Architektura funkcjonalna rybozymu hammerhead
STRESZCZENIE
Marta M. Gabryelska*
ybozym hammerhead jest najmniejszym katalitycznym RNA pochodzenia naturalnego,
Rktóry stanowi doskonały model do badań zależności struktury i funkcji. Początkowo
Agnieszka
został zidentyfikowany jako autokatalityczny fragment genomowego RNA roślinnych wi-
roidów i wirusoidów. Obecnie wiadomo, że występuje on w genomach wielu organizmów
Fedoruk-Wyszomirska*
w tym u człowieka i jest najczęściej występującym autokatalitycznym motywem RNA w
przyrodzie. Po 25 latach intensywnych badań dostępna jest duża ilość informacji na temat
Eliza Wyszko
jego budowy, dynamiki konformacyjnej oraz oddziaływań trzeciorzędowych wpływających
na stabilność i właściwości. Struktura cząsteczki rybozymu hammerhead stanowi układ ele-
Jan Barciszewski*ð
mentów, które wzajemnie na siebie wpływają. Poznanie architektury cząsteczki rybozymu
jest niezwykle interesujące w kontekście zasad i logiki projektowania, konstruowania i za-
Instytut Chemii Bioorganicznej Polskiej Aka- stosowania cząsteczek tej klasy jako molekularnych konstrukcji przestrzennych. Obecność
demii Nauk, Poznań dodatkowych motywów strukturalnych wyróżnia tzw. wydłużony rybozym hammerhead od
minimalnego. Rybozym hammerhead rozpoznaje docelowÄ… sekwencjÄ™ w RNA na zasadzie
*ð
komplementarności i katalizuje jej transestryfikację po sekwencji 5 -NUH-3 . Wydajność re-
Instytut Chemii Bioorganicznej Polskiej Aka-
akcji uwarunkowana jest aranżacją atomów centrum katalitycznego, obecnością jonów me-
demii Nauk, ul. Z. Noskowskiego 12/14, 61-
tali oraz innych czynników wewnątrzkomórkowych. Poszukiwane są nowe pochodne rybo-
704 Poznań, tel: [phone] wew. 132, faks:
zymów hammerhead o zwiększonej aktywności, które mogą być wykorzystane w medycynie
(61) 852 05 32, e-mail: Jan.Barciszewski@ibch.
molekularnej.
poznan.pl
WPROWADZENIE
*równorzędni autorzy
Artykuł otrzymano 24 września 2012 r. Struktura RNA determinuje jego funkcje oraz warunkuje swoiste oddziały-
Artykuł zaakceptowano 26 listopada 2012 r.
wania z innymi cząsteczkami RNA, ligandami, czy białkami [1]. Właściwości
katalityczne RNA zależą od jego konformacji, która ma charakter dynamiczny
SÅ‚owa kluczowe: struktura RNA, rybozym
[2]. Na początku lat 80-tych XX wieku po raz pierwszy pokazano, że RNA bie-
hammerhead, transestryfikacja
rze bezpośredni udział w składaniu (ang. splicing) i dojrzewaniu (ang. matura-
tion) RNA [3]. Katalityczne RNA (tzw. rybozymy, RNAzymy) charakteryzujÄ…
Wykaz skrótów: HHRz  rybozym hammerhe-
się obecnością wewnątrzcząsteczkowych oddziaływań trzeciorzędowych i kata-
ad; HHRzM  rybozym hammerhead minimal-
ny; HHRzW  rybozym hammerhead wydłużo- lizują reakcje transestryfikacji RNA, hydrolizy/ligacji, syntezy peptydu, fosfory-
ny; TLS  struktura podobna do tRNA; NMR
lacji, adenylacji aminokwasów, polimeryzacji RNA, reakcję aldolową, utleniania
 magnetyczny rezonans jÄ…drowy; TSM 
alkoholi, redukcję aldehydów, syntezę nukleotydów pirymidynowych, amino-
motyw stabilizujący strukturę trzeciorzędową
acylację i wiele innych [4]. Zachodzą one bez udziału dodatkowych czynników
białkowych [5]. Dotychczas zidentyfikowano dziewięć typów naturalnie wystę-
Podziękowania: Publikacja powstała w ra-
pujÄ…cych katalitycznych RNA [6] (Tab. 1).
mach realizacji projektów finansowanych ze
środków budżetowych na naukę w latach
2010-2011 w ramach programu Iuventus Plus, Tabela 1. Charakterystyka naturalnie występujących rybozymów.
nr IP2010008770 oraz grantu przyznanego
Wielkość
przez Polskie Ministerstwo Nauki i Szkolnic-
Podgrupa Rybozym Aktywność
czÄ…steczki (nt)
twa Wyższego nr N N302 220535. Marta M.
Gabryelska jest stypendystÄ… w ramach projek-
tu pt.:  Wsparcie stypendialne dla doktoran-
Hammerhead ~40
tów na kierunkach uznanych za strategiczne z
Rybozymy Hepatitis Delta Virus ~90
transestryfikacja in cis
punktu widzenia rozwoju Wielkopolski , Pod-
małocząsteczkowe Hairpin ~70
działanie 8.2.2 Programu Operacyjnego Kapi-
Varkud sattelite ~160
tał Ludzki, współfinansowanego ze środków
Unii Europejskiej w ramach Europejskiego
Funduszu Społecznego.
introny grupy I ~210
transestryfikacja in cis
introny grupy II <500
Rybozymy
wielkoczÄ…stecz-
kowe
RNaza P 350-410 hydroliza tRNA
snRNA (U2, U6) 180, 100 transestryfikacja RNA in trans
Rybosom 23 S rRNA ~2600 transferaza peptydylowa
22 www.postepybiochemii.pl
Rybozym o strukturze głowy młotka (ang. hammerhe-
ad ribozyme) ma niewielkie rozmiary i wykazuje dużą ak-
tywność. Od 25 lat stanowi dobry model do badań relacji
struktury i funkcji RNA [7]. Ostatnio szczególne zaintere-
sowanie wzbudza proces interferencji RNA (ang. RNA in-
terference, RNAi), dzięki któremu możliwe jest efektywne i
wysoce specyficzne blokowanie ekspresji genów przy uży-
ciu krótkich (~20 nt) interferencyjnych RNA (ang. short in-
terfering RNA, siRNA) [8]. Pomimo faktu, że siRNA mogą
być efektywnymi czynnikami hamującymi ekspresję w
stosunku do większości RNA cytoplazmatycznych, nie są
aktywne względem RNA zlokalizowanych w organellach
półautonomicznych. Ponadto, niektóre wirusy wykształci-
Å‚y mechanizmy obronne wobec RNAi, a technologia ta nie
jest wolna od niespecyficznych efektów ubocznych (ang. off-
-target effects) [9]. W takich przypadkach, opracowanie efek-
tywnych leków w oparciu o siRNA jest niemożliwe. W tym
kontekście, bardzo atrakcyjną alternatywę stanowią nadal
cząsteczki małych katalitycznych RNA, a w szczególności
rybozymy typu hammerhead.
RYBOZYM TYPU hammerhead
Rybozym hammerhead (HHRz) został odkryty jako samo-
wycinający się fragment genomowego RNA roślinnych wi-
roidów i wirusoidów [10]. Ich replikacja odbywa się poprzez
mechanizm toczącego się koła [11]. Kolisty genomowy RNA
jest kopiowany do liniowego produktu, który następnie ule-
ga hydrolizie do cząsteczek o odpowiedniej długości. Etap
ten nie wymaga obecności enzymów białkowych i jest wy-
nikiem spontanicznej reakcji transestryfikacji katalizowanej
przez specyficzny motyw RNA o strukturze głowy młotka
(ang. hammerhead ribozyme, HHRz) [12].
Redukując wielkość cząsteczki, zidentyfikowano naj-
Rycina 2. Motyw łączenia trzech helis RNA w kształcie litery  Y w rybozymach.
prostszy aktywny wariant, tzw. minimalny rybozym ham-
(A) Trzy typy rybozymów hammerhead in cis w zależności od tego, która z helis
merhead (HHRzM), hydrolizujÄ…cy wiÄ…zanie fosfodwuestrowe
zawiera końce 5 i 3 cząsteczki. Kropkami zaznaczono miejsca oddziaływań trze-
ciorzędowych o sekwencji nie zachowanej w ewolucji. Cyframi I, II, III oznaczono
w docelowych RNA in trans [13]. Jego struktura drugorzÄ™-
helisy rybozymu. Helisy II i III oddziałują współosiowo (zielona strzałka), pętle
dowa przypomina kształtem literę  Y . Składa się z trzech
helis I i II biorą udział w ustaleniu oddziaływań trzeciorzędowych (niebieska
odcinków helikalnych (HI, HII, HIII) zwanych ramionami, strzałka). (B) Rybozymy hammerhead in trans. Na pomarańczowo zaznaczono nić
substratową. HHRzM  rybozym minimalny, HHRzW  rybozym wydłużony.
które otaczają wysoce zachowawczą domenę katalityczną
(rdzeń katalityczny) (Ryc. 1). Motyw połączenia trzech helis
(ang. 3-way junction) tego typu występuje także w innych
małych RNA, takich jak ryboprzełączniki czy rybozymy,
oraz w dużych kompleksach rybonukleoproteinowych jak
rybosomalne RNA, RNaza P lub kompleks SRP (ang. signal
recognition particle) (Ryc. 2) [15]. Jest to miejsce oddziaływa-
nia białek, innych cząsteczek RNA oraz antybiotyków.
Trzeciorzędową strukturę minimalnego rybozymu
typu hammerhead w kompleksie z substratem poznano 20
lat temu (Ryc. 3). Jako substrat wykorzystano poczÄ…tkowo
oligonukleotyd DNA, który nie był degradowany przez ry-
bozym HHRz [16], a póz
niej RNA zawierajÄ…cy grupÄ™ 2 -O-
-metylowÄ… w miejscu hydrolizy [17] oraz czÄ…steczkÄ™ RNA
bez modyfikacji chemicznych [18]. Helisy II i III ułożone są
współosiowo, podczas gdy helisa I leży pod kątem ostrym
do helisy II (Ryc. 3). Wszystkie występują w konformacji
typu A RNA. Kieszeń katalityczną tworzy jednoniciowa
sekwencja (3)CUGA(6) z charakterystycznym motywem U-
-skrętu między nukleotydami U4 i G5 [16].
Rycina 1. Struktura drugorzędowa rybozymu hammerhead. Na czarnym tle
przedstawiono centrum katalityczne. H I-III  ramiona helikalne. Numeracja nu-
kleotydów zgodnie z [14].
Postępy Biochemii 59 (1) 2013 23
Najbardziej charakterystyczną cechą pełnej długości
rybozymu HHRzW jest oddziaływanie pomiędzy pętlą ra-
mienia II i wybrzuszeniem w ramieniu I, tworzÄ…ce stabil-
nÄ… i aktywnÄ… konformacjÄ™ domeny katalitycznej (Ryc. 1 i 3)
[21]. Rybozym ten jest dwukrotnie większą cząsteczką niż
wariant minimalny. Kształtem przypomina literę  ł , gdzie
ramię II leży w jednej osi z ramieniem III. Zarówno kieszeń
katalityczna, jak i U-skręt różnią się znacznie od tych obser-
wowanych w wariancie minimalnym [22].
Na aktywność rybozymów in vivo wpływa stężenie jo-
nów magnezu, siła jonowa, temperatura, dostępność sub-
stratu, oddziaływanie ze składnikami komórkowymi oraz
kompartmentacja [24]. Poliaminy, takie jak spermina stano-
wią polikationowe ligandy, występujące w komórce w stę-
żeniach milimolowych, które mają wpływ na konformację
kwasów nukleinowych oraz poprawiają aktywność katali-
tyczną in vitro rybozymów typu hairpin [25] oraz hammer-
head (dane nieopublikowane). Wiele różnych makrocząste-
czek może powodować zmiany jego konformacji poprzez
zderzenia międzycząsteczkowe, słabe niespecyficzne od-
działywania lub poprzez tzw. efekt stłoczenia molekular-
nego (ang. molecular crowding effect) [26,27]. Wykazano, że
nukleokapsyd p7 HIV-1, białko hn RNP A1 oraz dehydro-
genaza GAPDH zwiększają szybkość reakcji in vitro oraz
tempo dysocjacji produktów [28-31].
SPECYFICZNOŚć SUBSTRATOWA
RYBOZYMU hammerhead
Rycina 3. Minimalny rybozym typu hammerhead (po lewej) i wydłużony (po pra-
wej) w kompleksach z substratami. (A) Struktury drugorzędowe. (B-C) Struktu-
Rybozym hammerhead HHRz rozpoznaje docelowÄ… se-
ry trzeciorzędowe. N  oznacza dowolny nukleotyd, H  każdy nukleotyd z
kwencję w RNA poprzez tworzenie z nią wiązań typu Wat-
wyjątkiem G. Domena katalityczna została przedstawiona kolorem czerwonym
(sekwencja CUGAUGA) oraz zielonym (sekwencja GAA), a substrat kolorem żół- sona-Cricka. Długość i skład nukleotydowy ramion otacza-
tym. Niebieskimi ramkami zaznaczono oddziaływania pomiędzy pętlą ramienia
jących miejsce hydrolizy powinny zapewniać na tyle silne
II a wybrzuszeniem w ramieniu I. Miejsce hydrolizy oznaczono strzałką. Nume-
wiązanie rybozymu HHRz do substratu, aby uniemożliwić
racja nukleotydów zgodnie z [14].
przedwczesną dysocjację [32]. Dzięki temu rybozym może
W rybozymach in trans (hydrolizujących odrębną czą- katalizować kolejną reakcję. Zbyt krótkie ramiona hybrydy-
steczkę RNA) helisy I i III powstają przez hybrydyzację zujące mogą być przyczyną utraty specyficzności rybozy-
katalitycznego RNA z komplementarnymi sekwencjami mu, natomiast ich wydłużenie powoduje wzrost stabilno-
substratu. Rybozymy hammerhead w układzie in cis (hydro- ści tworzonego kompleksu z substratem i produktami, co
lizujące własną cząsteczkę) można podzielić na trzy typy, w wiąże się ze spadkiem wydajności hydrolizy [32,33]. Opty-
zależności od tego, która z helis zawiera końce 5 i 3 (helisa malna długość ramion hybrydyzujących wynosi 6-10 reszt
I  typ 1, helisa II  typ 2, helisa III  typ 3) (Ryc. 2) [19,20]. nukleotydowych. Ponadto sekwencja substratu przy końcu
3 ma większe znaczenie dla szybkości reakcji niż przy koń-
W póz
niejszych badaniach wykazano, że dodatkowe cu 5 [34]. Wpływ długości ramion na aktywność rybozymu
elementy strukturalne (TSM, ang. tertiary stabilizing motif) różni się dla procesów in vitro i in vivo [35].
występujące w naturalnych rybozymach hammerhead odgry-
wajÄ… istotnÄ… rolÄ™ w stabilizacji aktywnej konformacji czÄ…- Rybozym hammerhead hydrolizuje substraty po sekwencji
steczki, co zwiększa wydajność reakcji [21]. Warianty te na- 5 -NUH-3 , gdzie N oznacza dowolny nukleotyd, U urydynę
zywane są rybozymami pełnej długości (HHRzW, ang. full- natomiast H adenozynę, cytozynę lub urydynę niezwiązaną
-length,) lub wydłużonymi (HHRzW, ang. extended). W 2006 wiązaniami wodorowymi. Wymagania rybozymu wzglę-
roku poznano trzeciorzędową strukturę rybozymu HHRzW dem sekwencji 5 -NUH-3 mogą być w pewnym stopniu
w kompleksie z RNA zawierającym grupę 2 -O-metylo- zmodyfikowane względem pozycji drugiej i trzeciej. Ziden-
wą w miejscu hydrolizy [22]. Następnie udało się uzyskać tyfikowano rybozymy rozpoznające sekwencję 5 -NHH-3 ,
struktury krystaliczne aktywnego wydłużonego rybozymu gdzie H może być dowolnym nukleotydem z wyjątkiem
hammerhead w kompleksie z substratem oraz z produktem, G [36]. Uzyskano również puryno-specyficzny wariant ry-
w którym pozycję G12 zastąpiono A12 [23]. Dzięki temu nie bozymu hammerhead, który in vitro hydrolizował wiązanie
została zaburzona struktura centrum katalitycznego, ale fosfodwuestrowe po niesparowanym nukleotydzie G przy
uzyskano wielokrotne zwolnienie katalizowanej reakcji. końcu 3 (5 -GUG-3 ) [37]. Stała szybkości reakcji katalizo-
wanej przez rybozym HHRz maleje w następującym po-
24 www.postepybiochemii.pl
rzÄ…dku: GUC, AUC > GUA, AUA, CUC > AUU, UUC, UUA
> GUU, CUA >UUU, CUU [38].
W przypadku rybozymów minimalnych obserwowano
nawet 70-krotne różnice szybkości hydrolizy in vitro dla róż-
nych substratów [32]. Rozbieżność ta może być związana z
szybkością dysocjacji produktów oraz zmianami w struk-
turze [39]. Tolerancja substytucji niektórych nukleotydów
rdzenia katalitycznego wskazuje, że system oddziaływań
elementów struktury drugorzędowej oraz trzeciorzędo-
wej mimo odległości moduluje lokalną strukturę centrum
katalitycznego [40]. Szybkość reakcji jest także zależna od
charakteru nukleotydu w pozycji  1 względem sekwencji
5 -NUH-3 zgodnie z preferencjÄ… U>C>A>G [41].
REAKCJA TRANSESTRYFIKACJI
Rycina 5. Schemat hydrolizy RNA katalizowanej przez rybozym HH. Rybozym
(Rz) specyficznie przyłącza i hydrolizuje docelowy RNA (S  substrat). Najpierw
tworzony jest kompleks rybozymu z substratem (Rz:S). Po hydrolizie (transestry-
Rybozymy w fizjologicznym pH katalizują wewnętrzną
fikacji) RNA powstaje kompleks rybozymu i dwóch produktów (Rz:P1:P2), a na-
reakcję transestryfikacji ( hydrolizy ) z szybkością porów-
stępnie cząsteczka katalityczna ulega dysocjacji od produktów hydrolizy (P1, P2)
i bierze udział w kolejnej reakcji.
nywalną do enzymów białkowych. Według mechanizmu
katalizy kwasowo-zasadowej funkcję zasady pełnią pary
socjują, a rybozym może katalizować kolejną reakcję (Ryc.
elektronów zasad heterocyklicznych kwasów nukleino-
5) [32]. Stała Michaelis-Menten dla rybozymów wyznacza-
wych [42] (Ryc. 4). Grupa 2 -OH rybozy przeprowadza atak
na jest w warunkach wielo- i jednokrotnego udziału rybo-
nukleofilowy na najbliższy 3 fosforan zgodnie z mechani-
zymu w reakcji [32,45]. Wartości kcat i KM dla rybozymów
zmem reakcji SN2, a produkty reakcji majÄ… 2 ,3 -cykliczny
hammerhead zazwyczaj mieszczÄ… siÄ™ odpowiednio w zakre-
fosforan oraz grupÄ™ 5 -OH (Ryc. 4) [44]. Grupa atakujÄ…ca,
sie 1-2 min-1 i 20-200 nM [38].
fosforan w miejscu hydrolizy oraz grupa opuszczająca uło-
żone są liniowo. W pierwszym etapie tworzy się swoisty,
aktywny kompleks enzym:substrat, w którym dochodzi do Centrum katalityczne rybozymu hammerhead musi speł-
hydrolizy wiązania międzynukleotydowego, produkty dy- niać następujące warunki: i) zasada G12 znajduje się w po-
łożeniu umożliwiającym deprotonację grupy nukleofilowej
(C17 2 OH) w celu utworzenia aktywnego prekursora; ii)
zmiany konformacji miejsca aktywnego zapewniają ułoże-
nie liniowe aktywowanego nukleofila (C17 2 OH) i atako-
wanej reszty fosforanowej; iii) integralność miejsca aktyw-
nego, a także bliskość A9 i atakowanego fosforanu pozwa-
lają na wiązanie jonu dwuwartościowego, iv) reszta G8 jest
utrzymana w pozycji umożliwiającej oddanie protonu gru-
pie opuszczajÄ…cej (C1.1 5 O) [46].
WPA
YW JONóW METALI NA
AKTYWNOŚć RYBOZYMóW
Utworzenie dupleksu oraz struktur trzeciorzędowych
jest możliwe dopiero po zrównoważeniu ujemnego ładun-
ku łańcucha cukrowo-fosforanowego kwasów nukleino-
wych [47]. Z tego względu, RNA i DNA występują w ko-
mórce w postaci zasocjowanej z kationami.
Obecność jonów metali w mieszaninie reakcyjnej silnie
wpływa na aktywność rybozymów (Tab. 2) [47]. Uczestni-
czÄ… one w tworzeniu aktywnej konformacji rybozymu ham-
merhead, ale obserwowane między nimi różnice przyspie-
szania reakcji katalitycznej sięgają rzędu 104. Najlepszym
kofaktorem jest Mn2+ [47].
Analizując struktury krystaliczne rybozymów hammer-
Rycina 4. Schematy proponowanych mechanizmów transestryfikacji RNA kata-
head stwierdzono, że zarówno w miejscu katalitycznym,
lizowanej przez rybozym HHRz (na podstawie [43,54]). W wyniku ataku nukle-
jak i w jego najbliższym otoczeniu brak jonów magnezu
ofilowego grupy 2 -OH rybozy na wiÄ…zanie fosfodwuestrowe powstajÄ… produkty
reakcji, z których jeden zakończony jest 2 ,3 -cyklicznym fosforanem, a drugi gru-
[16,17,22]. Zaproponowano model, w którym jony metalu
pą 5 -OH. (A) Mechanizm katalizy kwasowo-zasadowej (H-A  ogólny kwas, :B 
odgrywają rolę strukturalną, co potwierdzały eksperymen-
ogólna zasada). (B) Mechanizm kwasowej hydrolizy estrów. Z  zasada azotowa,
R  kontynuacja łańcucha RNA. ty chemicznej modyfikacji zasad oraz obserwacje, że rybo-
Postępy Biochemii 59 (1) 2013 25
Tabela 2. Występowanie niektórych jonów w komórce i ich wpływ na aktywność katalityczną rybozymu hammerhead Schistosoma. b.d.  brak danych. Na podstawie
[47,48,51].
Stężenie w Kobs (min-1) w 0,1 M NaCl
Stężenie toksyczne Główny przedział komórkowy,
Jon cytoplazmie WiÄ…zanie i 1 mM M2+ lub 600 mM
w cytoplazmie [M] w którym występuje
[M] M+ (Schistosoma HH)
Mg2+ 10-3 10-1 Cytoplazma 2,6
aparat Goldiego słabe
Mn2+ 10-6 10-5 200
mitochondrium odwracalne
Fe2+ 10-7 10-5 cytoplazma b.d.
Na+ b.d. 10-1 zewnątrzkomórkowo b.d. <0.02
Ca2+ 10-7 10-3 siateczka śródplazmatyczna b.d. 0,14
silne
Zn2+ 10-11 10-9 Pęcherzyki 82
nieodwracalne
aparat Goldiego, siateczka
Cu2+ 10-15 10-9 śródplazmatyczna, b.d. b.d.
zewnątrzkomórkowo
Ni2+ 10-16 10-10 wakuole roślinne b.d.
średnie
nieodwracalne
Co2+ 10-15 10-10 cytoplazma 140
zymy hammerhead sÄ… aktywne w obecnoÅ›ci wyÅ‚Ä…cznie jonów atakowanego fosforanu oddalonych od siebie o 4.3Å, co po-
jednowartościowych (Li+, Na+, NH4+) czy poliamin orga- zwala na osiągnięcie przez G8 pKa umożliwiającego katali-
nicznych oraz, że istnieje związek pomiędzy aktywnością zowanie reakcji [46]. Stwierdzenie, że magnez nie odgrywa
rybozymu, a zależnością G8 i G12 od pH [49,50]. Wpływ pH w reakcji katalitycznej aktywnej roli zwróciło uwagę na wy-
środowiska, jak również grup funkcyjnych jest taki sam w stępowanie dodatkowych motywów strukturalnych, które
przypadku hydrolizy z udziałem rybozymu HHRz w obec- stabilizują aktywną konformację cząsteczki [21].
ności kationów jedno- i dwuwartościowych [52,53].
MOTYWY STABILIZUJ
CE STRUKTURÄ™
W warunkach wysokiego ciśnienia hydrostatycznego
TRZECIORZęDOW
RYBOZYMU
(HHP, ang. high hydrostatic pressure,) wykazano, że jony ma-
gnezu stabilizują strukturę rybozymu i nie są bezpośrednio
Wydłużone rybozymy hammerhead stabilizowane są po-
zaangażowane w katalizę, a reakcja może być rozpatrywana
przez trzeciorzędowe motywy (TSM, ang. tertiary stabilizing
jako kwasowa hydroliza estrów (Ryc. 4) [54]. Pod wpływem
motif), które zapewniają wysoką aktywność katalityczną in
ciśnienia dochodzi do dysocjacji cząsteczek wody. W pierw-
vitro oraz in vivo w układzie in trans [58]. Oddziaływania te
szym etapie następuje przyłączenie protonu do tlenu grupy
mimo znacznej odległości od centrum katalitycznego rybo-
fosforanowej, co powoduje, że staje się ona podatna na atak
zymu, pośrednio wpływają na jego strukturę poprzez zmia-
nukleofilowy grupy 22 -OH rybozy zawierajÄ…cej wolnÄ… parÄ™
ny geometrii czÄ…steczki [56].
elektronową. Po utworzeniu stanu przejściowego, następu-
je protonacja atomu 5 O i w konsekwencji zerwanie wiÄ…za-
Badając dynamikę konformacyjną wydłużonych rybo-
nia pomiędzy fosforem a tlenem [54,55].
zymów hammerhead z wykorzystaniem techniki FRET (ang.
Chociaż proces zwijania HHRz jest zakończony już w fluorescence resonance energy transfer) wykazano, że oddzia-
stężeniu 2-3 mM magnezu, szybkość hydrolizy lub ligacji ływania pętli ramion I i II pozwalają częściej przyjmować
wzrasta wraz ze stężeniem jonów i nie zawsze ulega nasy- konformację katalitycznie aktywną [59]. Oddziaływania do-
ceniu nawet przy 100 mM [56]. Sugeruje to istnienie słabego nora oraz akceptora fluoroforu zlokalizowanych przy koń-
miejsca wiązania magnezu być może w pobliżu centrum ka- cach ramion I i II wykazały, że zwijanie się rybozymu w tym
talitycznego lub występowanie zmian strukturalnych przy rejonie i uzyskiwanie aktywnej konformacji zależą od stę-
wyższym stężeniu tego jonu [56]. Zaproponowano udział żenia jonów magnezu. Stężenia jonów magnezu w dwóch
jonów metalu związanych koordynacyjnie i działających w etapach zmian konformacji (całkowitej i zmian lokalnych)
bezpośredniej bliskości centrum katalitycznego oraz niespe- wydłużonego rybozymu są niższe niż dla rybozymu mini-
cyficznych, oddziałujących z zasadami w większej odległo- malnego [60]. Potwierdzono, że oddziaływania wybrzuszeń
ści od centrum reakcji [57]. Kation może być wiązany ko- helis I i II prowadzą do zmian struktury rybozymu w miej-
ordynacyjnie przez zasadę, która odgrywa rolę katalizatora scu aktywnym oddalonym o ponad 10 Š[59]. Ich usunięcie
kwasowego w modelu kooperatywnego działania zasada- prowadzi do utworzenia struktury charakterystycznej dla
-metal. Obecność drugiego kationu w roli strukturalnej by- minimalnego rybozymu z zachowaniem orientacji helis i
łaby niezbędna do kształtowania centrum katalitycznego, aranżacją rdzenia katalitycznego do konformacji otwartej
przesunięcia równowagi w kierunku aktywnej konformacji nieaktywnej [61]. Tego typu mechanizm allosteryczny ob-
lub stabilizacji ujemnego ładunku stanu przejściowego [57]. serwowany jest w przypadku innych motywów ze struktu-
Na podstawie symulacji komputerowych zaproponowano, rÄ… typu  Y [15].
że jon dwuwartościowy migruje z dalszego miejsca wiąza-
nia pomiędzy A9 i G10. Sugeruje się, że może on tworzyć Motywy TSM w naturalnie występujących rybozymach
połączenie pomiędzy tlenem fosforanu przy A9 a tlenem hammerhead różnią się od siebie. W przypadku rybozy-
26 www.postepybiochemii.pl
mu hammerhead virusa sTRSV (ang. satellite RNA of tobacco
ringspot virus) potwierdzono tworzenie pary zasad typu
Hoogsteen pomiędzy adenozyną pętli helisy II a urydyną
niehelikalnego regionu helisy I [23]. Oddziaływanie to ma
charakter ewolucyjnie zachowawczy w większości natural-
nych rybozymów hammerhead, co wskazuje na jego istotność
funkcjonalnÄ…. W rezultacie zmian konformacyjnych reszta
A przy końcu 3 pętli helisy II może tworzyć parę z wy-
eksponowaną resztą U przy końcu 5 pętli helisy I [62]. Te
cechy oddziaływań trzeciorzędowych występują w wielu
naturalnych HHRz [62].
Dla niektórych wydłużonych wariantów rybozymów
hammerhead, które wykazywały niską aktywność in vitro
obserwowano tworzenie alternatywnych struktur kom-
pleksów rybozym:substrat wolniej migrujących w żelu
poliakryloamidowym [20]. Może być to czynnik limitujący
szybkość reakcji [63].
PORóWNANIE RYBOZYMU
MINIMALNEGO Z WYDA
UŻONYM
Wydłużone rybozymy hammerhead wykazują wysoką ak-
tywność in vitro, często 50 do 500 razy lepszą niż wariant
minimalny (Tab. 3) [58,61,64].
Rycina 6. Porównanie domen katalitycznych minimalnego (A) i wydłużonego
(B) rybozymu hammerhead. Miejsce hydrolizy oznaczono strzałką. Numeracja nu-
W strukturze rdzenia katalitycznego minimalnego
kleotydów zgodnie z [14]. (A) W rybozymie minimalnym zasada G8 oddziałuje
HHRzM można wyróżnić dwie odrębne domeny (5 -(3)
z A13 pomiędzy parami G12-A9 i A14-U7 w obrębie domeny 2, natomiast reszta
CUGA(6)-3 oraz 5 -(7)UGA(9) połączone wiązaniem typu
C17 połączona jest z C3 jednym wiązaniem wodorowym znajdując się pomię-
dzy parą G2.1-C1.1 a U4 w obrębie domeny 1. (B) W rybozymie wydłużonym
Watsona Cricka z 5 -(12)GAA(14)-3 (Ryc. 6). W rybozymie
nukleotydy G8 oraz U7 umieszczone sÄ… w kieszeni katalitycznej. G8 znajduje siÄ™
minimalnym nukleotyd G8 oddziałuje z A13 pomiędzy pa-
w pozycji zajmowanej przez nukleotyd C17 w strukturze rybozymu minimal-
rami G12-A9 i A14-U7 w obrębie domeny 2, natomiast resz- nego tworząc wiązania typu Watsona-Cricka z C3, natomiast U7 leży w bliskim
sąsiedztwie U4. Para C3-G8 jest zlokalizowana pomiędzy terminalną parą G2.1-
ta C17 połączona jest z C3 jednym wiązaniem wodorowym,
-C1.1 helisy I a U7. Obecność dodatkowych nukleotydów w obrębie kieszeni
znajdując się pomiędzy parą G2.1-C1.1 a U4 w obrębie do-
katalitycznej powoduje przesunięcie położenia reszty C17 (miejsce hydrolizy) w
meny 1 [65]. bezpośrednie sąsiedztwo centrum katalitycznego (G12, A13 i A14). Domeny ka-
talityczne zaznaczono szarymi owalami.
Oddziaływania pętli helisy II z wybrzuszeniem helisy I
twie U4. Powoduje to przesunięcie reszty C17 (miejsce hy-
w rybozymie o pełnej długości powodują zmianę geome-
drolizy) w bezpośrednie sąsiedztwo centrum katalitycznego
trii miejsca aktywnego poprzez umieszczenie nukleotydów
(G12, A13 i A14). Para C3-G8 jest zlokalizowana pomiędzy
G8 oraz U7 w kieszeni katalitycznej (Ryc. 3, Ryc. 6) [65]. G8
terminalnÄ… parÄ… G2.1-C1.1 helisy I a U7 [65]. Substytucja nu-
znajduje siÄ™ w pozycji zajmowanej przez nukleotyd C17 w
kleotydów C3 i G8 z zachowaniem parowania zasad, utrzy-
strukturze rybozymu minimalnego tworzÄ…c wiÄ…zania typu
muje aktywność katalityczną rybozymu [34].
Watsona-Cricka z C3, natomiast U7 leży w bliskim sąsiedz-
Tabela 3. Porównanie właściwości rybozymów hammerhead  minimalnego i wydłużonego.
Cecha Rybozym minimalny Rybozym wydłużony
Ilość rozwiązanych struktur krystalicznych 6 3
Aktywność in vitro względem spontanicznej
~106 ~108-109
degradacji wiÄ…zania RNA
Aktywność in vivo niska wysoka
zwarty
2 domeny
C17 w centrum katalitycznym
C17 oddalona od centrum katalitycznego
Rdzeń katalityczny G8 oddziałuje z A13
G8 oddziałuje z C3
C17 oddziałuje z C3
C17 w pobliżu G12, A13, A14
G12 oddziałuje z A9
Dominująca konformacja otwarta, nieaktywna zamknięta, aktywna
Zależność od jonów dwuwartościowych wysoka (10 mM in vitro) niska (1 mM in vitro)
Oddziaływania współosiowe helis tak tak
Oddziaływania trzeciorzędowe brak tak
Wielkość ~32 nt ~55 nt
Postępy Biochemii 59 (1) 2013 27
GNRA rybozymu, a partnerem w helisie I zależą od ekspo-
Struktura wydłużonego rybozymu wskazuje na udział
zycji adenozyny do utworzenia wiÄ…zania typu Hoogsteen i
nukleotydów G8 i G12 w mechanizmie katalizy kwasowo-
sÄ… zwiÄ…zane z termodynamicznÄ… rywalizacjÄ… z konformacjÄ…
-zasadowej [22]. Centrum katalityczne rybozymu wydłużo-
kanoniczną w odizolowanej pętli. Z kolei w wielu przypad-
nego zwija się w jeden zwarty rdzeń, w którym atakowany
kach naturalnych wydłużonych rybozymów hammerhead
fosforan sÄ…siaduje z resztami o potencjalnie katalitycznym
zachowana w ewolucji urydyna tworzÄ…ca parÄ™ typu Ho-
charakterze [65]. Produkt 5 reakcji wydłużonego rybozy-
ogsteen z adenozyną pętli GNRA ma możliwość tworzenia
mu HHRz dysocjuje 100-300 razy wolniej niż w przypadku
równocześnie pary AU lub GU. Zatem elementy struktural-
mutantów pozbawionych oddziaływań trzeciorzędowych
ne mogą występować w różnych konformacjach [66]. W ob-
[56]. Jest to spowodowane zwijaniem siÄ™ rdzenia katali-
rębie rdzenia katalitycznego dochodzi do obrotu G8, która
tycznego wokół reszty C17. Usunięcie reszty C17 powodu-
tworzy parÄ™ z A13 helisy II w strukturze o niskiej aktywno-
je dysocjację produktu reakcji z szybkością porównywalną
ści, natomiast parę z C3 helisy I w strukturze aktywnej.
do produktu 5 minimalnego HHRzM [56]. Przyjęcie przez
rybozym minimalny aktywnej konformacji wymaga zmian Na podstawie symulacji komputerowych rybozymów
geometrii centrum katalitycznego, aż do przyjęcia struktury oraz ich mutantów zaproponowano, że kluczowe dla utrzy-
odpowiadajÄ…cej konformacji podstawowej rybozymu wy- mania aktywnej konformacji rybozymu jest parowanie Wat-
dłużonego. sona-Cricka pomiędzy G8 i C3, sieć wiązań wodorowych
pomiędzy C17 a G5 oraz oddziaływania warstwowe (ang.
Analizując aktywności mutantów wydłużonego rybo- base stacking) zasad G8 i C1.1 [46]. Umożliwiają one ustawie-
zymu Schistosoma mansoni zasugerowano istnienie sieci nie liniowo grupy atakujÄ…cej i opuszczajÄ…cej [66].
wiązań wodorowych pomiędzy N1A14-NH2G5, N6A13-
MODYFIKACJE STRUKTURALNE
-O2C17, 2 OHG5-N3A15.1 oraz N1/O6G12-2 OHC17 [61].
RYBOZYMóW hammerhead
WiÄ…zania wodorowe G10.1-C11.1, A15.1-U16.1 oraz C3-G8
są prawdopodobnie niezbędne do stabilizacji rdzenia kata-
litycznego [61]. Jednym z ograniczeń związanych z zastosowaniem ka-
talitycznych RNA jako terapeutyków jest zależność ich ak-
Reakcje hydrolizy i ligacji katalizowane przez minimal- tywności od wysokiego stężenia jonów magnezu. In vitro,
ny rybozym hammerhead mogą być opisane przez trzy sta- najwyższą wydajność hydrolizy RNA katalizowaną przez
łe równowagi: i) szybka izomeryzacja pomiędzy wieloma minimalny rybozym HHRzM obserwuje się w obecności 10
nieaktywnymi konformacjami i jedną aktywną K rybozy- mM Mg2+ [45], podczas gdy stężenie magnezu w komórce
u
mu przed reakcjÄ…, ii) kataliza prowadzona przez aktywny waha siÄ™ w zakresie 0,5-1 mM [67]. Podstawowym celem
rybozym Kint zależna od równowagi pomiędzy stałymi re- w projektowaniu nowych katalitycznych kwasów nukle-
akcji cięcia (k2) a ligacji (k ); iii) szybka izomeryzacja jed- inowych jest zwiększenie ich aktywności katalitycznej w
-2
nej aktywnej konformacji po reakcji do wielu możliwych niskich stężeniach jonów magnezu.
konformacji nieaktywnych K (Ryc. 7) [65]. Na tej podstawie
c
oszacowano, że przeciętnie rybozym przed reakcją przyj- Jeden z wariantów rybozymu HHRz wykazujący wyso-
muje aktywną konformację tylko przez 0,2% czasu, a po hy- ką aktywność w niskich stężeniach Mg2+ uzyskano poprzez
drolizie pozostaje w tej konformacji przez 0,03% czasu [65]. skrócenie helisy II [68]. Transkrypt zawierający multime-
ryczny rybozym hammerhead Rz1-7 przeciwko siedmiu miej-
Porównanie struktur dwóch wydłużonych HHRzW Smą scom w transkrypcie docelowym okazał się wysoce skutecz-
i sTRSV o różnych wartościach Kint pozwoliło na postawie- ny in vitro oraz in vivo w obniżaniu poziomu białka CCR5 w
nie hipotezy o istnieniu mechanizmu konformacyjnego potencjalnej terapii AIDS [69].
przełącznika pomiędzy reakcją cięcia i ligacji. Kieruje on
zmianami w regionach oddziaływań trzeciorzędowych jak Dotychczas do stabilizacji struktury trzeciorzędowej ry-
i w rdzeniu katalitycznym [66]. Interakcje pomiędzy pętlą bozymów wykorzystywano naturalne motywy TSM, ota-
czajÄ…ce ich domenÄ™ katalitycznÄ… [21,64,65,70]. NowÄ… genera-
cję efektywnych HHRz działających in trans projektowano
poprzez wydłużenie helisy I i zastąpienie pętli wybrzusze-
niem lub wprowadzenie do helisy I końców 5 i 3 odpo-
wiednio rybozymu i substratu [58]. Najbardziej aktywne
in trans sÄ… pochodne rybozymu wirusa PLMVd (ang. peach
latent mosaic viroid) oraz sTRSV [58].
Rycina 7. Schemat równowagi dynamicznej reakcji cięcia-ligacji rybozymu mi-
Stabilizację struktury trzeciorzędowej rybozymów moż-
nimalnego. (A) Większość cząsteczek rybozymu hammerhead przed hydrolizą
na uzyskać także poprzez dołączenie motywów, które na-
tworzy dynamiczną pulę struktur, które przypominają strukturę krystaliczną
rybozymu minimalnego. (B) Niewielka frakcja czÄ…steczek zdefiniowana przez
turalnie występują w innych cząsteczkach RNA. Recepto-
stałą równowagi K nietrwale przyjmuje aktywną konformację, która przypo-
u
ry czteronukleotydowych pętli GNRA zaangażowane są
mina strukturę krystaliczną rybozymu wydłużonego. Wewnętrzna stała równo-
w oddziaływania trzeciorzędowe i występują w intronach
wagi cięcia/ligacji (Kint) opisana jest jako stosunek stałej cięcia (k2) i ligacji (k ).
-2
(C) Struktura aktywnej cząsteczki po reakcji znajduje się w równowadze K z
grupy I i II oraz RNazie P [71]. Rybozym TLR-HRz-gp41
c
mieszaniną nieaktywnych struktur, które przypominają strukturę krystaliczną
hydrolizujÄ…cy transkrypt genu gp41 wirusa HIV-1 zapro-
rybozymu minimalnego. (D) CzÄ…steczki rybozymu hammerhead po reakcji tworzÄ…
jektowano poprzez dołączenie do końca 5 minimalnego
dynamicznÄ… pulÄ™ struktur. Na podstawie [65]. Czarny  rybozym, niebieski 
substrat przed reakcjÄ…; zielony  produkty reakcji.
rybozymu HHRzM fragmentu RNA zawierajÄ…cego motyw
28 www.postepybiochemii.pl
receptora dla czteronukleotydowej pętli GAAA [72]. Przy-
Tabela 4. Przykłady organizmów eukariotycznych, u których zidentyfikowano
jęto, że oddziaływania pomiędzy czteronukleotydową pę-
rybozym hammerhead [81].
tlą i jej receptorem będą stabilizować aktywną konformację
Nazwa Liczba
rdzenia katalitycznego podnosząc wydajność hydrolizy w
Grupa Gatunek
potoczna motywów
niskich stężeniach jonów magnezu [72]. Analizowany rybo-
Homo sapiens człowiek 2
zym wykazywał wyższą aktywność katalityczną w porów-
Macaca mulatta makak 3
naniu do wariantu minimalnego wobec tej samej czÄ…steczki
Microcebus murinus lemur mysi 3
docelowej RNA HIV-1.
Naczelne Otolemur garnettii lemur 1
(bushbaby)
Zaproponowano również metodę łączenia kilku cząste-
Pan troglodytes szympans 1
czek katalitycznych w jednym konstrukcie, co wzmacnia
Tarsius syrichta lemur (tarsier) 4
jego aktywność. Zaprojektowany chimeryczny transkrypt
Cavia porcellus świnka morska 2
zawierający połączone łącznikiem shRNA (ang. short ha-
Mus musculus mysz 3
irpin RNA) oraz HHRz skierowane przeciwko segmento-
Ochotona princeps pika 2
wi M1 genomu wirusa grypy typu A wykazywał wyższą
Gryzonie Oryctolagus cuniculus królik 2
aktywność i ochronę przed infekcją niż osobno stosowane
Rattus norvegicus szczur 2
Spermophilus
pojedyncze elementy nawet po zsumowaniu ich osobnych
tridecemlineatus wiewiórka 1
efektów [73]. Rybozym może być połączony z aptamerem
Bos taurus krowa 2 tworząc tzw. aptazym, co daje możliwość kontrolowania
Canis familiaris pies 4
jego aktywności. Indukowany teofiliną rybozym hammerhe-
Equus caballus koń 3
ad zastosowano do kontroli ekspresji genu reporterowego
Myotis lucifugus nietoperz 1
Laurasiatheria
[74]. Innym przykładem modyfikacji struktury rybozymu
Sorex araneus ryjówka 1
jest dołączenie przy końcu 5 promotora dla tRNAVal oraz
Sus scrofa świnia 1
przy końcu 3 sygnału rekrutacji helikazy do skutecznej
Tursiops truncates delfin 1
Vicugna pacos alpaka 2
degradacji prnp mRNA [75]. Helikaza po przyłączeniu do
cząsteczki prowadzi do rozplecenia mRNA, co umożliwia
Echinops telfairi tenrek mniejszy 4
Afrotheria
Loxodonta Africana słoń 1
rybozymowi dostęp do dowolnego miejsca w cząsteczce.
Choloepus hoffmanni leniwiec 2
Xenartha
Dasypus novemcinctus pancernik 2 Rybozymy można wykorzystać do degradacji docelo-
wych RNA kodowanych w genomie jÄ…drowym jak i mito-
Macropus eugenii walabia 1
Inne ssaki
chondrialnym. Utworzono chimeryczny konstrukt posiada-
Manodelphis domestica opos 3
jÄ…cy sekwencjÄ™ rybozymu hammerhead, Å‚Ä…cznik, sekwencjÄ™
Gallus gallus kurczak 1
Ptaki i gady
kierujÄ…cÄ… typu tRNA (TLS, ang. tRNA-like structure) oraz
Taeniopygia guttata zięba 2
sekwencjÄ™ rybozymu HDV in cis kodowany w wektorze
Xenopus tropicalis żaba 8
PÅ‚azy
[76]. Po transfekcji ulegał on transkrypcji w jądrze komór-
afrykańska
kowym i był aktywnie kierowany do mitochondrium, gdzie
Danio rerio danio 2
skutecznie degradował docelowy mRNA. Zaproponowana
Ryby pręgowany
strategia stanowi przełom w analizie i manipulacji mito-
Tetraodon nigroviridis tetraodon 1
chondriami in vivo. Do tej pory badania transkrypcji, prze-
Aedes aegypti komar żółtej 1
twarzania, edycji, stabilności i degradacji RNA organelli
febry
Culex quinquefasciatus komar 2
półautonomicznych były badane jedynie in vitro lub in or-
Drosophila persimilis muszka 3
ganello. Daje to także nadzieje na terapię chorób mitochon-
owocowa
drialnych [77].
Owady
Drosophila muszka 5
pseudoobscura owocowa
RYBOZYM hammerhead W GENOMACH
Nasonia vitripennis osa 2
RóŻNYCH ORGANIZMóW
Tribolium castaneum trojszyk
gryzÄ…cy 2
Od czasu zidentyfikowania rybozymów typu hammerhe-
Arabidopsis lyrata tasznik 3
Arabidopsis thaliana tasznik 3
ad w genomach wirusowych pojawiały się kolejne doniesie-
Rośliny
Physcomitrella patens mech 1
nia na temat ich występowania w różnych organizmach. W
Vitis vinifera winorośl 2
2008 roku odkryto wysoce aktywny rybozym hammerhead
Aspergillus flavus żółta pleśń 1
w obrębie regionu 3 UTR ludzkiego genu CLEC2 [78]. Wy-
Grzyby Aspergillus oryzae pleśń Koji 1
kazano, że cząsteczka ta jest aktywna in cis zarówno in vitro
Pichia stipitis drożdże pichia 1
jak i in vivo oraz wysunięto hipotezę o jej roli w postaci eu-
Caenorhabditis nicień 1
kariotycznego ryboprzełącznika [66]. Niektóre z cząsteczek
briggsae
posiadajÄ… dodatkowe elementy stabilizujÄ…ce strukturÄ™ trze-
Caenorhabditis nicień 1
ciorzędową oraz obszerne motywy mogące pełnić funkcje
Inne wieloko- remanei
kontrolną [7]. Część z nich występuje w pojedynczych, od-
mórkowce Hydra magnipapillata stułbia 35
Ixodes scapularis kleszcz jeleni 1
izolowanych miejscach w genomie, a inne w tandemowych
Schistosoma japonicum przywra krwi 2
powtórzeniach [79]. Nie można wykluczyć, że rybozymy te
Schistosoma mansoni przywra krwi 24
odgrywają rolę regulatorów ekspresji genów. Sugeruje się,
że naturalne HHRz występujące w intronach w zmienio-
Postępy Biochemii 59 (1) 2013 29
Rycina 8. Rozpowszechnienie sekwen-
cji rybozymu hammerhead w różnych
domenach świata żywego. Dotychczas
znane były 364 przykłady naturalnie
występujących motywów HH. Liczba ta
obecnie wynosi 11014. Na podstawie [7].
nych warunkach mogą wpływać na elongację transkrypcji turalnych cząsteczek RNA, co pozwala nam coraz lepiej po-
lub oddziaływać z maszynerią spliceosomu, prowadząc do jąć funkcjonalną architekturę rybozymów.
alternatywnego składania [79].
Odkrywanie nowych motywów katalitycznych w obrę-
bie transkryptomu może w przyszłości pozwolić lepiej zro-
W obrębie flory bakteryjnej człowieka zidentyfikowano
zumieć mechanizmy kontroli ekspresji genów. Konieczne
kolejnych 20 kandydatów na nowe rybozymy hammerhead
są dalsze badania genetyczne i biochemiczne, aby określić,
[80]. Spośród cząsteczek działających in cis, 12 rybozymów
czy motywy te są w pełni funkcjonalne oraz jakiej podlegają
wykazało najwyższą szybkość reakcji in vitro zaproponowa-
regulacji.
ną do tej pory. Dzięki analizom bioinformatycznym znale-
ziono kolejne 284 unikalne motywy, z czego 124 stanowi-
ły znane rybozymy hammerhead z patogenów roślinnych i Niezbędnym etapem rozwoju terapii genowej w oparciu
Arabidopsis thaliana [81]. Pozostałe 160 cząsteczek stanowi- o kwasy nukleinowe jest projektowanie nowych rybozy-
ło nowe przykłady rybozymów hammerhead z 50 różnych mów o wysokiej aktywności in vivo. Obecnie przeważa po-
genomów. Występowały one w regionach powtórzonych, gląd, że wydłużenie rybozymu minimalnego o dodatkowe
intronach lub regionach kodujących białka (Tab. 4, Ryc. 8) motywy stabilizujące ma większe znaczenie dla cząsteczki
[81]. Jest mało prawdopodobne, aby wszystkie te motywy niż udział jonów metali. Wykorzystanie wysoce aktywnych
pochodziły od jednej sekwencji, która uległa zmianom w rybozymów hammerhead w badaniach podstawowych jak i
trakcie ewolucji. Najprawdopodobniej pojawiały się one de do celów praktycznych w tym terapii chorób, stanowi nadal
novo kilkakrotnie. istotne zagadnienie biologii molekularnej. Rozwój technolo-
gii opartych o katalityczne RNA być może pozwoli wkrótce
Rozmieszczenie sekwencji rybozymów w genomach su- także na terapię chorób kodowanych mitochondrialnie.
geruje, że pełnią one funkcje odmienne od zaproponowa-
PIÅšMIENNICTWO
nych dla pierwszych HHRz. W niektórych przypadkach
obserwowano tolerancję dla zmian nukleotydów w obrębie 1. Wan Y, Kertesz M, Spitale RC, Segal E, Chang HY (2011) Understand-
ing the transcriptome through RNA structure. Nat Rev Genet 12: 641-
rdzenia katalitycznego [7]. Do tej pory zidentyfikowano po-
655
nad 10 tysięcy przykładów rybozymów hammerhead typu I,
2. Scott WG (2010) What can the new hammerhead ribozyme structu-
II i III, co czyni go najczęściej występującym motywem au-
res teach us about design? RNA technologies and their applications,
tokatalitycznym w naturze [7].
W: Erdmann VA, Barciszewski J (red) RNA Technologies and Their
Applications, RNA Technologies. Springer-Verlag Berlin Heidelberg,
PERSPEKTYWY
str. 305-323
3. Kruger K, Grabowski PJ, Zaug AJ, Sands J, Gottschling DE, Cech TR
Wiedza na temat elementów budulcowych oraz reguł
(1982) Self-splicing RNA: autoexcision and autocyclization of the ri-
bosomal RNA intervening sequence of Tetrahymena. Cell 31: 147-157
rządzących składaniem biologicznych makrocząsteczek w
skomplikowane struktury stanowi podstawÄ™ modelowania 4. Silverman SK (2008) Nucleic acid enzymes (ribozymes and deoxyribo-
zymes): in vitro selection and application. Wiley encyclopedia of che-
i projektowania nowych obiektów. Analiza trzeciorzędowej
mical biology. John Wiley & Sons, Inc.
struktury RNA jest niezwykle istotna dla wszystkich obsza-
5. Scherer LJ, Rossi JJ (2003) Approaches for the sequence-specific knock-
rów badań biomolekularnych. Powstają nowe metody bio-
down of mRNA. Nat Biotechnol 21: 1457-1465
informatyczne i matematyczne, majÄ…ce na celu uzyskanie
6. Doudna JA, Cech TR (2002) The chemical repertoire of natural ribozy-
wiernych modeli struktury trzeciorzędowej RNA. Badania
mes. Nature 418: 222-228
z dziedzin bioinformatyki, biologii eksperymentalnej i kry-
7. Perreault J, Weinberg Z, Roth A, Popescu O, Chartrand P, Ferbeyre
stalografii uzupełniają obraz zależności funkcjonalno-struk-
G, Breaker RR (2011) Identification of hammerhead ribozymes in all
30 www.postepybiochemii.pl
domains of life reveals novel structural variations. PloS Comp Biol 7: 32. Fedor MJ, Uhlenbeck OC (1990) Substrate sequence effects on ham-
e1002031 merhead RNA catalytic efficiency. Proc Nat Acad Sci USA 87: 1668-
1672
8. Bora RS, Gupta D, Mukkur TK, Saini KS (2012) RNA interference the-
rapeutics for cancer: Challenges and opportunities. Mol Med Report 33. Hertel KJ, Herschlag D, Uhlenbeck OC (1994) A kinetic and thermody-
6: 9-15 namic framework for the hammerhead ribozyme reaction. Biochemis-
try 33: 3374-3385
9. Singh S, Narang AS, Mahato RI (2011) Subcellular fate and off-target
effects of siRNA, shRNA, and miRNA. Pharm Res 28: 2996-3015 34. Hertel KJ, Herschlag D, Uhlenbeck OC (1996) Specificity of hammer-
head ribozyme cleavage. EMBO J 15: 3751-3757
10. Bruening G (1989) Compilation of self-cleaving sequences from plant
virus satellite RNAs and other sources. Methods Enzymol 180: 546-558 35. Crissel P, Thompson S, James W (1993) Inhibition of HIV-1 replication
by ribozymes that show poor activity in vitro. Nucleic Acids Res 21:
11. Branch AD, Robertson HD (1984) A replication cycle for viroids and
5251-5255
other small infectious RNA s. Science 223: 450-455
36. Kore AR, Vaish NK, Kutzke U, Eckstein F (1998) Sequence specificity
12. Symons RH (1989) Self-cleavage of RNA in the replication of small
of the hammerhead ribozyme revisited; the NHH rule. Nucleic Acids
pathogens of plants and animals. Trends Biochem Sci 14: 445-450
Res 26: 1116-1120
13. Uhlenbeck OC (1987) A small catalytic oligoribonucleotide. Nature
37. Eckstein F, Kore AR, Nakamaye KL (2001). In vitro selection of ham-
328: 596-600
merhead ribozyme sequence variants. Chembiochem 2: 629-635
14. Hammann C, Lilley DM (2002) Folding and activity of the hammer-
38. Sun LQ, Cairns MJ, Saravolac EG, Baker A, Gerlach WL (2000) Cata-
head ribozyme. Chembiochem 3: 690-700
lytic nucleic acids: from lab to applications. Pharmacol Rev 52: 325-347
15. De la Pena M, Dufour D, Gallego J (2009) Three-way RNA junctions
39. Sawata S, Shimayama T, Komiyama M, Kumar PK, Nishikawa S, Taira
with remote tertiary contacts: a recurrent and highly versatile fold.
K (1993) Enhancement of the cleavage rates of DNA-armed hammer-
RNA 15: 1949-1964
head ribozymes by various divalent metal ions. Nucleic Acids Res 21:
16. Pley HW, Flaherty KM, McKay DB (1994) Three-dimensional structure
5656-5660
of a hammerhead ribozyme. Nature 372: 68-74
40. Przybilski R, Hammann C (2007) The tolerance to exchanges of the
17. Scott WG, Finch JT, Klug A (1995) The crystal structure of an all-RNA
Watson-Crick base pair in the hammerhead ribozyme core is deter-
hammerhead ribozyme: a proposed mechanism for RNA catalytic
mined by surrounding elements. RNA 13: 1625-1630
cleavage. Cell 81: 991-1002
41. Lee TS, Giamba_
u G, Harris ME, York DM (2011) Characterization of
18. Scott WG, Murray JB, Arnold JR, Stoddard BL, Klug A (1996) Captur-
the structure and dynamics of the HDV ribozyme at different stages
ing the structure of a catalytic RNA intermediate: the hammerhead
along the reaction path. J Phys Chem Lett 2: 2538-2543
ribozyme. Science 274: 2065-2069
42. Westhof E (1999) Chemical diversity in RNA cleavage. Science 286:
19. Burke DH, Greathouse ST (2005) Low-magnesium, trans-cleavage ac-
61-62
tivity by type III, tertiary stabilized hammerhead ribozymes with stem
43. Doherty EA, Doudna JA (2001) Ribozyme structures and mechanisms.
1 discontinuities. BMC Biochem 6: 14
Annu Rev Biophys Biomol Struct 30: 457-475
20. Roychowdhury-Saha M, Roychowdhury S, Burke DH (2011) Confor-
44. Ferré-D Amaré AR, Scott WG (2010) Small self-cleaving ribozymes.
mational heterogeneity and the determinants of tertiary stabilization
Cold Spring Harb Perspect Biol 2: a003574
in the hammerhead ribozyme from Dolichopoda cave crickets. RNA
Biol 8: 1-11 45. Stage-Zimmermann TK, Uhlenbeck OC (1998) Hammerhead ribozy-
me kinetics. RNA 4: 875-889
21. Khvorova A, Lescoute A, Westhof E, Jayasena SD (2003) Sequence ele-
ments outside the hammerhead ribozyme catalytic core enable intra- 46. Lee T, York DM (2010) Computational mutagenesis studies of ham-
cellular activity. Nat Struct Biol 10: 708-712 merhead ribozyme catalysis. J Am Chem Soc 132: 13505-13518
22. Martick M, Scott WG (2006) Tertiary contacts distant from the active 47. Schnabl J, Sigel RKO (2010) Controlling ribozyme activity by metal
site prime a ribozyme for catalysis. Cell 126: 309-320 ions. Curr Opin Chem Biol 14: 269-275
23. Chi Y, Martick M, Lares M, Kim R, Scott WG, Kim S (2008) Captur- 48. Williams RJP, Fraśsto da Silva JJR (2000) The distribution of elements
ing hammerhead ribozyme structures in action by modulating general in cells. Coordin Chem Rev 200-202: 247-348
base catalysis. PloS Biol 6: 2060-2068
49. Murray JB, Seyhan AA, Walter NG, Burke JM, Scott WG (1998) The
24. Chen X, Denison L, Levy M, Ellington AD (2009) Direct selection for hammerhead, hairpin and vs. ribozymes are catalytically proficient in
ribozyme cleavage activity in cells. RNA 15: 2035-2045 monovalent cations alone. Chem Biol 5: 587-595
25. Real AN, Greenall RJ (2004) Influence of spermine on DNA confor- 50. Han J, Burke JM (2005) Model for general acid-base catalysis by the
mation in a molecular dynamics trajectory of d(CGCGAATTCGCG) hammerhead ribozyme: pH activity relationships of G8 and G12 vari-
(2): major groove binding by one spermine molecule delays the AÄ…B ants at the putative active site. Biochemistry 44: 7864-7870
transition. J Biomol Struct Dyn 21: 469-488
51. Boots JL, Canny MD, Azimi E, Pardi A (2008) Metal ion specificities for
26. Nakano S, Karimata HT, Kitagawa Y, Sugimoto N (2009) Facilitation folding and cleavage activity in the Schistosoma hammerhead ribozyme.
of RNA enzyme activity in the molecular crowding media of coso- RNA 14: 2212-2222
lutes. J Am Chem Soc 131: 16881-16888
52. Curtis EA, Bartel DP (2001) The hammerhead cleavage reaction in mo-
27. Kilburn D, Roh JH, Guo L, Briber RM, Woodson SA (2010) Molecular novalent cations. RNA 7: 546-552
crowding stabilizes folded RNA structure by the excluded volume ef-
53. O Rear JL, Wang S, Feig AL, Beigelman L, Uhlenbeck OC, Herschlag D
fect. J Am Chem Soc 132: 8690-8696
(2001) Comparison of the hammerhead cleavage reactions stimulated
28. Tsuchihashi Z, Khosla M, Herschlag D (1993) Protein enhancement of by monovalent and divalent cations. RNA 7: 537-545
hammerhead ribozyme catalysis. Science 262: 99-102
54. Fedoruk-Wyszomirska A, Wyszko E, Giel-Pietraszuk M, Barciszew-
29. Bertrand EL, Rossi JJ (1994) Facilitation of hammerhead ribozyme ca- ska MZ, Barciszewski J (2007) High hydrostatic pressure approach
talysis by the nucleocapsid protein of HIV-1 and the heterogenous proves RNA catalytic activity without magnesium. Int J Biol Macro-
nuclear ribonucleoprotein A1. EMBO J 13: 2904-2912 mol 41: 30-35
30. Herschlag D, Khosla M, Tsuchihashi Z, Karpel RL (1994) An RNA 55. Fedoruk-Wyszomirska A, Giel-Pietraszuk M, Wyszko E, Szymański
chaperone activity of non-specific RNA binding proteins in hammer- M, Ciesiołka J, Barciszewska MZ, Barciszewski J (2009) The mecha-
head ribozyme catalysis. EMBO J 13: 2913-2924 nism of acidic hydrolysis of esters explains the HDV ribozyme activity.
Mol Biol Rep 36: 1647-1650
31. Sioud M, Jespersen L (1996) Enhancement of hammerhead ribozyme
catalysis by gliceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J Mol Biol 56. Shepotinovskaya I, Uhlenbeck OC (2010) Enhanced product stability
257: 775-789 in the hammerhead ribozyme. Biochemistry 49: 4494-4500
Postępy Biochemii 59 (1) 2013 31
57. Leclerc F (2010) Hammerhead ribozyme: true metal or nucleobase ca- 69. Nazari R, Ma XZ, Joshi S (2008) Inhibition of human immunodeficien-
talysis? Where is the catalytic power from? Molecules 15: 5389-5407 cy virus-1 entry using vectors expressing a multimeric hammerhead
ribozyme targeting the CCR5 mRNA. J Gen Virol 89: 2252-2261
58. Carbonell A, Flores R, Gago S (2011) Trans-cleaving hammerhead ri-
bozymes with tertiary stabilizing motifs: in vitro and in vivo activity 70. Weinberg MS, Rossi JJ (2005) Comparative single-turnover kinetic
against a structured viroid RNA. Nucleic Acids Res 39: 2432-2444 analyses of trans-cleaving hammerhead ribozymes with naturally de-
rived non-conserved sequence motifs. FEBS Lett 579: 1619-1624
59. McDowell SE, Jun JM, Walter NG (2010) Long-tertiary interactions in
single hammerhead ribozymes bias motional sampling toward cata- 71. Costa M, Michel F (1995) Frequent use of the same tertiary motif by
lytically active conformations. RNA 16: 2414-2426 self-folding RNAs. EMBO J 14: 1276-1285
60. Rueda D, Wick K, McDowell SE, Walter NG (2003) Diffusely bound 72. Fedoruk-Wyszomirska A, Szymański M, Wyszko E, Barciszewska
Mg2+ ions slightly reorient stems I and II of the hammerhead ribozyme MZ, Barciszewski J (2009) Highly active low magnesium hammerhead
to increase the probability of formation of the catalytic core. Biochem- ribozyme. J Biochem 145: 451-459
istry 42: 9924-9936
73. Kumar P, Sood V, Vyas R, Gupta N, Banerjea AC, Khanna M (2010)
61. Nelson JA, Uhlenbeck OC (2008B) Hammerhead redux: Does the new Potent inhibition of influenza virus replication with novel siRNA-chi-
structure fit the old biochemical data? RNA 14: 605-615 meric-ribozyme constructs. Antiviral Res 87: 204-212
62. Dufour D, de la Pena M, Gago S, Flore R, Gallego J (2009) Structure- 74. Ausländer S, Ketzer P, Hartig JS (2010) A ligand-dependent hammer-
function analysis of the ribozymes of chrysanthemum chlorotic mottle head ribozyme switch for controlling mammalian gene expression.
viroid: a loop-loop interaction motif conserved in most natural ham- Mol BioSyst 6: 807-814
merheads. Nucleic Acids Res 37: 368-381
75. Stobart MJ, Simon SLR, Plews M, Lamoureux L, Konx JD (2009) Ef-
63. Buskiewicz IA, Burke JM (2012) Folding of the hammerhead ribo- ficient knockdown of human prnp mRNA expression levels using hy-
zyme: Pyrrolo-cytosine fluorescence separates core folding from glob- brid hammerhead ribozymes. J Tox Env Health Part A 72: 1034-1039
al folding and reveals a pH-dependent conformational change. RNA
76. Val R, Wyszko E, Valentin C, Szymanski M, Cosset A, Alioua M, Dre-
18: 434-448
her TW, Barciszewski J, Dietrich A (2011) Organelle trafficking of chi-
64. Saksmerprome V, Roychowdhury-Saha M, Jayasena S, Khvorova A, meric ribozymes and genetic manipulation of mitochondria. Nucleic
Burke DH (2004) Artificial tertiary motifs stabilize trans-cleaving ham- Acids Res 39: 9262-9274
merhead ribozymes under conditions of submillimolar divalent ions
77. Federico A, Cardaioli E, Da Pozzo P, Formichi P, Gallus GN, Radi E
and high temperatures. RNA 10: 1916-1924
(2012) Mitochondria, oxidative stress and neurodegeneration. J Neurol
65. Nelson JA, Uhlenbeck OC (2008) Minimal and extended hammer- Sci 322: 254-262
heads utilize a similar dynamic reaction mechanism for catalysis. RNA
78. Martick M, Horan LH, Noller HF, Scott WG (2008) A discontinuous
14: 43-54
hammerhead ribozyme embedded in a mammalian messenger RNA.
66. Scott WG, Martick M, Chi Y (2009) Structure and function of regula- Nature 454: 899-902
tory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression. Biochim
79. De la Pena M, Garcia-Robles I (2010) Ubiquitous presence of the ham-
Biophys Acta 1789: 634-641
merhead ribozyme motif along the tree of life. RNA 16: 1943-1950
67. Uetani T, Matsubara T, Nomura H, Murohara T, Nakayama S (2003)
80. Jimenez RM, Delwart E, Luptak A (2011) Structure-based search re-
Ca2+-dependent modulation of intracellular Mg2+ concentration with
veals hammerhead ribozymes in the human microbiome. J Biol Chem
amiloride and KB-R7943 in pig carotid artery. J Biol Chem 278: 47491-
286: 7737-7743
47497
81. Seehafer C, Kalweit A, Steger G, Graf S, Hammann C (2011) From al-
68. Conaty J, Hendry P, Lockett T (1999) Selected classes of minimised
paca to zebrafish: hammerhead ribozymes wherever you look. RNA
hammerhead ribozyme have very high cleavage rates at low Mg2+
17: 21-26
concentration. Nucleic Acids Res 27: 2400-2407
Functional architecture of the hammerhead ribozyme
Marta M. Gabryelska*, Agnieszka Fedoruk-Wyszomirska*, Eliza Wyszko, Jan Barciszewski*ð
Institute of Bioorganic Chemistry, Polish Academy of Sciences, 12/14 Z. Noskowskiego St., 61-704 Poznań, Poland
*ð
e-mail: [e-mail]
*first two authors contributed equally to this work
Key words: RNA structure, hammerhead ribozyme, transestrification, catalytic core
ABSTRACT
Hammerhead ribozyme is the smallest naturally occurring catalytic RNA. It is a perfect model for structure-function relation studies. Initially,
it was identified as an autocatalytic part of viroid and virusoid genomic RNA. It exists within the genomes of many organisms including hu-
man, which makes it the most common autocatalytic motif in the nature. After 25 years of intensive research, there are a lot of data considering
its structure, conformational dynamics and an influence of tertiary stabilizing motifs on its stability and properties. Structure of the hammer-
head ribozyme is a system of elements that influence each other. The knowledge of ribozyme architecture is outstandingly interesting in the
context of rules and logic of design, construction and application of such molecules as spatial molecular constructions. Presence of additional
structural motifs distinguishes extended hammerhead ribozyme from the minimal one. Hammerhead ribozyme recognizes complementary
RNA and catalyses transesterification after the 5 -NUH-3 sequence. Reaction efficiency depends on an arrangement of atoms of the catalytic
core presence of metal ions and other intracellular factors. Innovative and potentially better derivatives of the hammerhead ribozyme are
objects of extensive research in the field of molecular medicine.
32 www.postepybiochemii.pl