Tom 51, 2002
Numer 3 (256)
Strony 273 281
IGOR KONIECZNY
Zespół Biologii Molekularnej, Katedra Biologii Molekularnej i Komórkowej
Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii UG/AMG
Uniwersytet Gdański
Kładki 24, 80-822 Gdańsk
e-mail: [e-mail]
PLAZMIDY O SZEROKIM ZAKRESIE GOSPODARZY
WSTĘP
Plazmidy są pozachromosomalnymi ele- się do rozprzestrzeniania różnorodnych cech
mentami genetycznymi powszechnie wystę- istotnych dla metabolizmu bakterii. Między in-
pującymi w różnych gatunkach bakterii. Pod- nymi plazmidy zapewniają: opornoS
ć na anty-
stawowymi warunkami zapewniającymi stabil- biotyki, opornoS
ć na metale ciężkie, produkcję
ne utrzymywanie się plazmidu w komórce bak- toksyn oraz degradację szerokiej gamy
teryjnej są: zdolnoS
ć replikacji DNA, kontrola związków toksycznych. Ze względu na łatwoS
ć
tego procesu oraz w wielu przypadkach syste- izolacji, prostotę manipulacji genetycznych i
my zapewniające równomierną segregację pla- stosunkowo łatwą analizę w warunkach labo-
zmidów w trakcie podziału komórkowego. ratoryjnych in vitro, systemy plazmidowe stały
WiększoS
ć plazmidów posiada zdolnoS
ć do ko- się modelowymi w badaniach procesu replika-
niugacji (transferu plazmidowego DNA pomię- cji DNA.
dzy komórkami bakteryjnymi), co przyczynia
PLAZMIDY O SZEROKIM ZAKRESIE GOSPODARZY
WiększoS
ć plazmidów posiada kolistą, su- posiadają zdolnoS
ć do replikacji i stabilnego
perzwiniętą strukturę, natomiast liniową for- utrzymywania się w wielu, często nie spokrew-
mę posiadają plazmidy wyizolowane z niektó- nionych gatunkach bakterii. DNA plazmidów o
rych gatunków bakterii z rodzaju Streptomyces szerokim zakresie gospodarzy może również
sp. czy Borrelia sp. Uważa się, że większoS
ć pla- być przekazywane na drodze koniugacji z ko-
zmidów należy do grupy okreS
lanej jako pla- mórki jednego gatunku bakterii do komórki in-
zmidy o wąskim zakresie gospodarza (ang. nar- nego gatunku bakterii, stając się tym samym
row-host-range) i jest zdolna do replikacji DNA czynnikiem horyzontalnego transferu genów
oraz transferu tylko w jednym, okreS
lonym ga- (THOMAS i HELINSKI 1989, THOMAS 1996). Wy-
tunku bakterii. W odróżnieniu od tej grupy, kazano, że zdolnoS
ć koniugacji nie jest ograni-
plazmidy okreS
lane jako plazmidy o szerokim czona jedynie do transferu pomiędzy komórka-
zakresie gospodarzy (ang. broad-host-range) mi bakteryjnymi, ale również dotyczy transferu
Prowadzone przez nasz zespół badania nad molekularnymi mechanizmami związanymi z metabolizmem DNA
plazmidów o szerokim zakresie gospodarzy, należącymi do grupy IncP, finansowane są ze S
rodków Komitetu Ba-
dań Naukowych oraz z funduszy Europejskiej Organizacji Biologii Molekularnej.
274 IGOR KONIECZNY
DNA z bakterii do komórek eukariotycznych HELINSKI i współaut. 1996). Wykazano rów-
(HEINEMANN i SPRAGUE 1989). Kilka dobrze ge- nież, że niektóre z naturalnie występujących
netycznie scharakteryzowanych plazmidów z plazmidów izolowanych w S
rodowisku mor-
grupy niezgodnoS
ci IncP1 (RK2), IncQ skim są w stanie utrzymywać się w wielu nie
(RSF1010), IncW (pSa) i IncN (pCU1) utrzymu- spokrewnionych ze sobą gatunkach bakterii
je się stabilnie w rożnych gatunkach bakterii (SOBECKY i współaut. 1998)
(DEL SOLAR i współaut. 1993, 1996, 1998;
STRUKTURA ORIGIN I MECHANIZM REPLIKACJI DNA
Do tej pory badania replikacji plazmidowe- matrycę DNA umożliwiając w ten sposób
go DNA ograniczone były głównie do grupy utworzenie i propagację kompleksu replikacyj-
plazmidów o wąskim zakresie gospodarzy i nego. Origin może również posiadać rejon bo-
bakterii Escherichia coli jako gospodarza dla gaty w reszty guaniny i cytozyny (rejon G+C).
tych plazmidów. Mimo dużej różnorodnoS
ci Innym charakterystycznym elementem origin
replikonów plazmidowych opisano dwa pod- replikacji są wielokrotnie powtórzone se-
stawowe schematy inicjacji replikacji kolistego kwencje-iterony. Szeroka grupa plazmidów po-
plazmidowego DNA. Pierwszy zakłada regula- siada te sekwencje, które są miejscami wiąza-
cję inicjacji replikacji poprzez antysensowną nia, kodowanego przez plazmid, białka ini-
cząsteczkę RNA, która poprzez hybrydyzację cjującego proces replikacji DNA (Rep). Wyka-
reguluje częstoS
ć inicjacji (DEL SOLAR i zano, że iterony występują w origin replikacji
współaut. 1998, HELINSKI i współaut.1996). plazmidów o szerokim zakresie gospodarzy na-
Przykłady tego typu inicjacji replikacji to pla- leżących między innymi do grup IncQ oraz
zmidy z grupy ColEI oraz plazmidy RC (ang. rol- IncP (Ryc. 1). IloS
ć sekwencji powtórzonych
ling circle) takie jak pT181, pUB110 czy może wpływać na stabilnoS
ć DNA plazmidu w
pMV158, których replikacja zachodzi według okreS
lonych gatunkach bakterii (SCHMID-
modelu (toczącego się koła). Drugi mecha- HAUSER i współaut. 1983). Oprócz miejsc
nizm inicjacji replikacji plazmidowego DNA wiązania plazmidowego białka Rep origin
dotyczy plazmidów kodujących własne białka może zawierać jedną bądx
kilka sekwencji spe-
inicjatorowe (Rep), które wiążą się do specy- cyficznych dla wiązania bakteryjnego białka
ficznych powtórzonych sekwencji (iteronów) DnaA (sekwencje DnaA-box). Białko E. coli
w obrębie miejsca startu replikacji plazmido- DnaA jest czynnikiem inicjującym replikację
wego DNA (ang. origin, ori), a ich replikacja za- DNA chromosomalnego, jakkolwiek wykaza-
chodzi według modelu . Do intensywnie ba- no, że może tworzyć kompleksy w origin róż-
danych plazmidów tej grupy należą między in- nych plazmidów. Geny kodujące białko DnaA
nymi P1, F, R6K, pSC101 i RK2. Zaproponowa- znaleziono w większoS
ci bakterii i wykazują
no dwie strategie inicjacji replikacji plazmi- one znaczny stopień podobieństwa (KAGUNI
dów o szerokim zakresie gospodarza: (i) inicja- 1997, MESSER i współaut. 2001). Wykazano, że
cja replikacji niezależna od białek replikacyj- w przypadku plazmidów IncP sekwencje Dna-
nych gospodarza oraz (ii) inicjacja replikacji, A-box warunkują możliwoS
ć replikacji plazmi-
podczas której dochodzi do współdziałania re- dów w niektórych gatunkach bakterii, podczas
plikacyjnych czynników plazmidowych z ko- gdy w innych gatunkach bakterii nie są absolut-
mórkowym aparatem replikacyjnym (DEL nie niezbędne w procesie inicjacji replikacji
SOLAR i współaut. 1996). DNA plazmidu (DORAN i współaut. 1999a,b).
Charakterystyczną cechą większoS
ci miejsc W odróżnieniu od plazmidów IncP, origin re-
inicjacji replikacji replikonów (autonomicz- plikacji plazmidów IncQ (RSF1010) nie zawie-
nych jednostek replikacyjnych takich jak ra sekwencji DnaA-box. Inicjacja replikacji
cząsteczki plazmidów, chromosomy, DNA wi- DNA tych plazmidów nie wymaga udziału
rusów czy bakteriofagów) jest występowanie białek bakteryjnych, w tym bakteryjnego
struktur bogatych w reszty tyminy i adeniny białka DnaA, i zachodzi jedynie przy udziale
(rejony A+T). W miejscach tych dochodzi do plazmidowych białek replikacyjnych według
destabilizacji dwuniciowej struktury DNA, co mechanizmu typu oddzielania nici (ang. strand
rozpoczyna proces replikacji i jest warunkiem displacement) (SCHERZINGER i współaut. 1991,
związania helikazy, która rozwija dwuniciową 1997). Plazmid RSF1010 oprócz iteronów w re-
Plazmidy o szerokim zakresie gospodarzy 275
Ryc. 1. Model inicjacji replikacji DNA plazmidów o szerokim zakresie gospodarzy posiadających wie-
lokrotnie powtórzone sekwencje  iterony.
Model przedstawia mechanizmy inicjacji replikacji plazmidów należących do grupy IncP oraz IncQ. Podczas ini-
cjacji replikacji plazmidów IncP dochodzi do wiązania inicjatorowego białka plazmidowego z wielokrotnie po-
wtórzonymi iteronami. Dochodzi do destabilizacji (otwarcia) dwuniciowej truktury DNA. Wiązanie i aktywnoS
ć
bakteryjnej helikazy w rozwijaniu helisy DNA wymaga udziału białek bakteryjnych DnaA i DnaC. Bakteryjna pri-
maza syntetyzuje startery do replikacji DNA która zachodzi jednokierunkowo na obydwu niciach (synteza nici
wiodącej i opóżnionej). W wyniku jednej rundy replikacji powstają dwie dwuniciowe cząsteczki plazmidowego
DNA. Inicjacja replikacji plazmidów IncQ nie wymaga udziału białek bakteryjnych. Wiązanie plazmidowego
białka inicjatorowego RepC destabilizuje strukturę DNA co pozwala na wiązanie plazmidowych białek helikazy
RepA oraz primazy RepB w jednym z dwóch miejsc inicjacji replikacji. Helikaza oddziela jedną z macierzystych
nici DNA (ang. strand displacement) co pozwala na ciągłą syntezę DNA z wykorzystaniem bakteryjnych polime-
raz DNA. W wyniku tego procesu powstaje jedna dwuniciowa oraz jedna jednoniciowa cząstka DNA, która na-
stępnie służy jako matryca do syntezy nici komplementarnej.
jonie inicjacji replikacji, zawiera dwie palin- ssiA, a w innych w ssiB i powoduje powstanie
dromowe sekwencje ssiA oraz ssiB, z których specyficznej struktury typu D-loop. W wyniku
niezależnie może zachodzić synteza DNA. Ko- tego procesu powstaje jedna dwuniciowa oraz
dowane przez plazmid białko RepC wiążąc się jedna jednoniciowa cząstka plazmidowego
do sekwencji iteronów owiera strukturę origin DNA, która została oddzielona od matrycy. Na-
(powoduje miejscową destabilizację dwuni- leży podkreS
lić, że w inicjacji replikacji
ciowej helisy DNA), co pozwala na związanie RSF1010 uczestniczą jedynie białka kodowane
plazmidowej helikazy RepA i w konsekwencji przez plazmid. Przypuszcza się, że kodowanie
rozwinięcie helisy DNA, oddzielenie nici sta- przez plazmid własnych białek replikacyjnych i
nowiącej matrycę dla syntezy. Synteza DNA niezależnoS
ć inicjacji replikacji DNA RSF1010
rozpoczyna się w sposób losowy w jednych od czynników bakteryjnych jest jednym z istot-
cząsteczkach plazmidowego DNA w miejscu nych elementów nadających plazmidom z gru-
276 IGOR KONIECZNY
py IncQ możliwoS
ć replikacji i utrzymywania ter sp., Rhizobium sp., Rhodopseudomonas
się w wielu gatunkach bakterii. sp., Alcaligens sp., Azospirillum sp., Thiobacil-
DNA plazmidów należących do grupy RC lus sp., Xanthomonas sp. (PANSEGRAU i LANKA
(ang. rolling circle) może zachodzić zarówno 1996, THOMAS i HELINSKI 1989). Pierwotnie zo-
w bakteriach Gram-dodatnich, jak i Gram-u- stał zidentyfikowany jako czynnik nadający
jemnych, zawiera dwa miejsca inicjacji (dso  opornoS
ć na antybiotyki patogennej bakterii
ang. double-strand-origin oraz sso  ang. single Pseudomonas aeruginosa wyizolowanej z ran
strand origin) (KHAN 2000). Inicjacja replikacji pooparzeniowych pacjentów jednego z brytyj-
tych plazmidów rozpoczyna się od wiązania skich szpitali (LOWBURY i współaut.1969). Zi-
plazmidowego białka Rep w dwuniciowym dentyfikowano go również jako pozachromo-
origin dso (Ryc. 2). Wiązanie to generuje struk- somalny element bakterii patogennych roS
lin.
Ryc. 2. Model replikacji DNA plazmidów RC.
DNA plazmidów o szerokim zakresie gospodarzy należących do grupy RC (ang. rolling circle) zawierają dwa rejo-
ny inicjacji replikacji. Inicjacja replikacji DNA rozpoczyna się poprzez wiązanie białka inicjatorowego w rejonie
dso (ang. double strand origin), nacięcie jednej z nici DNA i syntezę nici potomnej według modelu toczącego się
koła. W wyniku tej syntezy powstaje jedna dwuniciowa cząsteczka plazmidu oraz jedna jednoniciowa, której re-
plikacja zachodzi przy udziale polimeraz RNA i DNA z rejonu sso (ang. single strand origin).
turę główki od szpilki (ang. hairpin) a następ- RK2 jest więc nie tylko atrakcyjny jako modelo-
nie nacięcie dso przez białko Rep. Kolejnym wy system w badaniach podstawowych, ale
etapem jest wiązanie helikazy i synteza nici również badania nad RK2 mogą doprowadzić
wiodącej (z wykorzystaniem 3 OH wolego ko- do uzyskania wyników o walorach aplikacyj-
ńca powstałego na skutek nukleolitycznej ak- nych. Ostatnie lata przynoszą coraz więcej in-
tywnoS
ci Rep), w wyniku której powstaje jed- formacji dotyczących molekularnych mechani-
noniciowa cząsteczka DNA. Ten intermediat zmów czyniących plazmid RK2 zdolnym do
replikacyjny zawierający sso jest substratem utrzymywania się i propagacji w różnych ga-
dla syntezy nici opóx
nionej z udziałem bakte- tunkach bakterii. W przypadku plazmidu RK2
ryjnej polimerazy RNA (synteza starterów) i jedynie dwa czynniki kodowane w DNA pla-
holoenzymu DNA polimerazy III. Ostatnio za- zmidowym uczestniczą w inicjacji replikacji
proponowano, że specyficzne przejS
cie z syn- jego DNA. Są to: rejon inicjacji replikacji (oriV)
tezy jednoniciowego intermediatu na syntezę oraz białko inicjatorowe TrfA (FIGURSKI i
plazmidowej cząsteczki dwuniciowej może HELINSKI 1979, THOMAS i współaut. 1980).
być istotnym elementem nadającym plazmi- Białko inicjatorowe TrfA syntetyzowane jest w
dom RC możliwoS
ć replikacji w wielu gatun- dwóch formach: o długoS
ci 44kDa (TrfA-44)
kach bakterii (KHAN 2000). oraz 33kDa (TrfA-33). Krótka forma białka
Do grupy plazmidów IncP należy plazmid (TrfA-33) jest wystarczająca do inicjacji repli-
RK2 (identyczny z plazmidem RP4), który jest kacji RK2 w E. coli i szeregu innych bakterii.
dużym kolistym plazmidem (60kpz) wystę- Inicjacja replikacji RK2 w P. aeruginosa wyma-
pującym w szeregu bakteriach z rodziny Ente- ga dłuższej formy TrfA-44 (DURLAND i HELINSKI
robacteriace, Agrobacterium sp., Azotobacter 1987). W obrębie minimalnej sekwencji origin
sp., Bordetella sp., Vibrio sp., Methophilus sp., RK2 znajduje się pięć miejsc wiązania białka
Pseudomonas sp., Acidobacter sp., Caulobac- TrfA: cztery miejsca wiązania bakteryjnego
ter sp., Neisseria sp., Legionella sp., Acetobac- białka DnaA oraz rejon bogaty w pary A+T i re-
Plazmidy o szerokim zakresie gospodarzy 277
jon bogaty w pary G+C (KONIECZNY i współaut. teriach Gram dodatnich. Otwarcie struktury
1997). Minimalna sekwencja origin RK2 jest origin jest warunkiem związania helikazy, któ-
wystarczająca do inicjacji replikacji w E. coli ra po utworzeniu kompleksu z jedną z nici
oraz innych bakteriach Gram-ujemnych. Pozo- DNA rozwija dwuniciową helisę DNA.
stałe białka niezbędne w procesie replikacji to Mechanizm wiązania helikazy i aktywacji
białka bakteryjne (PINKEY i współaut. 1988, kompleksu helikazy niesie wiele pytań i to bez
KITTELL i HELINSKI 1991). Udało się zrekonstru- względu na badany system. Praktycznie dla
ować in vitro, z wykorzystaniem oczyszczo- żadnego modelu badawczego, prokariotyczne-
nych enzymów, reakcję replikacji RK2 go czy eukariotycznego, nie poznano w pełni
(KONIECZNY i HELINSKI 1997a). Proces ten wy- mechanizmu tworzenia kompleksu preprimo-
maga matrycy DNA zawierającej oriV, oczysz- somu  wiązania helikazy do DNA (BAKER i
czonego białka inicjatorowgo TrfA oraz białek BELL 1998, EGELMAN 1998). Nie wiadomo w
E.coli: DnaA, helikazy DnaB, białka DnaC, pri- jaki sposób najczęS
ciej pierS
cieniowe, heksa-
mazy DnaG, gyrazy, SSB  białka wiążącego po- meryczne struktury helikaz replikacyjnych
jedynczą nić DNA i holoenzymu polimerazy wiążą się z DNA. Obecnie za najbardziej praw-
DNA III. Podczas inicjacji replikacji RK2 do- dopodobne uważa się otwarcie struktury pierS
-
chodzi do wiązania białka inicjatorowego TrfA cienia i ponowne jej zamknięcie z jednonicio-
do iteronów (PERRI i współaut. 1991). Powsta- wym DNA znajdującym się w S
rodku heksame-
je kompleks inicjacyjny. Podobnie jak inne pla- ru. W ostatnich latach udało się uzyskać pierw-
zmidowe białka inicjatorowe, TrfA występuje sze opisy struktury niektórych helikaz replika-
w postaci dimeru, jednak do DNA wiąże się cyjnych (PATEL i PICHA 2000). Co ciekawe, do
jako monomer. Wykazano, że białko opiekuń- tej pory znajomoS
ć budowy krystalicznej nie
cze E. coli ClpX aktywuje TrfA podczas inicjacji spowodowała przełomu w rozumieniu bioche-
replikacji (KONIECZNY i HELINSKI 1997b). Akty- micznego mechanizmu rozwijania podwójnej
wacja ta polega na monomeryzacji dimerycz- helisy DNA. W badaniach replikacji chromoso-
nej formy białka TrfA. Podobne wyniki otrzy- mu E. coli oraz plazmidowych systemów specy-
mano dla białka inicjatorowego plazmidu P1 ficznych dla tej bakterii, opisano szereg istot-
(RepA), które jest aktywowane przez białka nych oddziaływań białek replikacyjnych z heli-
opiekuńcze DnaK, DnaJ, GrpE oraz ClpP kazą DnaB E. coli. Wykazano, że helikaza E. coli
(KONIECZNY i ŻYLICZ 1999). Ostatnio stwier- tworzy kompleks z białkiem inicjatorowym
dzono, że inne białko ClpB (należące do rodzi- DnaA (MARSZAŁEK i KAGUNI 1994). Od-
ny Hsp100) wraz z białkami opiekuńczymi działywanie to jest istotne dla powstania kom-
DnaK, DnaJ i GrpE tworzy alternatywny system pleksu preprimosomu i w konsekwencji po-
aktywujący TrfA (KONIECZNY i LIBEREK 2002). zwala na wiązanie helikazy z jednoniciowym
Wydaje się, że proces aktywacji nie jest ograni- DNA w rejonie A+T w obrębie kompleksu
czony jedynie do bakterii E. coli i aktywacja otwartego oriC. Również białka inicjatorowe
TrfA w innych gatunkach bakterii zachodzi z plazmidów, pSC101 i R6K, tworzą kompleksy z
udziałem homologicznych lub/i analogicznych helikazą (RATNAKAR i współaut. 1996, LU i
systemów białek opiekuńczych. wspólaut.1998, DATTA i wspólaut. 1999). Od-
Białko TrfA wiążąc się z sekwencjami itero- działywania te są niezbędne w inicjacji replika-
nów powoduje destabilizację podwójnej helisy cji DNA tych plazmidów, jednak rola bakteryj-
DNA w obrębie rejonu bogatego w pary A+T nego białka DnaA na tym etapie inicjacji repli-
(KONIECZNY i współaut. 1997). W odróżnieniu kacji pozostaje nie wyjaS
niona. Sugeruje się, że
od inicjacji replikacji w oriC, białko DnaA oddziaływanie białek DnaA-DnaB nie jest kry-
E. coli nie jest czynnikiem odpowiedzialnym za tyczne dla replikacji plazmidowego DNA
powstanie kompleksu otwartego RK2, a jedy- pSC101 i R6K w E. coli.
nie stabilizuje tą strukturę. Nasze badania wy- Wykazano ponadto, że w odróżnieniu od
kazały, że również białka homologiczne DnaA plazmidów pSC101 i R6K, w przypadku RK2
wyizolowane z bakterii Pseudomonas sp. stabi- inicjacja replikacji DNA tego plazmidu w ko-
lizują strukturę kompleksu otwartego oriV. W mórkach bakteii E. coli jest zależna od od-
odróżnieniu, białka DnaA Bacillus subtilis i działywania DnaA-DnaB (KONIECZY i HELINSKI
Streptomyces lividans nie stabilizują tej struk- 1997a). Etapem poS
rednim jest kompleks heli-
tury (CASPI i wspólaut. 2000). Przypuszcza się, kazy DnaB, zawierający również białka DnaA i
że może to być jeden z czynników uniemożli- DnaC, obserwowany w rejonie sekwencji Dna-
wiających inicjację replikacji DNA RK2 w bak- A-box (PACEK i współaut. 2001). Helikaza DnaB
278 IGOR KONIECZNY
przy udziale TrfA ulega translokacji do rejonu są zgodne z obserwacjami in vivo, w których
otwartego A+T. Interesujące okazały się badania mutanty delecyjne rejonu DnaA-box oriV wyka-
z wykorzystaniem helikaz wyizolowanych z zywały aktywnoS
ć replikacyjną w P. aerugino-
bakterii P. putida i P. aeruginosa. W odróżnie- sa, ale nie w E. coli (DORAN i wspólaut. 1999b), a
niu od helikazy E. coli białka te wiążą się w oriV i replikacja RK2 w P. aeruginosa wymaga
są aktywne w rozwijaniu matrycy RK2 bez udziału dłuższej formy TrfA i, w odróżnieniu od
udziału dodatkowego czynnika ATP-azy DnaC replikacji w E. coli nie jest inicjowana przez
(CASPI i współaut. 2001). Do tej pory uważano, krótką formę TrfA. Plazmid RK2, w zależnoS
ci
że udział białek posiadających aktywnoS
ć ATP-a- od gatunku bakterii, wykorzystuje odmienne
zy podczas wiązania replikacyjnych helikaz do mechanizmy inicjacji replikacji. Wydaje się
DNA jest uniwersalny i zachowany w toku ewo- więc, że zdolnoS
ć inicjacji replikacji DNA RK2
Ryc. 3. Mechanizm inicjacji replikacji plazmidu RK2 w bakteriach Escherichia coli i Pseudomonas ae-
ruginosa.
Plazmid wykorzystuje odmienne, gatunkowo specyficzne mechanizmy wiązania bakteryjnej helikazy. Podczas
inicjacji replikacji RK2 w E. coli niezbędne jest oddziaływanie helikazy DnaB z białkiem DnaA. Utworzenie kom-
pleksu helikazy w origin plazmidu wymaga też udziału białka DnaC. Podczas inicjacji replikacji RK2 w P. aerugi-
nosa wiązanie helikazy jest DnaA i DnaC niezależne. Helikaza tworzy kompleks z dłuższą formą plazmidowego
białka TrfA związanego w rejonie iteronów.
lucji. Co więcej, badania nasze wykazały, że w w różnych gatunkach bakterii wynika z uniwer-
odróżnieniu od helikazy E. coli, helikazy Pseu- salnoS
ci struktur origin tego plazmidu i wyko-
domonas sp. tworzą kompleks z dłuższą formą rzystywaniu różnych typów gatunkowo-specy-
białka TrfA związaną z iteronami, a utworzenie ficznych oddziaływań pomiędzy dwoma forma-
takiego kompleksu oraz aktywnoS
ć helikazy nie mi plazmidowego białka TrfA a bakteryjnymi
wymaga udziału białka DnaA (Ryc. 3). Wyniki te białkami replikacyjnymi.
SYSTEMY ZAPEWNIAJĄCE RÓWNOMIERNY ROZDZIAł CZĄSTEK PLAZMIDOWYCH ORAZ
PLAMIDOWE SYSTEMY PROGRAMOWANEJ R
MIERCI KOMÓRKI
Inicjacja replikacji i synteza DNA nie są je- dom o szerokim zakresie gospodarzy bytowa-
dynymi procesami zapewniającymi plazmi- nie w różnych gatunkach bakterii. Jak już
Plazmidy o szerokim zakresie gospodarzy 279
wspomniałem, jednym z procesów niezbęd- zmidowe zgrupowane są w S
ciS
le okreS
lonych
nych do rozprzestrzeniania się plazmidowych miejscach w komórce bakteryjnej i ulegają par-
cząsteczek DNA w populacji bakterii tego sa- tycji w trakcie cyklu komórkowego. Molekular-
mego gatunku lub pomiędzy różnymi gatunka- ny mechanizm tych procesów nie jest w pełni
mi bakterii jest proces koniugacji. Procesami poznany. Systemy psk, oparte zazwyczaj na ko-
niezbędnymi do stabilnej propagacji plazmido- dowanych przez plazmid toksynie i antytoksy-
wego DNA jest rozdział multimerycznych nie, eliminują z populacji komórki bakteryjne,
cząsteczek plazmidowych (ang. multimer reso- które utraciły plazmid zapewniając w ten spo-
lution systems, mrs), rozdział plazmidów do sób stabilne utrzymywanie plazmidu w popu-
komórek potomnych (ang. partitioning) oraz lacji bakterii. Należy podkreS
lić, że systemy
plazmidowe systemy programowanej S
mierci partitioning, mrs czy psk kodowane przez pla-
komórki (post segregational killing, psk). zmidy o szerokim zakresie gospodarza, takie
Obecnie procesy związane z dynamiką plazmi- jak RK2, doskonale spełniają swoją rolę w wie-
dowego DNA są intensywnie analizowane lu gatunkach bakterii. Molekularny mecha-
przez wiele grup badawczych (HIRAGA 2000, nizm czy mechanizmy tych procesów nie zo-
GORDON i WRIGHT 2000, MOLLER-JENSEN i stały w pełni poznane.
współaut. 2000). Okazało się, że cząsteczki pla-
PODSUMOWANIE
Plazmidy o szerokim zakresie gospodarzy zmów replikacji DNA w wielu gatunkach bak-
ze względu na swą specyfikę stanowią bardzo terii, oprócz aspektu czysto poznawczego,
interesujący obiekt badawczy. Dopiero teraz może pozwolić na konstrukcję nowych leków
zaczynamy poznawać kompleksowoS
ć tych po- antybakteryjnych. Interesująca wydaje się mo-
zachromosomalnych elementów genetycz- żliwoS
ć wykorzystania plazmidowych syste-
nych. Co więcej, możliwe staje się wykorzysta- mów programowanej S
mierci komórki w wal-
nie zdobywanej wiedzy w biotechnologii. Pla- ce z patogennymi drobnoustrojami. Plazmidy
zmidy o szerokim zakresie gospodarzy są wy- o szerokim zakresie gospodarzy mogą stwo-
korzystywane jako wektory pomiędzy komór- rzyć możliwoS
ci konstruowania uniwersal-
kami prokariotycznymi i eukariotycznymi. Sto- nych, specyficznych względem wielu gatun-
suje się je również jako systemy ekspresji ge- ków bakterii, S
rodków farmakologicznych no-
nów, w których precyzyjnie regulowana jest wej generacji.
iloS
ć kopii matrycy DNA. Poznanie mechani-
BROAD-HOST RANGE PLASMIDS
S u mma r y
Broad-host-range plasmids are model systems for plasmids. The discussion concerns RC (rolling circle)
exploring replication mechanisms in diverse bacterial broad-host-range plasmids replicating via sigma mode
species and can extend our understanding of univer- and the well biochemically characterized initiation of
sal rules guiding DNA metabolism. Despite extensive replication at Escherichia coli oriC. Recent extensive
work carried out in many laboratories, several critical biochemical investigations of replication initiation of
aspects of the plasmid DNA metabolism still remain narrow-host-range plasmids: pSC101, R1, P1, F, R6K,
unclear. This review is restricted to specification of and broad-host- range plasmids RSF1010 and RK2 al-
the molecular events during theta replication initia- low us to discuss the specificity of DNA replication ini-
tion of the iteron containing broad-host-range tiation at broad-host- range origins.
LITERATURA
BAKER T. A., BELL S. P., 1998. Polymerases and the repli- ad host range plasmid RK2. J. Biol. Chem. 275,
some: Machines within machines. Cell 92, 18454 18461.
295 305. CASPI R., PACEK M., CONSIGLIERI G., HELINSKI D. R.,
CASPI R., HELINSKI D. R., PACEK M., KONIECZNY I., 2000. TOUKDARIAN A., KONIECZNY I., 2001. A broad host
Interactions of DnaA proteins from distantly rela- range replicone with diffrent requirements for re-
ted bacteria with the replication origin of the bro- plication initiation in three bacterial species.
EMBO J. 20, 3262 3271.
280 IGOR KONIECZNY
DATTA H. J., KHATRI G. S., BASTIA D., 1999. Mechanism of RK2 is activated by the ClpX chaperone. Proc.
recruitment of DnaB helicase to the replication Natl. Acad. Sci. USA 94, 14378 14382.
origin of the plasmid pSC101. Proc. Natl. Acad. Sci. KONIECZNY I., ŻYLICZ M., 1999. Role of bacterial chape-
USA 96, 73 78. rones in DNA replication. Kluwer Academic/Ple-
DEL SOLAR G., MOSCOSO M., ESPINOSA M., 1993. Rolling num Publishers, New York.
circle replicating plasmids from Gram-positive KONIECZNY I., LIBEREK K., 2002. Cooperative action of
and Gram-negative bacteria: A wall falls. Mol. Escherichia coli ClpB protein and DnaK chapero-
Microbiol. 8, 789 796. ne in the activation of a replication initiation pro-
DEL SOLAR G., ALONSO J. C., ESPINOSA M., DIAZ-OREJAS R., tein. J. Biol. Chem. 277, 18483 18488.
1996. Broad-host-range plasmid replication: An KONIECZNY I., DORAN K. S., HELINSKI D. R., BLASINA A.,
open question. Mol. Microbiol. 21, 661 666. 1997. Role of TrfA and DnaA proteins in origin
DEL SOLAR G., GIRALDO R., RUIZ-ECHEVARRIA M. J., opening during initiation of DNA replication of
ESPINOSA M., DIAZ-OREJAS R., 1998. Replication and the broad host range plasmid RK2. J. Biol. Chem.
control of circular bacterial plasmids. Microbiol. 272, 20173 20178.
Molec. Biol. Rev. 62, 434 464. LOWBURY E. J. L., KIDSON A., LILLY H. A., AYLIFFEE G. A. J.,
DORAN K. S., HELINSKI D. R., KONIECZNY I., 1999a. A criti- JONES R. J., 1969. Sensitivity of Pseudomonas aeru-
cal DnaA box directs the cooperative binding of ginosa to antibiotics: emergence of strains highly
the Escherichia coli DnaA protein to the plasmid resistant to carbenicillin. Lancet 448 452.
RK2 replication origin. J. Biol. Chem. 274, LU Y. -B., DATTA H. J., BASTIA D., 1998. Mechanistic stu-
17918 17923. dies of initiator-initiator interaction and replica-
DORAN K. S., HELINSKI D. R., KONIECZNY I., 1999b. Ho- tion initiation. EMBO J. 17, 5192 5200.
st-dependent requirement for specific DnaA boxes MARSZAŁEK J., KAGUNI J. M., 1994. DnaA Protein Directs
for plasmid RK2 replication. Mol. Microbiol. 33, the Binding of DnaB Protein in Initiation of DNA
490 498. Replication in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 269,
DURLAND R. H., HELINSKI D. R., 1987. The sequence enco- 4883 4890.
ding the 43-kilodalton trfA protein is required for MESSER W., BLAESING F., JAKIMOWICZ D., KRAUSE M., MAJKA
efficient replication or maintenance of minimal J., NARDMANN J., SCHAPER S., SEITZ H., SPECK C.,
RK2 replicons in Pseudomonas aeruginosa. Pla- WEIGEL C., WEGRZYN G., WELZECK M., ZAKRZEWSKA-
smid 18, 164 9. CZERWINSKA J., 2001. Bacterial replication initia-
EELMAN E. H., 1998. Bacterial Helicases. J. Struct. Biol. tor DnaA. Rules for DnaA binding and roles of
124, 123 128. DnaA in origin unwinding and helicase loading.
FIGURSKI D. H., HELINSKI D. R., 1979. Replication of an Biochimie 83, 5 12.
origin-containing derivative of plasmid RK2 de- MOLLER-Jansen J., JENSEN R. B., Gerdes K., 2000. Plasmid
pendent on a plasmid function provided in trans. and chromosome segregation in prokaryotes.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1648 52. Trends Microbiol. 8, 313 320.
GORDON S., WRIGHT A., 2000. DNA Segregation in Bac- PACEK M., KONOPA G., KONIECZNY I., 2001. DnaA Box
teria. Ann. Rev. Microbiol. 54, 681 708 Sequences as the Site for Helicase Delivery during
HEINEMANN J. A., SPRAGUE Jr. G. F., 1989. Bacterial Plasmid RK2 Replication in Escherichia coli. J.
conjugative plasmids mobilize DNA transfer be- Biol. Chem. 276, 23639 23644.
tween bacteria and yeast. Nature 340, 205 209. PANSEGRAU W., LANKA E., 1966. Enzymology of DNA
HELINSKI D. R., TOUKDARIAN A. E., NOVICK R. P., 1996. Re- transfer by conjugative mechanisms. Prog. Nucle-
plication control and other stable maintenance ic Acid. Re. Mol. Biol. 54, 197 251.
mechanisms of plasmids. [W:] Excherichia coli PANSEGRAU W., LANKA E., BARTH P. T., FIGURSKI D. H.,
and Salmonella, cellular and molecular biology. GUINEY D. G., HAAS D., HELINSKI D. R., SCHWAB H.,
NEIDHARDT, F. C. (red.). ASM Press, Washington, D. STANISICH V. A., THOMAS C. M., 1994. Complete nuc-
C., 2, 2295 2324. leotide sequence of Birmingham IncP-alpha pla-
HIRAGA S., 2000. Dynamic Localyzation of Bacterial smids: Compilation and comparative analysis. J.
and Plasmid Chromosomes. Ann. Rev. Genet. 34, Molec. Biol. 239, 623 663.
21 59. PATEL S. S., PICHA K. M., 2000. Structure and function of
KAGUNI J. M., 1997. Escherichia coli DnaA protein: the hexameric helicases. Annu. Rev. Biochem. 69,
replication initiator. Mol. Cell. 7, 145 157. 651 697.
KHAN S. A., 2000. Plasmid rolling-circle replication: re- PERRI S., HELINSKI D. R., TOUKDARIAN A., 1991. Interac-
cent developments. Mol. Microbiol. 37, 477 484. tions of plasmid-encoded replication initiation
KITTELL B. L., HELINSKI D. R., 1991. Iteron inhibition of proteins with the origin of DNA replication in the
plasmid RK2 replication in vitro: evidence for in- broad host range plasmid RK2. J. Biol. Chem. 266,
12536 43.
termolecular coupling of replication origins as a
PINKNEY M., DIAZ R., LANKA E., THOMAS C. M., 1988. Re-
mechanism for RK2 replication control. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88, 1389 93. plication of mini RK2 plasmid in extracts of
KONIECZNY I., HELINSKI D. R., 1997a. Helicase delivery Escherichia coli requires plasmid-encoded prote-
and activation by DnaA and TrfA proteins during in TrfA and host-encoded proteins DnaA, B, G
the initiation of replication of the broad host ran- DNA gyrase and DNA polymerase III. J. Molec.
ge plasmid RK2. J. Biol. Chem. 272, 33312 33318. Biol. 203, 927 938.
KONIECZNY I., HELINSKI D. R., 1997b. The replication ini- RATNAKAR P. V., MOHANTY B. K., LOBERT M., BASTIA D.,
tiation protein of the broad-host-range plasmid 1996. The replication initiator protein pi of the
Plazmidy o szerokim zakresie gospodarzy 281
plasmid R6K specifically interacts with the ho- replicons from marine sediment bacteria. App.
st-encoded helicase DnaB. Proc. Natl. Acad. Sci. and Environment. Microbiol. 64, 2822 2830.
USA 93, 5522 5526. THOMAS C. M., 1996. Bacterial diversity and the envi-
SCHERZINGER E., HARING V., LURZ R., OTTO S., 1991. Pla- ronment: (Bacterial Genetics and Ecology, Naf-
smid RSF1010 DNA replication in vitro promoted plion, Greece, May 25 29, 1996). Trends in Bio-
by purified RSF1010 RepA, RepB and RepC prote- technology 14, 327 329.
ins. Nucleic Acid Res. 19, 1203 1211. THOMAS C. M., HELINSKI D. R., 1989. Vegetative replica-
SCHERZINGER E., ZIEGELIN G., BARCENA M., CARAZO J. M., tion and stable inheritance of IncP plasmids. [W:]
LURZ R., LANKA E., 1997. The RepA protein of pla- Promiscous plsmids of gram-negative bacteria.
smid RSF1010 is a replicative DNA helicase. J. THOMAS C. M. (red.). Academic Press, San Diego,
Biol. Chem. 272, 30228 30236. 1 25.
SCHMIDHAUSER T. J., FILUTOWICZ M., HELINSKI D. R., 1983. THOMAS C. M., MEYER R., HELINSKI D. R., 1980. Regions of
Replication of derivatives of the broad host range broad-host-range plasmid RK2 which are essen-
plasmid RK2 in two distantly related bacteria. Pla- tial for replication and maintenance. J. Bacteriol.
smid 9, 325 30. 141, 213 22.
SOBECKY P. A., MINCER T. J., CHANG M. C., TOUKDARIAN A.,
HELINSKI D. R., 1998. Isolation of broad-host-range