ĆWICZENIA LABORATORYJNE Z FIZYKI
S P R A W O Z D A N I E
Temat: Pomiar widm absorpcji i stężenia ryboflawiny w
roztworach
wodnych
za
pomocą
spektrofotometru.
Wyznaczanie stężenia substancji w roztworze metodą
fluorescencyjną.
para nr 8, ćwiczenie nr 57/74
Towaroznawstwo
Grupa 14
Widmem absorpcji nazywa się w spektroskopii zależność współczynnika absorpcji
od długości fali
,
(
). Jak wynika ze wzoru:
A(
) =
(
) c l
Wartość absorbancji A dla danej długości fali
jest iloczynem wartości
współczynnika
dla tej samej długości fali i stałej wartości c l, która nie zależy od
. Stąd
wniosek, że wykres zależności A(
) ma taki sam charakter (ilość pasm absorpcji, ich kształt) i
dostarcza podobnych informacji jak wykres funkcji
(
). Wykres zależności A(
) można
traktować również jako widmo absorpcji. Pomiaru widma absorpcji dokonuje się za pomocą
spektrofotometru. Kolejno dla poszczególnych długości fal
. odczytujemy na skali
spektrofotometru absorbancję A i transmitancję T w zakresie ultrafioletu i w dziedzinie
widzialnej lub tylko w dziedzinie widzialnej. Podczas pomiaru absorbancji roztworów jako
natężenie światła I
0
przyjmuje się natężenie światła przechodzącego przez kuwetę z
rozpuszczalnikiem. W ten sposób eliminuje się osłabienie wiązki w wyniku załamania i
rozpraszania światła w kuwecie i rozpuszczalniku. Widmo absorpcji mierzymy punktowo za
pomocą spektrofotometru VSU2P lub w sposób ciągły, z automatycznym zapisem za pomocą
spekordu UV-VIS oraz spektrofotometru M40 z automatycznym wydrukiem wartości
absorbancji.
Fotoluminescencja. Emisja światła przez zbiór cząsteczek, które znalazły się w
energetycznym stanie wzbudzonym w wyniku absorpcji światła nazywa się
fotoluminescencją. Jest to emisja spontaniczna. Średni czas życia (istnienia) cząsteczki w
stanie wzbudzonym
≥10
-9
s.
Weźmy pod uwagę wieloatomowe cząsteczki wybranego związku organicznego
wykazującego fotoluminescencję. Niech związek będzie rozpuszczony w rozpuszczalniku
nieluminezującym. Aby pobudzić substancję do świecenia należy oświetlić kuwetę z
roztworem wiązką światła o długościach fal z zakresu widma absorpcji charakterystycznego
dla tego związku. Oddziaływanie światła z cząsteczkami substancji należy rozpatrywać na
podstawie teorii kwantowej. Zgodnie z tą teorią cząsteczki, po pochłonięciu odpowiedniego
kwantu świetlnego hv, z zakresu widma widzialnego lub ultrafioletu, znajdują się w
elektronowym stanie wzbudzonym na odpowiednim poziomie oscylacyjnym. Jest to stan
energetycznie niestabilny S, w jakim znalazła się cząsteczka w wyniku optycznego
wzbudzenia. Cząsteczka stara się więc oddać nadmiar energii, aby przejść do stanu
stacjonarnego, odpowiadającego minimum energii w danych warunkach fizykochemicznych,
czyli do stanu podstawowego S
0
. Z energetycznego stanu wzbudzonego S do stanu
podstawowego S
0
cząsteczki mogą przejść w różny sposób. Procesy absorpcji i emisji światła
oraz de aktywacji energii optycznego wzbudzenia można zapisać następująco:
S
0
+ hv
a
→ S
absorpcja
gdzie:
v
a
- częstotliwość światła absorbowanego,
h - stała Plancka
I
S → S
0
+ Q
rozpraszanie energii
II
S + W
0
→ S
0
+ W
wygaszanie
W
0
, W - stany energetyczne cząsteczki wygaszacza, odpowiednio w stanie podstawowym i
wzbudzonym.
III
S → S
0
(P)
fotoreakcje
Fotoluminescencja
IV
S → S
0
+ hv
f
fluorescencja
S
1
→ T
1
V
T
1
→S
1
fluorescencja długożyciowa
S
1
→ S
0
+ hv
df
S
1
→ T
1
VI
fluorescencja
T
1
→ S
0
+ hv
fosf
Cząsteczka w elektronowym stanie wzbudzonym S może przekazać cząsteczkom
otaczającym, np. cząsteczkom rozpuszczalnika, nadmiar energii jako ciepło (na sposób ciepła)
w ilości Q i przejść do stanu podstawowego S
0
. Nastąpi wtedy tzw. rozpraszanie energii
(zależność I). Jeżeli w bliskim otoczeniu cząsteczki S znajdzie się cząsteczka innej substancji
w elektronowym stanie podstawowym W
0
, która może przejąć cały nadmiar energii
cząsteczki w stanie S, to następuje przekazanie energii. Cząsteczka wygaszacza W
0
przechodzi do stanu wzbudzonego W. Proces ten nazywa się wygaszaniem fluorescencji
(wygaszanie świecenia) lub rezonansowym przekazywaniem energii - zależność II. Nadmiar
energii w stanie wzbudzonym może być "wykorzystany" przez cząsteczkę na fotoreakcję, w
której wyniku powstają fotoprodukty S
0
(P) zależność III.
Jeżeli powyższe przypadki deaktywacji energii optycznego wzbudzenia są mało
prawdopodobne, to cząsteczka może wyemitować nadmiar energii w postaci kwantu hv
f
(v
f
-
częstotliwość światła emitowanego). Jest to jeden z przypadków fotoluminescencji. Ten
rodzaj fotoluminescencji nazywa się fluorescencją (zależność IV). Substancjami
fluoryzującymi są często barwniki organiczne w roztworach ciekłych.
W odpowiednich warunkach cząsteczka może przejść ze stanu wzbudzonego S
1
do
stanu metastabilnego (trójkowego, długożyciowego) T
1
, charakteryzującego się wyraźnie
dłuższym czasem życia niż stan S
1
, Kosztem energii termicznej cząsteczek otaczających,
może nastąpić powrót cząsteczki ze stanu T
1
do stanu S
1
i dopiero wtedy nastąpi przejście do
stanu podstawowego S
0
, połączone z emisją promieniowania zwaną fluorescencją
długożyciową lub opóźnioną (zależność V). Powrót ze stanu długożyciowego T
1
do stanu S
1
może być utrudniony na przykład przez obniżenie temperatury lub "usztywnienie"
środowiska. Wtedy następuje emisyjne przejście ze stanu T
1
do stanu S
0
i mamy do czynienia
ze świeceniem zwanym fosforescencją (zależność VI).
Ze względu na mechanizm świecenia możemy więc fotoluminescencję cząsteczek
podzielić na trzy rodzaje: fluorescencję, która zachodzi tylko przy udziale stanu singletowego
S; fluorescencję długożyciową i fosforescencję, w których bierze udział stan metatrwały T.
Fluorescencja. W celu wyjaśnienia mechanizmu fluorescencji i poznania właściwości
spektralnych światła emitowanego, należy rozpatrywać rozszerzony obraz stanów
energetycznych zbioru cząsteczek. Mogą to być np. cząsteczki barwnika rozpuszczonego w
wodzie. Aby nastąpiła fluorescencja, układ musi być wzbudzony światłem o częstotliwości z
zakresu widma absorpcji barwnika. Cząsteczki absorbują różne kwanty energii, czyli znajdą
się w różnych oscylacyjnych i rotacyjnych stanach energetycznych danego, elektronowego
stanu wzbudzonego. Bredni czas przebywania cząsteczki w elektronowym stanie
wzbudzonym, czas życia cząsteczki w elektronowym stanie wzbudzonym, jest rzędu 10
-9
s.
W tym przedziale czasowym cząsteczki przekazują otoczeniu, w sposób bezemisyjny,
nadmiar energii oscylacyjnej i rotacyjnej w stanie wzbudzonym S
1
oraz, zazwyczaj,
przechodzą z wyższych elektronowych stanów wzbudzonych do stanu S
1
. W wyniku tego,
przed aktem emisji, wszystkie cząsteczki zdolne do fluorescencji znajdą się na zerowym
poziomie oscylacyjnym pierwszego elektronowego stanu wzbudzonego S
1
(reguła Kashy).
Podczas aktu emisji cząsteczki przechodzą do różnych stanów oscylacyjnych i rotacyjnych
elektronowego stanu podstawowego S
0
. Zgodnie z zasadami mechaniki kwantowej zachodzi
emisja różnych kwantów świetlnych z różnym prawdopodobieństwem, czyli natężenie
emitowanego światła o różnych długościach fal jest różne. Zależność natężenia fluorescencji
F od częstotliwości v lub długości fali emitowanej
v
c
nazywa się widmem fluorescencji
F = f(
). Widmo fluorescencji występuje w postaci pasma, które ma kształt podobny do
krzywej Gaussa, przy czym od strony małych częstotliwości (dużych długości fal) zaznacza
się wyraźne rozszerzenie pasma fluorescencji. Emitowane kwanty są zazwyczaj mniejsze od
kwantów absorbowanych. Widmo fluorescencji jest więc przesunięte w stronę fal dłuższych
w stosunku do najbardziej długofalowego pasma absorpcji. Tę prawidłowość zapisał Stokes w
następującej postaci:
f
>
a
gdzie:
f
- długość fali odpowiadająca maksimum pasma fluorescencji
a
- długość fali odpowiadająca maksimum pasma absorpcji.
W spektralnej analizie ilościowej wykorzystuje się zależność natężenia fluorescencji
(F) od stężenia substancji fluoryzującej w roztworze. Wartość natężenia fluorescencji zależy
od ilości światła zaabsorbowanego (P) oraz od kwantowej wydajności fluorescencji (
).
F = k
P
gdzie:
k - stała układu pomiarowego.
Wydajność kwantowa fluorescencji
jest to stosunek liczby kwantów emitowanych
do liczby kwantów absorbowanych przez substancję fluoryzującą w danych warunkach
fizykochemicznych. Zgodnie z prawem absorpcji, ilość światła zaabsorbowanego P przez
daną substancję w roztworze można wyrazić wzorem:
P = I
0
- I
gdzie:
I = I
0
e
-
c l
stąd
P = I
0
(1 - e
-
c l
)
gdzie:
I
0
- natężenie światła padającego na badaną próbkę,
I - natężenie światła przechodzącego,
- współczynnik absorpcji,
c - stężenie substancji absorbującej,
l - grubość warstwy.
W praktyce spektroskopowej wykładnik potęgowy
-
c l
dla małych stężeń jest
zazwyczaj mały. Po rozwinięciu e
x
, gdzie: x = -
c l, na szereg potęgowy mamy:
...
!
3
!
2
!
1
1
x
x
x
e
x
Wyraz trzeci i dalsze wyrazy w szeregu można pominąć jako bardzo małe, stąd
e
-
c l
= 1 –
c l
Po wprowadzeniu molowego współczynnika absorpcji
=
lge, otrzymuje się:
P = 2,3 I
0
c l
Wyrażenie F = k
P na natężenie światła fluorescencji F dla małych stężeń substancji
fluoryzującej przyjmie więc postać:
F = 2,3 k
I
0
c l
Stąd wniosek, że w danych warunkach fizykochemicznych dla danej substancji, natężenie
fluorescencji F jest wprost proporcjonalne do stężenia c substancji fluoryzującej w roztworze:
c
F
Zależność ta jest wykorzystywana w analityce chemicznej do ilościowego oznaczania
substancji. Jeżeli badana substancja wykazuje fluorescencję w roztworze, a rozpuszczalnik
oraz ewentualne domieszki nie fluoryzują, to fluorescencyjna metoda wyznaczania stężenia
substancji w roztworze polega na porównaniu natężenia fluorescencji badanego roztworu z
natężeniem fluorescencji roztworu tej samej substancji o znanym stężeniu. W tym celu należy
zbadać zależność natężenia fluorescencji F od stężenia c badanej substancji w roztworach
wzorcowych. Stosuje się roztwory wzorcowe o kilku różnych stężeniach w zakresie małych
stężeń. Zakres ten można wyznaczyć doświadczalnie dla każdej substancji w danym
rozpuszczalniku. Zasadą przygotowania roztworów wzorcowych jest, by badana substancja w
roztworach wzorcowych znajdowała się w takich samych warunkach fizykochemicznych jak
w roztworze badanym. Jeżeli warunek ten jest spełniony, to wykres funkcji F = f(c), czyli
tzw. krzywa wzorcowa, będzie linią prostą. Po przygotowaniu krzywej wzorcowej należy
zmierzyć natężenie fluorescencji roztworu badanego w tych samych warunkach wzbudzenia i
z krzywej wzorcowej odczytać stężenie badanej substancji w roztworze. Podczas badania
fluorescencji barwników wzbudzamy je zazwyczaj w zakresie najbardziej długofalowego
pasma absorpcji, które leży w przedziale widzialnym widma. Jak wynika ze wzoru:
F = 2,3 k
I
0
c l
natężenie fluorescencji dla danej próbki zależy od natężenia światła wzbudzającego I
0
oraz
molowego współczynnika absorpcji
. Aby uzyskać wzbudzenie najbardziej efektywne,
należy badany roztwór oświetlić światłem o długości fali zbliżonej do maksimum pasma
absorpcji, tak by iloczyn I
0
osiągnął wartość maksymalną. Zakres wzbudzenia, który spełnia
ten warunek, można określić z zależności natężenia fluorescencji od długości fali
wzbudzającej
wzb
. Zależność F(
wzb
) wyznacza się doświadczalnie. Jest to widmo
wzbudzenia.
Metoda pomiaru fluorescencji. Do badania fluorescencji służy układ przedstawiony na
rysunku 6.24. Fluorescencję wzbudzamy światłem ze źródła (Z), przechodzącym przez
monochromator (M). Światło o danej długości fali pada na kuwetę (K)
OBLICZENIA I POMIARY:
Do ćw. 74
wzb
(nm)
410 420 430 435 440 445 450 455 460 470 480 490 500
Natężenie
fotoprądu (i)
0,37 0,49 0,64 0,73 0,81 0,86 0,85 0,76 0,61 0,27 0,11 0,06 0,05
Lp.
c (M/l)
i (
A)
c
x
1
2
3
4
5
6
1,5 ∙ 10
-6
3,5 ∙ 10
-6
5 ∙ 10
-6
7 ∙ 10
-6
9 ∙ 10
-6
Cx = 2 ∙ 10
-6
25
49
61
78
86
35
C
x =
2 ∙ 10
-6
Do ćw. 57
L.p.
(nm)
E (A)
T
1
400
0,375
42
2
410
0,41
39
3
420
0,49
33
4
430
0,55
28
5
440
0,62
24
6
450
0,6
25
7
460
0,53
29
8
470
0,45
35
9
480
0,305
50
10
490
0,15
70
11
500
0,06
87
12
510
0,02
95
13
520
0,005
99
wartość najwyższa
440
445
0,62
24
C [mol / l]
E
T
1,5 ∙ 10
-6
3,5 ∙ 10
-6
5 ∙ 10
-6
7 ∙ 10
-6
9 ∙ 10
-6
Cx = 2 ∙ 10
-6
0,09
0,21
0,29
0,42
0,53
0,17
81
62
51
37
30
68
Zależność E = f (
) i T = f (
)
395
405
415
425
435
445
455
465
475
485
495
505
515
525
22
28
34
40
46
52
58
64
70
76
82
88
94
100
T
E
Krzywa cechowania
400
410
420
430
440
450
460
470
480
490
500
510
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
natężenie
fotoprądu
1,5
3,5
5
7,5
9
2,15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10
stężenie
n
a
tę
że
n
ie
Obliczenie wartości niepewności:
Ćw. 57
Dane:
Y = Ax + B
A = 57250
B = 0,004601
Y = 0,17
ΔA = 1726
ΔB = 0,01026
ΔY = ΔI = 0,001
l
mol
x
A
B
Y
x
/
10
889
,
2
57250
004601
,
0
17
,
0
6
Niepewność pomiaru:
2
2
2
2
2
2
)
(
A
A
x
B
B
x
Y
Y
x
x
u
2
2
2
2
2
2
2
1
1
)
(
A
A
B
Y
B
A
Y
A
x
u
l
mol
x
x
u
x
u
x
u
/
)
10
2
(
10
889
,
2
10
2
)
(
10
5866
,
7
10
212
,
3
10
052
,
3
)
(
1726
57250
004601
,
0
17
,
0
01026
,
0
57250
1
001
,
0
57250
1
)
(
7
6
7
15
14
16
2
2
2
2
2
2
2
Ćw. 74
Dane:
Y = Ax + B
A = 7942000
B = 17,71
Y = 35
ΔA = 724000
ΔB = 4,304
ΔY = ΔI = 0,001
l
mol
x
A
B
Y
x
/
10
15
,
2
7942000
71
,
17
35
6
Niepewność pomiaru:
2
2
2
2
2
2
)
(
A
A
x
B
B
x
Y
Y
x
x
u
2
2
2
2
2
2
2
1
1
)
(
A
A
B
Y
B
A
Y
A
x
u
l
mol
x
x
u
x
u
x
u
/
)
10
7627
,
5
(
10
15
,
2
10
7627
,
5
)
(
10
939
,
3
10
927
,
2
10
585
,
1
)
(
724000
7942000
71
,
17
35
304
,
4
7942000
1
001
,
0
7942000
1
)
(
7
6
7
14
13
20
2
2
2
2
2
2
2