Mikologia Lekarska 2007, 14 (4): 221-226
Prace oryginalne / Original papers
Copyright © 2007 Cornetis
www.cornetis.com.pl
ISSN 1232-986X
Profile białkowe antygenów powierzchniowych Malassezia pachydermatis
Protein profiles of superficial antigens M. pachydermatis strains
Grażyna Ziółkowska, Aneta Nowakiewicz
Zakład Mikrobiologii Weterynaryjnej, Instytut Biologicznych Podstaw Chorób Zwierząt
Wydział Medycyny Weterynaryjnej AR w Lublinie
Streszczenie Wprowadzenie: Malassezia pachydermatis należy do powszechnie występujących komensali skóry i błon Sluzowych, w pewnych sytuacjach może
jednak odpowiadać za procesy infekcyjne, m.in. u psów zapalenie zewnętrznego kanału słuchowego (otitis) lub zapalenia skóry (dermatitis).
W okreSleniu właSciwoSci patogennych drożdżaka może być pomocna analiza porównawcza struktury antygenowej szczepów izolowanych od
zwierzÄ…t zdrowych klinicznie i z klinicznymi objawami infekcji.
Cel pracy: Uzyskanie i standaryzacja procedury otrzymywania antygenów powierzchniowych M. pachydermatis, okreSlenie ich profili białkowych
oraz analiza porównawcza antygenów powierzchniowych szczepów izolowanych od psów z objawami zapalenia zewnętrznego kanału słuchowego
i zdrowych klinicznie.
Materiał i metody: Badaniami objęto antygeny powierzchniowe szczepów M. pachydermatis, izolowanych od psów zdrowych (n=20) oraz z klinicz-
nymi objawami otitis externa (n=20). Preparaty antygenowe uzyskiwano z 3-dniowej hodowli poszczególnych szczepów, eluowanych wodnym
roztworem merthiolatu przez 1, 3 i 24 godz. Profile białkowe preparatów okreSlano na podstawie rozdziału elektroforetycznego materiału w warun-
kach zdenaturowanych (SDS-PAGE) oraz analizy elektroforegramów z zastosowaniem Gel Doc 2000.
Wyniki: Wykazano wysoki stopień zróżnicowania i złożoną strukturę poszczególnych preparatów antygenowych. Szczepy izolowane od zwierząt
chorych charakteryzowały się wyraxnie silniejszą ekspresją białkowych antygenów powierzchniowych i większym ich zróżnicowaniem (Srednia
liczba frakcji wynosiła 11), w porównaniu ze szczepami komensalicznymi, u których Srednia liczba frakcji wynosiła 5. Antygeny powierzchniowe
badanych szczepów wykazywały obecnoSć frakcji wspólnych: 68-71 kDa, 57-58 kDa, 45-46 kDa. Stwierdzono ponadto frakcje swoiste, typowe
wyłącznie dla szczepów pochodzących od psów z otitis externa; były to: 61-64 kDa, 52-53 kDa, 43-44 kDa, 38-39 kDa i 15-17 kDa (tab. II). W pro-
filach białkowych antygenów powierzchniowych patogennych szczepów M. pachydermatis stwierdzono ponadto wyższą częstotliwoSć występo-
wania frakcji: 59-60 kDa, 55-56 kDa, 49-50 kDa, 36-37 kDa, 32-33 kDa, 27-28 kDa, 25-26 kDa, 22-23 kDa, 18-20 kDa i 13-14 kDa. PrzyjmujÄ…c
50% występowania danej frakcji za wartoSć graniczną, obecnoSć prążków 55-56 kDa, 36-37 kDa, 27-28 kDa i 18-19 kDa może, w połączeniu
z obecnoScią frakcji typowo swoistych, wskazywać na patogennoSć danego szczepu M. pachydermatis.
Wnioski: 1. Szczepy M. pachydermatis izolowane od chorych zwierząt charakteryzują się większą ekspresją białek. 2. Profile białkowe antygenów
powierzchniowych M. pachydermatis cechuje obecnoSć frakcji typowych wyłącznie dla szczepów izolowanych od psów chorych i frakcji występują-
cych u znacznego odsetka szczepów patogennych . 3. Korelacja między pochodzeniem szczepów M. pachydermatis a obecnoScią okreSlonych
frakcji antygenowych w ich profilach białkowych sugeruje możliwoSć występowania białkowych markerów patogennoSci u tych grzybów.
Słowa kluczowe: Malassezia pachydermatis, zapalenie zewnętrznego kanału słuchowego, profile białkowe
Abstract Introduction: Malassezia pachydermatis is one of common commensals of skin and mucous membranes, but in some cases it can cause infec-
tions, such as otitis externa or dermatitis, especially in dogs. Using of comparative analysis of antigenic structure of strains obtained from the
healthy dogs and from those with the clinical symptoms of infection, can be helpful in evaluating the pathogenic features of this yeast.
Aim of study: Obtaining and standardization of the conditions for the surface antigens M. pachydermatis isolation, followed by the protein profiles
analysis of strains obtained from the healthy dogs and from those with the clinical symptoms of otitis externa.
Material and methods: The research material involved the surface antigens of M. pachydermatis strains obtained from the healthy dogs (n=20)
and from those with the clinical symptoms of otitis externa recognized (n=20). The antigenic preparations were obtained from a 3-day culture of
each strain, subjected to the elution with a merthyolate water solution for 1,3 and 24 h. The protein profile preparations were determined on the
grounds of the material electrophoretic separation at the denaturation (SDS-PAGE) and the electrophoregrams analysis with Gel Doc 2000.
Results: The high diversity and complex structure of individual antigen preparations were demonstrated. The strains isolated from the diseased
animals, exhibited a clear stronger expression of surface protein antigens and their higher diversity (amount of fractions was averaged 11) compa-
rison with commensalic strains in which the amount of fraction was averaged 5. Superficial antigens of investigated strains showed the presence
common fractions: 68-71 kDa, 57-58 kDa, 45-46 kDa. In addition a higher frequency of typical fractions for protein profiles of superficial antigens
of M. pachydermatis pathogenic strains was showed 61-64 kDa, 52-53 kDa, 43-44 kDa, 38-39 kDa i 15-17 kDa (tab. II) whereas their presence
wasn t demonstrated for superficial antigens of commensalic strains. Besides, the protein profiles of superficial antigens of pathogenic strains
were characterized, in relation to commensalic strains, by increased frequency of the following fractions: 59-60 kDa, 55-56 kDa, 49-50 kDa, 36-
37 kDa, 32-33 kDa, 27-28 kDa, 25-26 kDa, 22-23 kDa, 18-20 kDa i 13-14 kDa. Assuming that 50% of a specific fraction is a terminal value, the
presence of bands 55-56 kDa, 36-37 kDa, 27-28 kDa i 18-19 kDa can possibly, in combination with the presence of typical fractions, suggest
pathogenicity of specific M. pachydermatis strain.
Conclusions: 1. M. pachydermatis strains obtained from diseased animals are marked by high protein expression. 2. Protein profiles of superficial
antigens are characterized by the presence of fractions found in strains isolated from diseased dogs and fractions found statistically significant in
pathogenic strains. 3. The correlation between the origin of the strains and the presence of a given antigenic fraction in its protein profile can
suggest a possibility of protein markers of pathogenicity in these fungi.
Key words: Malassezia pachydermatis, otitis externa, protein profiles
Adres do korespondencji: Dr hab. Grażyna Ziółkowska, prof. nadzw. AR; Zakład Mikrobiologii Weterynaryjnej, Instytut Biologicznych Podstaw Chorób Zwierząt
Wydział Medycyny Weterynaryjnej AR; ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin; tel.: +48 081 445 66 96, e-mail: grazyna.ziolkowska@ar.lublin.pl 221
Grażyna Ziółkowska, Aneta Nowakiewicz
Protein profiles of superficial antigens M. pachydermatis strains Mikologia Lekarska 2007, 14 (4)
wane do badań izolowano w czystej kulturze (bez obecnoSci
Wprowadzenie
towarzyszącej bioty bakteryjnej i grzybiczej) od psów z kliniczny-
Malassezia pachydermatis (M. pachydermatis), jedyny lipi- mi objawami zapalenia zewnętrznego kanału słuchowego (oti-
tis externa) i reagujÄ…cymi pozytywnie na kuracjÄ™ antygrzybiczÄ…
doniezależny gatunek drożdżopodobnych grzybów z rodzaju
(n=20) oraz od psów zdrowych klinicznie (n=20).
Malassezia, należy do powszechnie występujących komensali
skóry i błon Sluzowych zwierząt, głównie psów (1, 2). Pod wpły- Antygeny powierzchniowe. Badane szczepy M. pachyder-
wem zmian w mikroSrodowisku bytowania drobnoustroju, osła- matis namnażano na stałym podłożu Sabourauda przez 3 dni
bienia mechanizmów obronnych gospodarza, ewentualnie in- w temp. 37°C. Uzyskany materiaÅ‚ delikatnie zbierano z podÅ‚oża,
oceniano mikroskopowo i zawieszano w jałowej wodzie destylo-
nych, trudnych do okreSlenia przy obecnym stanie wiedzy
wanej z dodatkiem 0,02% merthiolatu, w proporcji 10 ml roz-
czynników, przekształca się on w formę patogenną. Towarzyszy
tworu na 1 płytkę hodowli. Tak przygotowane zawiesiny umiesz-
chorobom na tle zaburzeń immunologicznych (alergia, atopia)
(3) lub hormonalnych (nadczynnoSć kory nadnerczy, nadczyn- czano na mieszadle magnetycznym i inkubowano przez 1,
noSć tarczycy, cukrzyca), efektem których jest wzrost wydziela- 3 i 24 godz.y w temp. 37°C, celem powolnej i Å‚agodnej elucji
nia łoju lub zmiana jego składu (4). Jako patogen M. pachyder- antygenów powierzchniowych z komórek grzyba. Następnie
preparaty wirowano w temp. 4°C przez 30 min (4×1000 g),
matis odpowiedzialny jest w 30-80% przypadków za zapalenia
a supernatanty poddawano 30-krotnemu zagęszczeniu przez
zewnętrznego kanału słuchowego (otitis externa) oraz w 30%
ultrafiltracjÄ™ w systemie Amicon-Centriprep 10. Otrzymany ma-
przypadków łojotokowego zapalenia skóry (dermatitis) (5),
zwÅ‚aszcza okolic pach, pachwin, brzucha i przestrzeni miÄ™dzy- teriaÅ‚ porcjowano po 200 µl i przechowywano w temp. -20°C.
palcowych (1). U ludzi poza zmianami skórnymi może powodo- Profile białkowe. Profile antygenów powierzchniowych po-
wać fungemie (6), szczególnie u noworodków na oddziałach in- szczególnych szczepów okreSlano na podstawie rozdziału elek-
troforetycznego w warunkach zdenaturowanych (SDS-PAGE) wg
tensywnej terapii (7).
Laemmli (11), w żelach poliakrylamidowych. Elektroforezę prze-
Ze względu na to, że zarówno otitis externa, jak i dermatitis
mogą być powodowane u psów także przez wiele innych czynni- prowadzano przy stałym natężeniu 25 mA przez około 90 min.
ków, m.in. Staphylococcus intermedius, S. hyicus, Pseudomo- Próbki badanego materiału zawieszano w buforze lizującym
(0,5 M Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, glicerol, 2-b merkaptoetanol,
nas aeruginosa, E. coli czy Streptococcus spp. (8); bardzo
istotne jest dokładne ustalenie czynnika etiologicznego choro- 0,05% błękit bromofenolowy) w stosunku 1:1 i ogrzewano
przez 3 min w temp. 90°C, a nastÄ™pnie w iloSci 20 µl wprowa-
by. Izolacja M. pachydermatis, nawet przy wysokiej zawartoSci
grzyba w pobranym materiale nie zawsze Swiadczy o jego wiru- dzano do studzienek startowych. Jako wzorca mas czÄ…steczko-
wych użyto zestaw Page ruled unstained protein ladder (Fer-
lencji. Wykazano bardzo wysoki, około 75% odsetek psów, od
których bez względu na obecnoSć lub brak objawów chorobo- mentas). Żele barwiono roztworem błękitu kumazyny (CBB
R250), a analizę poszczególnych elektroforegramów przepro-
wych izolowano M. pachydermatis (2).
Obecnie istotnym kryterium przy ustalaniu czynnika etiolo- wadzono z zastosowaniem GEl-Doc 2000.
gicznego otitis externa czy dermatitis jest izolacja ze zmian
chorobowych M. pachydermatis w czystej kulturze oraz pozy- Wyniki
tywna reakcja zwierzÄ…t na terapiÄ™ antygrzybiczÄ… (4).
Profile białkowe antygenów powierzchniowych Malassezia
Poszukiwanie fenotypowych cech grzyba odpowiedzialnych
pachydermatis okreSlono na podstawie analizy elektroforegra-
za jego wirulencję nie przyniosło, jak dotąd, zadowalających
mów materiałów uzyskanych na drodze elucji 3-dniowych ho-
wyników. Badanie struktury antygenowej M. pachydermatis
i porównawcza analiza profili białkowych poszczególnych szcze- dowli, 40 uprzednio wytypowanych szczepów grzyba. WyjScio-
pów pozwoliły wykazać pewne prawidłowoSci odrębne dla grzy- wa pula badanych preparatów obejmowała materiał uzyskany
w wyniku 1-, 3- i 24-godzinnego procesu elucji masy komórko-
bów komensalicznych i patogennych (9). Jednak ze względu na
złożoną strukturę antygenową tych grzybów dokładniejsze ba- wej poszczególnych szczepów. Wstępna ocena uzyskanych
elektroforegramów (ryc. 1 i 2) pozwoliła wytypować do dalszej
dania były utrudnione. Celowe wydawało się więc zawężenie
analizy jedynie wyniki uzyskane z rozdziału materiałów pocho-
badań do antygenów powierzchniowych M. pachydermatis.
dzÄ…cych z 3-godzinnego procesu elucji.
Antygeny te bezpoSrednio uczestniczÄ…c w pierwszych etapach
infekcji, jakimi są: adherencja do komórek gospodarza, koloni- Rozdziały elektroforetyczne białkowych frakcji antygenów
powierzchniowych ilustrujÄ… ryciny 1 i 2.
zacja tkanek oraz proliferacja grzyba, mają istotny wpływ na te
Wykazano wysoki stopień zróżnicowania i złożoną strukturę
procesy, a tym samym odpowiadajÄ… za wirulencjÄ™ zarazka (10).
poszczególnych preparatów antygenowych. Frakcje białkowe,
Wykazanie obecnoSci takich frakcji albo przynajmniej silniejszÄ…
ich ekspresję, umożliwi być może bardziej precyzyjne typowa- których liczba, w zależnoSci od badanego szczepu, wahała się od
2 do 22, zawarte były w przedziale od 104 do 13 kDa. Szczepy
nie szczepów M. pachydermatis odpowiedzialnych za procesy
izolowane od zwierząt chorych charakteryzowały się wyraxnie
chorobowe.
silniejszą ekspresją białkowych antygenów powierzchniowych
i większym ich zróżnicowaniem (ryc. 2, tab. II). Liczba frakcji biał-
Cel pracy
kowych wynosiła w tym przypadku Srednio 11, przy czym warto-
Celem pracy było uzyskanie i standaryzacja procedury otrzy- Sci dla poszczególnych szczepów wahały się od 3 do 22.
Szczepy komensaliczne wykazywały obecnoSć, Srednio
mywania antygenów powierzchniowych M. pachydermatis,
okreSlenie ich profili białkowych oraz analiza porównawcza an- 5 frakcji białkowych, przy wahaniach od 2 do 13 prążków, w za-
leżnoSci od badanego antygenu powierzchniowego (ryc. 1, tab.
tygenów powierzchniowych szczepów izolowanych od psów
z objawami zapalenia zewnętrznego kanału słuchowego i zdro- I). Bez względu na pochodzenie szczepów (od zwierząt zdro-
wych lub chorych) ich antygeny powierzchniowe wykazywały
wych klinicznie.
obecnoSć frakcji wspólnych: 68-71 kDa, 57-58 kDa, 45-46 kDa
(tab. I i II). Stwierdzono ponadto frakcje swoiste, typowe dla
Materiał i metody
szczepów pochodzących od psów z otitis externa; są to: 61-64
Badaniami objęto 40 szczepów M. pachydermatis wyizolo- kDa, 52-53 kDa, 43-44 kDa, 38-39 kDa i 15-17 kDa (tab. II i III),
222
wanych bezpoSrednio z materiału klinicznego. Szczepy wytypo- a których obecnoSci nie wykazano w antygenach powierzchnio-
Grażyna Ziółkowska, Aneta Nowakiewicz
Profile białkowe antygenów powierzchniowych Malassezia pachydermatis
ab c
Ryc. 1. Profile białkowe antygenów powierzchniowych szczepów M. pachydermatis izolowanych od zwierząt zdrowych
Fig. 1. Protein profiles of superficial antigens M. pachydermatis strains obtained from healthy dogs
ab c
Ryc. 2. Profile białkowe antygenów powierzchniowych szczepów M. pachydermatis izolowanych od zwierząt chorych
Fig. 2. Protein profiles of superficial antigens M. pachydermatis strains obtained from diseased dogs
wych szczepów komensalicznych (tab. I). Frakcje te występowa- steczkowej 43-44 kDa i 38-39 kDa, a następnie (według
ły z różną częstotliwoScią w badanych szczepach (tab. III); naj- malejącej częstotliwoSci) 52-53 kDa (35%), 15-17 kDa (30%)
częSciej, bo u 45% szczepów, stwierdzano białka o masie czą- oraz 61-64 kDa (20%).
Profile białkowe antygenów powierzchniowych patogen-
nych szczepów M. pachydermatis, charakteryzowała ponadto
podwyższona, w stosunku do szczepów komensalicznych, czę-
40% stotliwoSć występowania frakcji: 59-60 kDa, 55-56 kDa, 49-50
13-14 kDa
10%
kDa, 36-37 kDa, 32-33 kDa, 27-28 kDa, 25-26 kDa, 22-23
50%
kDa, 18-20 kDa i 13-14 kDa (tab. I i II). WspółzależnoSci te ilu-
18-20 kDa
15%
struje ryc. 3. Przyjmując 50% występowania danej frakcji za
45%
22-23 kDa wartoSć graniczną, obecnoSć prążków 55-56 kDa, 36-37 kDa,
10%
27-28 kDa i 18-19 kDa może, w połączeniu z obecnoScią frakcji
20%
25-26 kDa
typowo swoistych, wskazywać na patogennoSć danego szcze-
10%
pu M. pachydermatis.
75%
27-28 kDa
40%
30%
Omówienie
32-33 kDa
15%
90%
Prowadzone od wielu lat badania struktury antygenowej grzy-
36-37 kDa
30%
bów z rodzaju Malassezia wykazały jej złożony charakter, a także
40%
49-50 kDa
wysoki stopień zmiennoSci (12, 13). Biorąc pod uwagę, że więk-
20%
szoSć antygenów związana jest z powierzchnią lub Scianą ko-
65%
55-56 kDa
mórkową grzyba (14), a ich ekspresja zależy między innymi od
30%
35% wieku i warunków hodowli (13), istotne wydawało się ustalenie
59-60 kDa
10%
optymalnych parametrów uzyskiwania reprezentatywnej puli
0% 20% 40% 60% 80% 100%
antygenów (15). WczeSniej przeprowadzone badania własne
(16), a także prace innych autorów (9, 15) wykazały, że w przy-
szczepy izolowane od szczepy izolowane od
padku rodzaju Malassezia, logarytmiczna faza wzrostu grzyba,
zdrowych psów / strains chorych psów / strains
isolated from healthy dogs isolated from diseased dogs
tj. 2-6 dzień inkubacji, zapewnia najbogatszy zestaw antygenów,
przy czym optymalny czas wzrostu dla M. pachydermatis ustalo-
Ryc. 3. Frakcje białkowe o wysokiej częstotliwoSci występowania w szczepach
no na trzy dni (16). Złożona struktura antygenowa grzybów, ze
izolowanych od psów z objawami otitis externa
względu na wysoką liczebnoSć frakcji białkowych (główne anty-
Fig. 3. Protein fraction in high frequency for strains isolated from dogs with
otitis externa geny grzybów) utrudnia precyzyjną ich analizę i interpretację, 223
Grażyna Ziółkowska, Aneta Nowakiewicz
Protein profiles of superficial antigens M. pachydermatis strains Mikologia Lekarska 2007, 14 (4)
Tabela I: Antygeny powierzchniowe szczepów M. pachydermatis izolowanych od zdrowych psów
Table I: Superficial antigens of M. pachydermatis strains isolated from healthy dogs
kDa 59 66 23a 94 44 90 124 27 65 26a 64 75 141 86 138 73 63 40 16a 76
77-78 + + + +
74-76 +
68-71* + + + + + + + + + + + + + +
65-66 + + + + +
61-64**
59-60 + +
57-58* + + + + + + + + + + + + + + +
55-56 + + + + + +
52-53**
49-50 + + + +
45-46* + + + + + + + + + + + + + +
43-44**
38-39**
36-37 + + + + + +
34-35 + + + + + + + + +
32-33 + + +
27-28 + + + + + + + +
25-26 + +
22-23 + +
18-20 ++ +
15-17**
13-14 + +
ObjaSnienie / Explanations
* frakcje charakterystyczne dla gatunku M. pachydermatis / characteristic fractions for M. pachydermatis species
** frakcje typowe dla szczepów izolowanych od zwierząt chorych / typical fractions for strains isolated from diseased animals
Tabela II: Antygeny powierzchniowe szczepów M. pachydermatis izolowanych od chorych psów
Table II: Superficial antigens of M. pachydermatis strains isolated from diseased dogs
kDa 103 89 133 77 38 147 55 104 47a 14a 37 81 74 46 78 32 36 43 28 26
77-78 + + + + +
74-76 + +
68-71* + + + + + + + + + + + + + + + +
65-66 + + + + +
61-64** + + + +
59-60 + + + + + + +
57-58* + + + + + + + + + + + +
55-56 + + + + + + + + + + + + +
52-53** + + + + + + +
49-50 + + + + + + + +
45-46* + + + + + + + + + + + + + + + + +
43-44** + + + + + + + + +
38-39** + + + + + + + + +
36-37 + + + + + + + + + + + + + + + + + +
34-35 + + + + + + + + + + + +
32-33 + + + + + +
27-28 + + + + + + + + + + + + + + +
25-26 + + + +
22-23 + + + + + + + + +
18-20 + + + + + + + + + +
15-17** + + + + + +
13-14 + + + + + + + +
ObjaSnienie / Explanations
* frakcje charakterystyczne dla gatunku M. pachydermatis / characteristic fractions for M. pachydermatis species
** frakcje typowe dla szczepów izolowanych od zwierząt chorych / typical fractions for strains isolated from diseased animals
dlatego też w niniejszej pracy, badania zawężono wyłącznie do
i mogą łatwo przechodzić do Srodowiska, zastosowano opraco-
antygenów powierzchniowych poszczególnych szczepów. Anty- waną wczeSniej procedurę wodnej elucji grzyba (13), pozwala-
geny te wchodzące w skład zewnętrznej warstwy Sciany komór- jącą na zachowanie naturalnej struktury i właSciwoSci antyge-
kowej biorą miedzy innymi udział w procesach interakcji droż- nowych ekstrahowanych białek (16). Elucja antygenów przepro-
dżaków z komórkami gospodarza (13), czyli są odpowiedzialne
wadzona dla znacznej puli szczepów (n=40) równolegle w 3
za pierwsze, bardzo istotne stadium patogenezy (10) oraz cha- przedziałach czasowych pozwoliła na ustalenie optymalnego
rakteryzujÄ… siÄ™ wysokim stopniem swoistoSci (17).
czasu ekstrakcji do badania struktury antygenów powierzch-
Wykorzystując to, że antygeny powierzchniowe stanowią
niowych M. pachydermatis. Czas ten okreSlono jako 3 godz., co
frakcję białkową stosunkowo luxno związaną z komórką grzyba
224 potwierdzają wyniki wczeSniejszych badań własnych (16). Krót-
Grażyna Ziółkowska, Aneta Nowakiewicz
Profile białkowe antygenów powierzchniowych Malassezia pachydermatis
188, 66, 58, 57, 38, 28 i 17 kDa były natomiast typowe dla
Tabela III: Frakcje białkowe typowe dla szczepów izolowanych od psów
z objawami otitis externa
patogennych szczepów M. pachydermatis izolowanych przez
Table III: Typical protein fractions for strains isolated from dogs with the
Habibah i wsp. (25) od psów z klinicznymi objawami dermatitis.
symptoms of otitis externa
Podobne zależnoSci odnotowywano w badaniach antygenów
Masa cząsteczkowa Odsetek szczepów wykazujących
białkowych związanych z patogennoScią grzybów z rodzaju Ma-
Molecular mass okreSlone frakcje białkowe
lassezia występujących u ludzi (10, 22).
[kDa] Percentage strains characterised
by typical protein fractions Do czynników prawdopodobnie odpowiedzialnych za stosun-
61-64 (4) 20% kowo niewielką powtarzalnoSć wyników uzyskiwanych przez
52-53 (7) 35% różne oSrodki badawcze zaliczyć należy wysoką heterogennoSć
43-44 (9) 45%
wSród szczepów Malassezia spp., różne procedury ekstrakcji
38-39 (9) 45%
frakcji antygenowych grzyba, zróżnicowaną odpowiedx immu-
nologiczną u poszczególnych pacjentów (przy metodach immu-
nodetekcji) (25), a także niejednakową dokładnoSć oznaczeń
mas cząsteczkowych (26). Duże znaczenie może mieć również
szy czas elucji (1 godz.) masy grzyba nie zapewniał wystarczają-
to, że stosowane w przeważającej częSci badań metody immu-
cej zawartoSci białka w badanych preparatach (bardzo słaba
noblottingu do oznaczeń epitopów białkowych, związanych
wizualizacja rozdziału elektroforetycznego). Przedłużenie pro-
z patogennoScią grzyba, nie zawsze mogą wykazać ich pełny
cesu ekstrakcji (24 godz.) pozwalało, co prawda, na uzyskanie
profil. Szczepy Malassezia, będąc bowiem komensalami skóry
materiału o wysokiej zawartoSci białka, ale jednoczeSnie zróż-
i błon Sluzowych, stymulują układ immunologiczny gospodarza
nicowanego pod względem pochodzenia. Obok antygenów po-
do produkcji przeciwciał (10). Swoiste immunoglobuliny nie
wierzchniowych w preparatach mogły znajdować się bowiem
mogą więc Swiadczyć o patogennoSci zarazka. Ponadto droż-
głębiej położone komponenty komórki grzyba, a także frakcje
dżaki te, podobnie jak inne grzyby, indukując w organizmie od-
uwolnione podczas ewentualnego procesu autolizy (16).
powiedx typu komórkowego, mogą cechować się ekspresją
Wykazano, że antygeny powierzchniowe M. pachydermatis
frakcji antygenowych, których detekcja nie zawsze jest możliwa
charakteryzowały się na ogół bogatą i zróżnicowaną strukturą.
za pomocą przeciwciał (13).
Analiza poszczególnych elektroforegramów pozwoliła ustalić, że
Przedstawione wyniki obecnych badań, prezentujące z jed-
szczepy izolowane od psów z otitis externa cechowała silniejsza
nej strony frakcje białkowe charakterystyczne dla gatunku M.
ekspresja antygenów powierzchniowych o wyraxniej zróżnicowa-
pachydermatis (68-71 kDa, 57-58 kDa, 45-46 kDa), z drugiej
nej strukturze w porównaniu ze szczepami komensalicznymi.
zaS frakcje, zwiÄ…zane jak siÄ™ wydaje z patogennoSciÄ… grzy-
Rrednia liczba frakcji białkowych wynosiła odpowiednio 11 i 5.
ba (61-64 kDa, 52-53 kDa, 43-44 kDa, 38-39 kDa i 15-17
Podobne wyniki uzyskano badając profile białkowe homogena-
kDa), ze względu na odmienną metodykę ekstrakcji materiału
tów komórek M. pachydermatis (18), co może sugerować, że za
oraz detekcję wyłącznie za pomocą SDS-PAGE, mogą być tylko
wyższą ekspresję białek odpowiedzialne były prawdopodobnie
częSciowo skonfrontowane z innymi pracami z tego zakresu.
patogenne właSciwoSci zarazka (19). Do epitopów białkowych
Pewne analogie zaobserwowane między oznaczonymi frakcja-
antygenów powierzchniowych, związanych wyłącznie ze szcze-
mi a alergenami Mala s i Mala f (1) czy też antygenami wyizolo-
pami patogennymi, zaliczono w obecnych badaniach frakcje:
wanymi przez innych autorów (15, 25) wymagają potwierdzenia
61-64 kDa, 52-53 kDa, 43-44 kDa i 38-39 kDa, których nie wy-
w dalszych badaniach, obejmujących m.in. elucję poszczegól-
kazywano w profilach szczepów komensalicznych. Można rów-
nych frakcji, ich sekwencjonowanie oraz ewentualne oznacze-
nież, do pewnego stopnia, uwzględnić frakcje 55-56 kDa, 36-37
nie regionów genomu kodujących ich ekspresję. Takie badania
kDa, 27-28 kDa i 18-20 kDa, wykazywane u ponad 50% bada-
pozwolą być może na różnicowanie szczepów Malassezia
nych szczepów patogennych, przy nieznacznym procentowym
w aspekcie ich patogennoSci, co znacznie ułatwi prawidłową
ich udziale w szczepach komensalicznych. Badania z tego zakre-
diagnostykÄ™ infekcji.
su, prowadzone przez innych autorów są stosunkowo nieliczne
i w większoSci dotyczą szczepów Malassezia izolowanych od lu-
Wnioski
dzi (20, 21). Z okreSlonych, jak dotąd, 12 alergenów, tj. Mala s1,
Mala s5 Mala s12 i Mala f2 Mala f4, o wysoce zróżnicowa-
1. Szczepy M. pachydermatis izolowane od chorych zwierzÄ…t
nych masach czÄ…steczkowych, mieszczÄ…cych siÄ™ w przedziale
charakteryzują się większą ekspresją białek.
16,2 kDa-86,1 kDa (22, 23), aż 7 można porównać, z dużym
2. Profile białkowe antygenów powierzchniowych M. pachy-
prawdopodobieństwem, do badanych frakcji antygenów po-
dermatis cechuje obecnoSć:
wierzchniowych M. pachydermatis. Zbliżone masowo prążki
" frakcji typowych wyłącznie dla szczepów izolowanych od
w analizowanych obecnie elektroforegramach odnieSć można
psów chorych,
do alergenów Mala s12 ( 67 kDa), Mala s11 ( 22,4 kDa), Mala
" frakcji występujących u znacznego odsetka szczepów pato-
s9 ( 36,7 kDa), Mala s8 ( 19,2 kDa), Mala s5 ( 18,2 kDa),
gennych
Mala f3 ( 20 kDa) i Mala s1 ( 37 kDa). Z puli tej wg Andersson
3. Korelacja między pochodzeniem szczepów M. pachyder-
i wsp. (1) Mala s1, Mala s5 i Mala s8 sÄ… charakterystyczne dla M.
matis a obecnoSciÄ… okreSlonych frakcji antygenowych w ich
pachydermatis, co potwierdzone zostało przez wykazanie w ge- profilach białkowych sugeruje możliwoSć występowania białko-
nomie grzyba regionów kodujących te alergeny (20).
wych markerów patogennoSci u tych grzybów.
StosujÄ…c metody immunodetekcji z wykorzystaniem surowic
pochodzących od psów z infekcją M. pachydermatis, Chen Praca została zaprezentowana na XII Międzynarodowym Sympozjum Nauko-
wo-Szkoleniowym Sekcji Mikologicznej Polskiego Towarzystwa Dermatologicz-
i wsp. (9) wykazali obecnoSć frakcji białkowych 45, 52, 56 i 65
nego MIKOLOGIA 2006 , Białowieża, 20-24.09.2006.
kDa charakterystycznych jedynie dla szczepów izolowanych od
zwierzÄ…t chorych. Z kolei Bond i wsp. (24) w podobnych bada-
PiSmiennictwo
niach okreSlili inny przedział masowy dla tych antygenów. Frak-
cje reagujące z przeciwciałami IgG psów z objawami zapalenia
1. Bond R., Lamport A.J., Lloyd D.H.: Colonization status of Malassezia pachyderma-
skóry na tle Malassezia należały do białek o masach 219, 110,
tis on the hair and in the hair follicle of healthy beagle dogs. Res. Vet. Sci., 2000,
71 i 45 kDa. Antygeny białkowe o masach cząsteczkowych 68, 291-293.
225
Grażyna Ziółkowska, Aneta Nowakiewicz
Protein profiles of superficial antigens M. pachydermatis strains Mikologia Lekarska 2007, 14 (4)
2. Guillot J., Bond R.: Malassezia pachydermatis: a review. Med. Mycol., 1999, 37, 15. Coutinho S., Souza T., Paula C.D.: Protein profiles of Malassezia pachydermatis
295-306. isolated from dogs. Mycopathologia, 1997, 139, 129-135.
3. Mouldin E.A., Morris D.O., Goldsmidt E.: Retrospective study; the presence of 16. Ziółkowska G.: Charakterystyka i znaczenie praktyczne egzoantygenów Micro-
Malassezia in feline skin biopsies. A clinicopathological study. Vet. Dermatol., sporum canis. Rozprawa habilitacyjna. Rozprawy Naukowe AR w Lublinie nr 236.
2002, 13, 7-13. 2000.
4. Patterson A.D., Frank L.A.: How to diagnose and treat Malassezia dermatitis in 17. Cunnigham A., C., Leeming J.P., Ingham E., Gowland G.: Differentiation of three
dogs. Vet. Med., 2002, 8, 612-622. serovars of Malassezia furfur. J. Appl. Bacteriol., 1990, 68, 439-446.
5. Staroniewicz Z., Król J., Cierpisz J.: Flora bakteryjna i grzybicza w otitis externa 18. Nowakiewicz A.: Współczesne metody różnicowania diagnostycznego szczepów
u psów. Medycyna Wet., 1995, 51, 667-670. z rodzaju Malassezia izolowanych z przypadków klinicznych. Rozprawa doktor-
6. Gueho E., Boeghout T., Ashbee H.R., Guillot J., Van Belkum A., Faergemann J.: The ska. Rozprawy Naukowe AR w Lublinie, 2005.
role of Malassezia species in the ecology of human skin and as pathogens. Med. 19. Romani L., Howard D.H.: Mechanisms of resistance to fungal infections. Curr.
Mycol., 1998, 36, 220- 229. Opin. Immunol., 1990, 126, 627-632.
7. Belkum A., Boekhout T., Bosboon R.: Monitoring spreed of Malassezia infections 20. Andersson A., Scheynius A., Rasool O.: Detection of Mala f and Mala s allergen
in a neonatal intensive care unit by PCR-mediated genetic typic. J. Clin. Microbio- sequences within the genus Malassezia. Med. Mycol., 2003, 41, 479-485.
logy, 1994, 32, 2528-2538. 21. Onishi Y., Kuroda M., Yasueda H., Saito A., Sono-Koyama E., Tunasawa S., Hashi-
8. Dowling M.P.: Antimicrobial therapy of skin and ear infection. Can. Vet., 1996, 37, da-Okado T., Yakigara T., Uchida K.: Two-dimensional electrophoresis of Malasse-
695-699. zia and isolation of Mal f4 homologs with mitochondrial malate dehydrogenase.
9. Chen T., Halliwell R.E.W., Pemberton A.D., Hill P.B.: Identification of major aller- Eur. J. Biochem., 1999, 261, 148-154.
gens of Malassezia pachydermatis in dogs with atopic dermatitis and Malassezia 22. Zargari A., Midgley G., Back O., Johansson S.G.O., Scheynius A.: Ig-E reactivity to
overgrowth. Vet. Dermatol., 2002, 13, 141-150. seven Malassezia species. Allergy, 2003, 58, 306-311.
10. Ashbee H.R., Evans E.G.V.: Immunology of diseases associated with Malassezia 23. Zargari A.: Identification and characterization of allergen components of the op-
species. Clin. Microbiology Rev., 2002, 15, 21-57. portunistic yeast Malassezia furfur. Repro. Print AB Stockholm, 1998.
11. Laemmli U.K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of 24. Bond R., Lloyd D.H.: Immunoglobulin G responses to Malassezia pachydermatis in
bacteriophage T4. Nature, 1970, 227, 680-685. healthy dogs and dogs with Malassezia dermatitis. Vet. Rec., 2002, 150, 509-512.
12. Jensen-Jarolim E., Poulsen L.K., With H., Kieffer M., Ottevanger V., Skov P.S.: Ato- 25. Habibah A., Catchpole B., Bond R.: Canine serum immunoreactivity to M. pachy-
pic dermatitis of the face, scalp and neck: type I reaction to the yeast Pityrospo- dermatis in vitro is influenced by the phase of yeast growth. Vet. Dermatol., 2005,
rum ovale?. J. Allergy Clin. Immunol., 1992, 89, 44-51. 16, 147-152.
13. Ziółkowska G., Nowakiewicz A., Puchalski A.: Profile białkowe preparatów antyge- 26. Ashbee H.R.: Recent developments in the immunology and biology of Malassezia
nowych uzyskiwanych ze szczepów Malassezia pachydermatis. Medycyna Wet., species. Immunol. Med. Microbiol., 2006, 47, 14-23.
2004, 60, 1118-1123.
14. Fukazawa Y., Kagaya K.: Molecular bases of adhesion of Candida albicans. J. Med.
Vet. Mycol., 1997, 35, 87-99. Praca wpłynęła do Redakcji: 2007.03.28. Zaakceptowano do druku: 2007.09.02.
226
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
BIALKO POWIERZCHNIOWEprofileprofileprofil?profileKrytyczna temperatura wewnętrznej powierzchniprofil?profileAntygeny i Imunogennosc PREZENTACJAprofileprofileProfilaktyka pierwotna i wtorna udarow mozguprofileprofilewięcej podobnych podstron