Metabolizm bakterii – źródła węgla, azotu i energii
• Podłoże mineralne AB
sole A + sole B + czerwień fenolowa + sole Tuovinena + agaroid fosforany tiosiarczan mikroelementy sodu
podłoże stałe, selekcyjne dla chemolitoautotrofów
źródło energii – tiosiarczan sodu Na2S2O3
źródło węgla – CO2
czerwień fenolowa znacznik dla zmiany pH (z lekko zasadowej na kwasową), tj.
obecności bakterii, które utleniają tiosiarczan do SO 2-
4 (barwa czerwona zmienia się
na żółtą)
obligatoryjne chemolitoatotrofy rosną tylko na tym podłożu
Np. Halothiobacillus neapolitanus
(pałeczka gram-, bezwzględny chemolitoautotrof, bezwzględny tlenowiec, uzyskuje energię z utleniania siarki i jej zredukowanych związków nieorganicznych)
fakultatywne chemolitoautotrofy rosną na tym podłożu i na podłożu dla heterotrofów
Np. Paracoccus versutus
(pałeczka gram-, względny chemolitoautotrof, zdolny do wzrostu autotroficznego na pożywkach tiosiarczanem; prototrof, rośnie heterotroficznie na licznych związkach organicznych, które wykorzystuje jako jedyne źródło C i energii)
Wzrost bakterii na podłożu AB – bardzo słaby, ale zauważalny (żółknie), gdyż
utlenianie związków nieorganicznych zapewnia tylko nieznaczny wzrost Chemoorganoheterotrofy nie rosną na pożywce AB
Np. Bacillus subtilis
Micrococcus luteus
• Agar odżywczy
Bulion odżywczy + agar-agar + woda
podłoże stałe, pełne, dla heterotrofów lub fakultatywnych autotrofów źródło węgla – pepton
rosną bakterie chemoorganoheterotroficzne, dla których źródłami C i energii są związki zawarte w podłożu
Np. Bacillus subtilis
(laseczka gram+, chemoorganotrof, prototrof)
1
(ziarniak gram+, tlenowiec, chemoorganotrof, auksotrof)
rosną też fakultatywne chemolitoautotrofy, które w obecności organicznych związków węgla przestawiają się na tryb heterotroficzny
Np. Paracoccus versutus
Obligatoryjne chemolitoautotrofy nie rosną na tym podłożu, ze względu na brak związków nieorganicznych, z utlenienia których mogłyby czerpać energię do asymilacji CO2 (nawet jeśli miałyby związek nieorg. to ich wzrost byłby tak znikomy w porównaniu ze wzrostem bakterii heterotroficznych, że nie byłyby one zauważalne)
Np. Halothiobacillus neapolitanus
Pełne podłoże zawiera wszystkie potrzebne czynniki wzrostu dla różnych szczepów E.
coli
Escherichia coli WT
Escherichia coli MG1693 thr, leu, pro, his, arg, tiamina
Escherichia coli AB1157 tymina
(pałeczka gramm - , rodzina enterobacteriaceae, względny beztlenowiec, chemoorganotrof, WT
prototropf)
• Podłoże dla nitryfikatorów
Woda + sole mineralne
(NH4)2SO4, MgSO4, FeSO4, K2HPO4, NaCl, CaCO3
podłoże płynne, mineralne, selekcyjne
źródło węgla – CO2
źródło energii – związki nieorganiczne
brak związków organicznych
obecne źródło S, P, NH +
4
NH +
4 -najbardziej zredukowana forma azotu, łatwo dostępna dla bakterii bakterie nitryfikacyjne – obligatoryjne chemolitoautotrofy
hodowane w czystych roztworach soli rosną bardzo powoli (czas generacji – ok. 10
godz), dlatego nie obserwujemy zmętnienia
I faza: NH +
-
4 NH2OH NO2 (Nitroso- )
II faza: NO -
-
2 NO3 (Nitro- )
dodajemy grudkę gleby, inkubujemy przez tydzień
wykrywamy obecność jonów azotynowych NO -
2 przez dodanie kropli mieszaniny
α-naftyloaminy z kwasem sulfanilowym.
Powstanie różowego zabarwienia świadczy o obecności w glebie bakterii Nitrosomonas
• Agar odżywczy + skrobia (1%)
2
Źródło energii – związek organiczny
Źródło węgla – pepton + skrobia
Wyrosną bakterię heterotroficzne:
Escherichia coli (dziki)
Bacillus subtilis
Wykorzystywanie skrobi jako dodatkowego źródła węgla wykrywamy przez dodanie płynu Lugola, brak zabarwienia w miejscach gdzie skrobia została rozłożona świadczy o właściwościach amfolitycznych
Bacillus subtilis
Fioletowe zabarwienie w miejscach gdzie skrobia nadal znajduje się w podłożu: Escherichia coli (dziki)
• Agar odżywczy + mleko(4%)
jałowe, odtłuszczone
Podłoże stałe, półprzezroczyste (mleczny wygląd nadawany przez kazeinę), źródło węgla – pepton + kazeina
wykorzystywane do wielu testów, na ćwiczeniach badamy zdolności proteolityczne bakterii – rozkładanie kazeiny (zanika zmętnienie)
Na pożywce rosną bakterie heterotroficzne:
Escherichia coli
Bacillus subtilis (dziki)
Zanik zmętnienia, świadczący o zdolnościach proteolitycznych (wykorzystywanie kazeiny jako dodatkowego źródła węgla) obserwujemy wokół posiewu: Bacillus subtilis
Nie obserwujemy wokół posiewu:
Escherichia coli (dziki)
• Agar odżywczy + tłuszcz(3%)
wrząca margaryna
podłoże stałe, różnicujące
źródło węgla – pepton + tłuszcze
bakterie wykorzystują tłuszcz jako dodatkowe źródło węgla rozkładają tłuszcz do glicerolu i wolnych kwasów tłuszczowych
3
KT reagują z siarczanem miedzi (20% roztwór CuSO4) powstaje szmaragdowe zabarwienie
Na wzbogaconej pożywce agarowej rosną oba posiane szczepy heterotroficzne: Escherichia coli
Pseudomonas fluorescens
(pałeczka gramm -, orzęsione, tlenowce, chemoorganotrof, prototrof, heterotrof, denitryfikator) Po zalaniu roztworem CuSO4 powstaje szmaragdowe zabarwienie, świadczące o zdolności do wykorzystywania tłuszczu wokół posiewu:
Pseudomonas fluorescenscens
Zabarwienia nie obserwujemy wokół posiewu:
Escherichia coli
• śelatyna odżywcza
Woda + żelatyna + pepton
Pożywka stała, wylewana w słupki
Źródło węgla – pepton + żelatyna
śelatyna – białko, bakterie posiadające zdolności proteolityczne będą ją rozkładać (te same, które rozkładają kazeinę)
Obserwujemy rozrzedzenie pożywki, świadczące o zdolnościach proteolitycznych i rozłożeniu żelatyny – zestalacza:
Bacillus subtilis
Na nie rozrzedzonej pożywce rośną bakterie nie mające zdolności proteolitycznych: Escherichia coli
• EMB z laktozą
Ekstrakt drożdżowy + hydrolizat kazeiny + K2HPO4 +NaCl + woda + agar-agar +
laktoza
i eozyna + błękit metylenowy – rozkładające laktozę charakteryzują się bordowym zabarwieniem wzrostu (powstanie kwasu mlekowego)
Escherichia coli lac+
Escherichia coli lac- (jasne zabarwienie wzrostu)
Skrypt: lac+ zabarwienie fioletowe z metalicznym połyskiem; lac- kolonie zabarwione na róż owo
Źródło węgla – laktoza + hydrolizat kazeiny ?
Źródło energii –
• Podłoże Davisa dla prototrofów
Davis – K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, (NH4)2SO4, woda
+ agaroid +glukoza 20%
4
Escherichia coli WT wyrośnie jako jedyna bo nie potrzebuje dodatkowych czynników wzrostu
Escherichia coli AB1157 thr, leu, pro, his, arg, tiamina
Escherichia coli MG1693 tymina
Źródło węgla – glukoza
Źródło energii –
• Podłoże Davisa dla auksotrofów
Davis + glukoza +agaroid
+kazeina +tiamina
Escherichia coli WT
Escherichia coli AB1157 w podłożu znajdują się potrzebne czynniki wzrostu Escherichia coli MG1693
Źródło węgla – glukoza + kazeina?
Źródło energii –
• Podłoże dla bakterii wiążących azot
Woda+ mannitol +K2HPO4 + KH2PO4 +MgSO4 + NaCl + CaCO3 + FeCl2
+Na2MoO4
Podłoże płynne, brak azotu w podłożu
Źródło węgla - mannitol
Źródło energii – związki nieorganiczne
Bakterie izolujemy z gleby – te wolnożyjące nie związane z korzeniami Warunki tlenowe - kolba
Azotobacter sp.
śluzowaty kożuch (w obecności mannitolu w podłożu)
Warunki beztlenowe – probówka „z górką” + sacharoza
Clostridium pasteurianum
(laseczka gramm +, bezwzględny beztlenowiec, chemoorganotrof, prototrof, zdolny do wiązania azotu cząsteczkowego, gromadzi granulozę)
fermentacja masłowa – zapach
+ pęcherzyki gazu z dna probówki
oraz obserwacje pod mikroskopem
• Podłoże Davisa z różnymi źródłami azotu
Davis + glukoza (20%) + akaroid
5
- 10% NH4Cl –bardzo dobre uniwersalne źródło azotu – już zredukowane Escherichia coli
Bacillus subtilis
- 10% KNO3 – by azotany były źródłem azotu do syntez muszą być zredukowane do formy NH3
Escherichia coli – nie potrafi redukować azotanów – brak reduktazy azotanowej asymilacyjnej (hamowana przez sole amonowe obecne w cytoplazmie) Bacillus subtilis
- 20% hydrolizat kazeiny
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Źródło węgla – glukoza
Źródło energii -
6