja
cysteiny: R-S-NO

przyłączenie NO

2

lub ONOO- do

pierścienia

aromatycznego

przyłączenie NO do

grupy tiolowej

cysteiny

H

2

O

2

O

2

.-

Modyfikacje białek wywołane przez

RNS

(NO,NO

2

i ONOO-)

i

ROS

przyłączenie O

2

do

grupy tiolowej lub

pobranie ē

ROS

argininy
lizyny
proliny
treoniny

utworzenie

grupy

karbonylowej

karbonylacja

RNS

NO

modyfikacja

posttranslacyjna

białek

wpływa na aktywność enzymów:

• katalazy

• peroksydazy ksantynowej

• peroksydazy askorbinianowej

• kinazy

• oksydazy alternatywnej

• akonitazy

• ferrytyny

aktywuje

cGMP

cyklazę
guanylową

aktywacja drogi
sygnalnej

uwalnia Ca

2+

kinazy
kanały jonowej
fosfodiesterazy

RNS

w transdukcji sygnału

Podobny mechanizm działania

RNS

i

ROS

w regulacji

ekspresji genów

NO

motyw palców
cynkowych

inaktywacja
represorów
transkrypcji

modyfikuje aktywność
czynników transkrypcyjnych

NO

wnika do jądra

komórkowego

aktywuje drogi sygnalne przez:

produkcje

SA, cGMP

uwalnianie

Ca

2+

MAPK

kinaza

transdukcja sygnału

ekspresja genów

H

2

O

2

utlenienie i

karbonylacja

białek

H

2

O

2

wnika do jądra

komórkowego

utlenienie,

nitracja i

nitrozylacja białek

ROS

i

RNS (NO)

współdziałają z hormonami

roślinnymi

ROS

RNS

etylen

GA

ABA

JA

BR

Wzrost i rozwój

-

?

?

Współdziałanie („cross-talk”)

ROS

i

RNS

w regulacji

wzrostu i rozwoju

miejsce syntezy

czas
syntezy

szlak transdukcji

sygnału

funkcje

ROS

(H

2

O

2

)

RNS

(NO)

Askorbinian

Glutation

p o d o b i e ń s t w a

Podsumowanie

Podsumowanie

Regulacyjna rola

ROS

i

RNS

w kontroli procesów wzrostu i rozwoju

Sygnał egzo- lub

endogenny

stres oksydacyjny

stres nitrozacyjny

Wzrost

i

rozwój

ROS

RNS

utlenienie,

karbonylacja białek

peroksydacja lipidów

S-nitrozylacja

białek

nitracja białek i lipidów

glutation

askorbiniann

RNS

NO modyfikuje aktywność białek

Zmienia to strukturę przestrzenną białek co wpływa na

modyfikację ich aktywności

nitrozylacja

przyłączanie grupy
NO do tyrozyny

R-NO

S-nitrozylacja

przyłączanie
NO do reszty
siarkowej

R-S-NO

przyłączenie sie
do cześci
hemowej białka

reaguje z
Fe lub Zn
w białku