WYKA
AD 2
Chromatografia- fizykochemiczna metoda rozdzielania składników jednorodnych mieszanin w wyniku
ich różnego podziału między fazę ruchomą i nieruchomą układu chromatograficznego.
Rozdzielenie składników mieszaniny jest funkcją efektów termodynamicznych i kinetycznych w układzie
chromatograficznym.
Fazą ruchomą może być gaz, ciesz lub płyn w stanie nadkrytycznym, a fazą nieruchomą
(stacjonarną) ciało stałe lub ciecz.
W procesie rozdzielania chromatograficznego decydującą rolę odgrywa oddziaływanie między
rozdzielanymi składnikami mieszaniny, fazą stacjonarną i ruchomą.
Udział fazy stacjonarnej w procesie rozdzielania:
ń� mały- gdy fazą ruchomą jest gaz
ń� duży- gdy fazą ruchomą jest ciecz lub płyn w stanie nadkrytycznym
Podział metod chromatograficznych
Metody chromatograficzne klasyfikuje się według następujących kryteriów:
ń� geometrii układu
ń� rodzaju fazy stacjonarnej
ń� rodzaju fazy ruchomej
Podział ze względu na rodzaj fazy ruchomej:
ń� chromatografia gazowa- fazą ruchomą jest gaz
ń� chromatografia cieczowa- fazą ruchomą jest ciecz
ń� chromatografia nadkrytyczna- fazą ruchomą jest płyn w stanie nadkrytycznym
Podział ze względu na rodzaj fazy stacjonarnej:
ń� chromatografia adsorpcyjna- fazą stacjonarną jest ciało stałe ( adsorbent)
ń� chromatografia podziałowa- fazą stacjonarną jest ciecz naniesiona na nośnik
Podział ze względu na geometrię układu ( tylko w chromatografii cieczowej ):
ń� chromatografia kolumnowa- faza stacjonarna znajduje się w rurce zwanej kolumną
ń� chromatografia planarna- faza stacjonarna umieszczona jest na płaszczyz
nie
Idea rozdziału chromatograficznego
Mieszaninę składającą się z dwóch składników głównych i jednego ubocznego wprowadzono do fazy
ruchomej w czasie, który przyjęto za zerowy i od którego rozpoczął się proces rozdzielania składników.
Składniki te w różny sposób oddziałują z fazą ruchomą i nieruchomą.
Podział substancji pomiędzy dwie fazy opisuje współczynnik podziału KD definiowany jako stosunek
masy substancji w równych objętościach fazy ruchomej i stacjonarnej.
masa substancjiw jednostce objętości fazy stacjonarnej Cs
KD =
=
masa substancjiw jednostce objętości fazy ruchomej Cm
KD jest stałą równowagi, która zależy od:
ń� badanej substancji
ń� fazy ciekłej
ń� temperatury
Rozdzielenie składników mieszaniny jest możliwe tylko wtedy gdy ich stałe podziału różnią się między
sobą. Zatem aby rozdzielić wszystkie składniki mieszaniny chromatografista musi tak dobrać warunki
chromatografowania aby stosunki podziału tych składników były różne.
Pod pojęciem warunków rozdziału rozumiemy:
ń� rodzaj fazy stacjonarnej
ń� rodzaj fazy ruchomej
ń� prędkość przepływu fazy ruchomej
ń� temperaturę
W przypadku chromatografii kolumnowej należy wziąć pod uwagę rodzaj i długość kolumny a w
przypadku chromatografii cienkowarstwowej rodzaj i wielkość płytki oraz sposób rozwijania
chromatogramów.
Parametry retencyjne
Czas retencji- jest to czas przebywania substancji chromatografowanej w kolumnie, czyli czas od
momentu jej zadozowania do kolumny do momentu zarejestrowania maksimum piku odpowiadającego
tej substancji. Nazywany jest także niepoprawionym lub całkowitym czasem retencji.
Całkowity czas retencji jest sumą czasu w którym substancja oddziałuje z wypełnieniem kolumny i
czasu potrzebnego do przejścia tej substancji od dozownika do detektora gdyby takiego oddziaływania
nie było.
Czas retencji substancji nie zatrzymywanej lub czas martwy to czas przebywania w kolumnie substancji
nieoddziałującej z wypełnieniem kolumny od momentu zadozowania tej substancji do momentu
pojawienia się maksimum jej piku.
WYKA
AD 3
Podział metod chromatograficznych:
Podział ze względu na rodzaj fazy stacjonarnej:
- chromatografia adsorpcyjna  fazą nieruchomą jest ciało stałe (adsorbent)
- chromatografia podziałowa  fazą nieruchomą jest ciesz (naniesiona na nośnik)
Podział ze względu na geometrie układu (tylko w chromatografii cieczowej:
- chromatografia kolumnowa  faza stacjonarna znajduje się w rurce zwanej kolumną
- chromatografia planarna  faza stacjonarna umieszczona jest na płaszczyz
nie
Stała podziału KD
Każdy proces chromatograficzny oparty jest na podziale składników pomiędzy 2 fazy.
Gdy próbka znajduje się w kolumnie, składniki próbek natychmiast ulegają podziałowi pomiędzy
fazę stacjonarną (stałą lub ciekłą) i fazę ruchomą (gaz, ciecz lub substancja w stanie nadkrytycznym).
Faza ruchoma będzie przenosić przez kolumnę zadozowaną mieszaninę. Różne substancje będą
różnorodnie oddziaływać z fazą stacjonarną w zależności od ich struktury cząsteczkowej.
Podział substancji pomiędzy dwie fazy opisuje współczynnik podziału KD definiowany jako stosunek
masy substancji w równych objętościach fazy ruchomej i stacjonarnej.
ms c s gdzie: ms - masa substancji w jednostce objętości fazy stacjonarnej
KD =� =�
mm c m mc - masa substancji w jednostce objętości fazy ruchomej
cs - stężenie substancji w fazie stacjonarnej
cm - stężenie substancji w fazie ruchomej
Między liczbą cząsteczek związków chromatografowanych, obecnych w fazie ruchomej i nieruchomej
ustala się równowaga dynamiczna z wielokrotnym przechodzeniem ich z jednej fazy do drugiej.
KD jest stałą równowagi, która zależy od:
- badanej substancji
- fazy ciekłej
- temperatury
Jej wartość nie zależy od rodzaju kolumny.
Rozdzielenie składników mieszaniny jest możliwe tylko wtedy, gdy ich stałe podziału różnią się między
sobą.
IZOTERMA SORPCJI I KSZTAA
T PIKU
Ilość poszczególnych substancji zasorbowanej przez fazę stacjonarną zależy od stężenia w fazie
ruchomej. Stosunek pomiędzy ilością zasorbowaną, a stężeniem w fazie ruchomej, przy stałej
temperaturze nazywamy izotermą sorpcji.
Stężenie
w kolumnie
Dystans wzdłuż kolumny
Izoterma sorpcji
Rozdział składników
w kolumnie chromatograficznej
KSZTAA
T PIKU
Pik  gaussowski Ogonowanie Rozmycie przedniej
METODY CHROMATOGRAFICZNE: części piku
Pod pojęciem warunków rozdziału rozumiemy:
- rodzaj fazy stacjonarnej
- rodzaj fazy ruchomej
- prędkość przepływu fazy ruchomej
- temperaturę
W przypadku chromatografii kolumnowej należy wziąć pod uwagę rodzaj i długość kolumny, a w
przypadku chromatografii cienkowarstwowej rodzaj i wielkość płytki oraz sposób rozwijania
chromatogramów.
CZAS RETENCJI:
Czas retencji (tR) jest to czas przebywania substancji chromatografowanej w kolumnie, czyli czas od
momentu jej zadozowania do kolumny do momentu zarejestrowania maksimum piku
chromatograficznego odpowiadającego tej substancji. Nazywany jest także niepoprawionym lub
całkowitym czasem retencji.
Czas retencji substancji nie zatrzymywanej lub czas martwy (tM) to czas przebywania w
kolumnie substancji nieoddziałującej z wypełnieniem kolumny od momentu zadozowania tej substancji
do momentu pojawienia się maksimum jej piku.
Zredukowany czas retencji (t R) to czas związany z przebywaniem substancji w kolumnie tylko w
wyniku oddziaływania tej substancji z wypełnieniem kolumny.
t R = tR - tM
ODLEGA
OŚĆ RETENCJI
Całkowita odległość retencji (lR) to odległość od miejsca odpowiadającego zadozowaniu substancji
chromatografowanej do kolumny do maksimum jej piku.
Odpowiednio można oznaczyć także odległość retencji substancji nie zatrzymanej - lM i
zredukowaną odległość retencji - l R.
l R = lR - lM
OBJ
TOŚĆ RETENCJI
W niektórych przypadkach korzystne jest posługiwanie się objętościami retencji.
Otrzymuje się je mnożąc czas retencji przez objętościowe natężenie przepływu gazu nośnego w
temperaturze kolumny (FC).
Całkowita objętość retencji: VR = tRFC
Objętość retencji substancji nie zatrzymanej: VM = tMFC
Zredukowana objętość retencji: V R = VR - VM = t RFC
Objętość retencji jest wielkością, która w odróżnieniu od czasu retencji nie zależy od liniowej prędkości
przepływu fazy ruchomej.
WSPÓA
CZYNNIK RETENCJI
Współczynnik retencji (k) jest inną miarą retencji. Jest to stosunek ilości substancji, wyrażonej w
molach znajdującej się w fazie stacjonarnej do ilości substancji w fazie ruchomej.
C s ��Vs KVs Vs  objętość fazy stacjonarnej
Vr  objętość fazy ruchomej
k =� =�
C r ��Vr Vr Cs  stężenie substancji chromatografowanej (w molach) w fazie
stacjonarnej
Cr  stężenie substancji chromatografowanej (w molach) w fazie
ruchomej
K  stała podziału
Współczynnik retencji (dawniej nazywany stosunkiem podziału) można łatwo policzyć wykorzystując
zmierzone wartości retencji. Jest on stosunkiem czasu, w jakim substancja chromatografowana
przepływa w fazie stacjonarnej do czasu w którym przebywa ona w fazie ruchomej.
Współczynnik retencji określa, ile razy dłużej substancja chromatografowana przechodzi przez
kolumnę w wyniku oddziaływania z fazą stacjonarną, niż potrzebowałaby na przejście przez tę
kolumnę, gdyby przebywała tylko w fazie ruchomej.
tR  czas retencji
k = (tR - tM)/ tM = t R/tM
t R  redukowany czas retencji
tM  czas retencji związku nie zatrzymywanego
Im wartość współczynnika retencji jest większa tym silniej substancja oddziałuje z wypełnieniem
kolumny.
Retencja względna r  to stosunek retencji dwóch substancji chromatografowanych, z których jedna
jest wzorcem (ST), a retencja drugiej jest zbliżona do retencji wzorca.
Retencja względna zależy od:
- rodzaju rozdzielanych substancji
- rodzaju fazy stacjonarnej
- temperatury kolumny
Wartość r może być większa lub mniejsza od 1. Im bardziej r jest różne od 1, tym lepiej dwie
substancje się rozdzielają.
WSPÓA
CZYNNIK ROZDZIELENIA
Dla dwóch sąsiednich pików na chromatogramie, dla których t R2 > t R1 możemy określić współczynnik
rozdzielenia - ą - jest miarą rozdzielenia dwóch sąsiednich pików na chromatogramie.
k2 K2 tR2 -� t0
a� =� =� =�
k1 K1 tR1 -� t0
Współczynnik rozdzielenia ma zawsze wartość większą od 1.
Jeżeli ą = 1, piki mają tę samą retencję i koeluują.
ROZDZIELCZOŚĆ PIKÓW
Selektywność fazy stacjonarnej i sprawność kolumny są charakteryzowane przez rozdzielczość
pików:
2(�tR2 -� tR1)� 2d
d - odległość między maksimami pików,
RS =� =�
wb1, wb2 - szerokości podstawy pików,
wb1 +� wb2 wb1 +� wb2
d
RS =� 1,117
wh1 +� wh2 wh1, wh2 - szerokości podstawy pików,
Piki są tym lepiej rozdzielone im wartość R jest większa, a rozdzielone do linii podstawowej gdy RS =
1,5.
Jeżeli RS = 1 to piki o podobnej wysokości są rozdzielone w ok. 96%.
PRZYKA
AD ROZDZIELCZOŚCI
SPRAWNOŚĆ KOLUMNY
Sprawność kolumny chromatograficznej mierzy się dla danej substancji liczbą półek
teoretycznych N w kolumnie.
Pod pojęciem półki teoretycznej należy rozumieć najmniejszą objętość kolumny, w której zostaje
osiągnięty stan równowagi pomiędzy stężeniem analitu w fazie ruchomej i stacjonarnej.
Wartość półek teoretycznych jest wyznaczona na podstawie poniższego wzoru przy założeniu, że pik
pochodzący od substancji ma kształt krzywej Gaussa.
2
tR
N - liczba półek teoretycznych
N =� 16ć� ��
�� ��
w
tR - czas retencji
Ł� ł�
w - szerokość piku przy podstawie (w jednostkach czasu)
WYSOKOŚĆ RÓWNOWAŻNA PÓA
CE TEORETYCZNEJ
Wysokość równoważna półce teoretycznej WRPT to najmniejsza wysokość kolumny, w której
zostaje osiągnięty stan równowagi pomiędzy stężeniem substancji chromatografowanej w fazie
ruchomej i stacjonarnej.
WRPT = H = L/N
L  długość kolumny [mm]
N  liczba półek teoretycznych
Im wartość WRP jest mniejsza, tym kolumna ma więcej półek i jest sprawniejsza.
SPRAWNOŚĆ ROZDZIELANIA
Sprawność rozdzielania w kolumnie chromatograficznej zależy od:
- rozmiaru kolumny
- liczby półek
- rodzaju wypełnienia kolumny
- natężenia przepływu i rodzaju fazy ruchomej
- właściwości składników chromatografowanej mieszaniny
Wykres Van Deemtera
Umożliwia wyznaczenie optymalnej prędkości przepływu fazy ruchomej odpowiadającej minimalnej
wartości WRPT(wartość równoważna półce teoretycznej), czyli maksymalnej sprawności kolumny.
Prędkość przepływu gazu nośnego:
U = L/ tM
L  długość kolumny w mm
tM  czas retencji niezatrzymywanego związku
Równanie Van Deemtera
WRP = A + B/u + C*u
u  liniowa prędkość gazu nośnego
A, B, C  wielkości stałe dla danej kolumny, fazy stacjonarnej, fazy ruchomej i temperatury.
CHROMATOGRAFIA GAZOWA
Związki które mogą być analizowane z wykorzystaniem chromatografii gazowej muszą charakteryzować
się:
�� Wystarczającą trwałością termiczną,
�� Odpowiednią lotnością.
Budowa
ż� Zbiorniki lub generatory gazu nośnego (Hel-najczęściej używany gaz nośny)
ż� Regulatory
ż� Filtry gazów
ż� Dławiki
ż� Połączenia rurowe
ż� Chromatograf
o Dozownik (wlot) miejsce w którym wprowadza się substancje badaną
o Kolumna chromatograficzna która znajduje się w piecu
o Piec  komora w której możemy regulować temperaturę
o Detektor
o Rejestrator lub komputer z oprogramowaniem
Zasada Działania chromatografu gazowego:
1. Gaz nośny ze zbiornika (butli) lub wytwornicy płynie przez regulator przepływu, filtr oraz
przepływomierz do dozownika, a następnie przez kolumnę i detektor do atmosfery.
2. Do dozownika próbkę wprowadza się strzykawką (gazy, ciecze i roztwory ciał stałych)lub
zaworem dozującym (gazy).
3. Próbka wchodząca do kolumny musi mieć postać gazu lub pary.
4. Składniki próbki ciekłej lub stałej w postaci roztworu, rzadko w postaci ciała stałego,
odparowują w dozowniku i w strumieniu gazu nośnego są przenoszone do kolumny.
5. W kolumnie następuje rozdzielenie składnika próbki, które wynoszone z kolumny trafiają kolejno
do detektora, generując w nim sygnał elektryczny.
6. Sygnał po wzmocnieniu we wzmacniaczu może być rejestrowane w postaci piku (chromatografu,
który przedstawia zależność wielkości pików od czasu wymycia składników).
Gaz nośny
�� W chromatografii gazowej najczęściej jest: wodór, azot (azot biogen-4,5 stopnia w skali
czystości bez śladów pary wodnej), argon lub hel, jego rodzaj ma mały, zwykle pomijany wpływ
na wyniki rozdzielania chromatograficznego,
�� Przy wyborze gazu nośnego należy kierować się przede wszystkim: rodzajem zastosowanego
detektora, dostępnością i czystością gazu oraz jego ceną,
�� Gazy zwykłe doprowadzane są do chromatografu z ciśnieniowych butli stalowych, niektóre mogą
być wytwarzane w laboratorium (wodór wytwarza się przy użyciu generatorów elektrolitycznych,
a azot i powietrze w wytwornicach wypełnionych sitami cząsteczkowymi),
�� Czystość gazu nośnego wpływa na pracę detektora i na trwałość wypełnienia kolumny dlatego
nie może on zawierać zanieczyszczeń- przede wszystkim tlenu, pary wodnej i węglowodanów
(adsorbenty pod wpływem zanieczyszczeń mogą ulegać dezaktywacji, ciekłe fazy stacjonarne
mogą ulegać przemianom chemicznym i zmieniać swoje pierwotne właściwości),
�� Nawet w przypadku używania bardzo czystych gazów zaleca się używanie filtrów,
�� Do osuszania gazów stosuje się sita cząsteczkowe lub żel krzemionkowy,
�� Do usuwania tlenu z gazu nośnego stosuje się najczęściej odtleniacze działające na zasadzie
chemisorpcji tlenu przez metale osadzane na nośnikach; zwykle stosuje się odtleniacze
miedziowe, platynowe lub palladowe,
�� Prędkość liniowa gazu nośnego lub natężenie przepływu strumienia gazu bezpośrednio wpływa
na czas retencji i sprawność.
BARDZO WAŻNY jest właściwy wybór gazu nośnego i parametrów jego przepływu tak aby
uzyskać optymalny czas analizy, sprawność i powtarzalność.
DOZOWNIK
MEMBRANY-uszczelka
Najczęściej stosowanym rodzajem dozownika w chromatografii gazowej jest dozownik membranowy,
którego bardzo ważnym elementem jest wymienna membrana gumowa (septa).
Membrany:
v� Muszą zapewniać szczelność układu gazowego e chromatografie, aby przepływ gazu nośnego
był stały, co zapewnia otrzymywanie stałych czasów retencji,
v� Produkowane są z gumy silikonowej o dużej twardości termicznej,
v� W czasie długotrwałej pracy w wysokiej temperaturze nie powinny się z niej ulatniać substancje,
które mogłyby dawać na chromatografie piki nie pochodzące z próbki,
v� Dostępne są membrany różniące się wytrzymałością na wysoką temperaturę, odpornością na
wielokrotne przekłuwanie i ilością uwalnianych substancji.
Ogólne zasady dozowania próbek
1. Stosując chromatografie gazową, można analizować substancje, które w warunkach
chromatografowania mają postać gazów lub par; przyjmuje się, że są to substancje gazowe
oraz ciekłe i stałe, których temperatura wrzenia lub sublimacji nie przekracza 350-400�C.
2. Próbki ciał stałych rzadko wprowadza się do dozownika w postaci stałej, przeważnie
przygotowuje się ich roztwory; rozpuszczalnik stosowany do rozpuszczania próbki powinien
mieć możliwie dużą lotność i być czysty, aby on sam i ewentualnie jego zanieczyszczenia nie
dawały na chromatografie bardzo szerokiego pierwszego piku i innych pików fałszujących obraz
próbki.
3. Próbka ciekła lub stała powinna w dozowniku odparować lub odsublimować w jak najkrótszym
czasie i dlatego temperatura dozownika musi być odpowiednio wysoka, zwykle ok. 20�C
powyżej temperatury wrzenia najwyżej wrzącego składnika próbki.
4. Temperatura dozownika nie może być jednak za wysoka, ponieważ mogłoby to spowodować
rozkład termiczny próbki i pojawienie się na chromatografie pików produktów tego rozkładu,
czyli pików- duchów.
WYKA
AD 5
Ogólne zasady dozowania próbek Cd.
5. Temperatura dozownika nie może być również za niska, ponieważ odparowanie składników próbek
jest wtedy bardzo powolne w wyniku czego próbka jest wprowadzana do kolumny przez, przy czym piki
są rozmyte, niesymetryczne, a rozdzielenie składników jest złe.
6.Podobny efekt może wystąpić, gdy temperatura dozownika jest optymalna, ale wprowadzenie próbki
trwa za długo lub próbka jest za duża, dlatego czas wprowadzania próbki do dozownika ,przy
optymalnej temperaturze powinien być jak najkrótszy a próbka możliwie jak najmniejsza.
Urządzenia do dozowania próbek:
�� Próbki cieczy lub ciał stałych w postaci roztworów w lotnych rozpuszczalnikach dozuje się
najczęściej za pomocą mikrostrzykawek o pojemności 1 lub 10 �l.
�� Próbki gazowe można dozować strzykawkami szklanymi, w których tłok wykonany jest także ze
szkła lub z innego materiału zapewniającego dobrą szczelność
�� Pojemność strzykawki do dozowania gazów wynosi zwykle od 1 do kilku mililitrów
�� Próbki gazowe można dozować także stosując zawór dozujący, który posiada wymienną pętlę
dozownicą o pojemności od części mililitra do kilki mililitrów i może być połączony przewodami
bezpośrednio z instalacją lub zbiornikiem, którego zawartość ma być analizowana.
Dozowanie do kolumn kapilarnych:
-Właściwe dozowanie próbek ma duże znaczenie ze względu na uzyskanie dobrego rozdzielenia
składników próbki oraz otrzymanie dokładnych, powtarzalnych i odtwarzalnych wyników analizy
ilościowej
-próbka wprowadzana do kolumny nie może być większa od pojemności sorpcyjnej kolumny, ponieważ
przeładowanie kolumny prowadzi do złego rozdzielenia składników próbki i powstania szerokich,
niesymetrycznych pików, dla większości kolumn kapilarnych dopuszczalna wielkość próbki wynosi 0,01-
0,001 �l dlatego w kapilarnej chromatografii gazowej stosuje się często dzielniki strumienia zwane
spliterami, które umożliwiają dozowanie do kolumn tylko części strumienia gazu nośnego do którego
wprowadzono próbkę.
Detektory w chromatografii gazowej
Istota działania detektorów stosowanych w chromatografii gazowej polega na tym, że reagują one na
różnice właściwości fizykochemicznych gazu nośnego i tego gazu, w którym znajdują się substancje
eluowane z kolumny. Rejestrowane zmiany właściwości mogą być proporcjonalne albo do stężenia albo
do natężenia masowego przepływu wymywanego składnika w gazie nośnym. Jeżeli do detektora
wchodzi sam gaz nośny to jego właściwości nie ulegają zmianie i wskazania detektora są rejestrowane
w postaci linii prostej (podstawowej).
Detektor powinien charakteryzować się:
�� dużą czułością tzn. sygnał o trzymany z detektora przy przechodzeniu przez ten detektor
wykrywanego składnika powinien być możliwie najwyższy.
�� wykrywalnością (granicą wykrywalności) określoną przez najmniejszą ilość substancji
wywpłującej sygnał, którego amplituda jest dwa razy większa od poziomu szumów detektora.
�� dużą stabilnością linii podstawowej, czyli sygnału otrzymanego przy przepływie przez detektor
samego gazu nośnego.
�� jak najszerszy zakresem liniowości wskazań, który charaktetyzuje się proporcjonalnością
wielkości sygnału detektora do ilości (stężenia) substancji wykrywanej.
Rozróznia się detektory:
- uniwersalne, które reagują na wszystkie substancje wymywane z kolumny np. detektor cieplno-
przewodnościowy (TCD), GC-MS(w trybie całkowitego prądu jonowego)
- selektywne, które reagują wzmożoną odpowiedzią na niektóre specyficzne rodzaje substancji np.
związki chalogenopochodne lub zawierające siarkę albo fosfor. Np. detektor płomieniowo-
jonizacyjny(FID), detektor wychwytu elektronów (ECD), detektor foto-jonizacyjny(PID)
- specyficzne, to te które są tak selektywne, że potrafią rozróżnić poszczególne struktury lub
pierwiastki zapewniając przy tym wysoki stopień pewności np. detektor płomieniowo-
fotometryczny(FPD)
Detektor płomieniowo-jonizacyjny
FID
- jest szczególnie przydatny do wykrywania węglowodorów i ich pochodnych
- przy jego zastosowaniu nie można wykrywać gazów szlachetnych, tlenu, azotu, tlenku i dwutlenku
węgla, wodoru, siarkowodoru, chlorowców, amoniaku, wody, siarczku węgla.
WYKA
AD 6
Zasada działania FID
Do działania detektora płomieniowo-jonizacyjnego konieczny jest wodór i powietzrze sprężone, które
można w razie konieczności zastąpić tlenem.
W detektorze spalany jest wodór, przy czym płomień znajduje się między dwoma elektrodami (niekiedy
jedną z elektrod jest palnik). Jeżeli do płomienia z kolumny dochodzą tylko gaz nośny, to wytwarzan są
termojony tego gazu, które powodują pojawienie się w układzie stałego prądu jonowego o bardzo
małym natężeniu. Efektem tego jest prosta linia podstawowa zapisywana na chromatogramie. Gdy do
płomienia wodorowego wraz z gazem nośnym wprowadza się substancję wymywaną z kolumny,
wówczas jest ona spalana i w detektorze pojawia się więsza liczba termojonów. Prąd jonowy wzrasta i
po wzmocnieniu we wzmacniaczu elektrycznym jest zapisywany w postaci piku w czasie
odpowiadającym czasowi spalania się eluowanej substancji w płomieniu detektora.
Detektor wychwytu elektronów (ECD)
- umożliwia wykrywania śladowych ilości związków wykazujących powinowactwo elektronowe, np.
tlenu, heksa-floalu, siarki, tlenku azotu, halogenowodorów np.freonów, azotanów, nitryli
- nie jest przydatny do wykrywania węglowodorów alifatycznych, estrów, eterów.
Gazem nośnym może być azot, argon lub mieszanina zawierająca 5% metanu w argonie(taka
mieszanina umożliwia uzyskanie lepszej wykrywalności detektora niż przy użyciu pojedynczych gazów
nośnych)
Zasada działania ECD
Cząstka promieniowania jonizującego � powoduje jonizację gazu nośnoego z uwolnieniem elektronu.
y
ródłem cząstek � jest izotop 63Ni i detektor z tym z
ródłem może być ogrzewany do temperatury
350 C.
N2 + � N2 + e
W skutek powstawania w tej reakcji elektronów, płynie prąd, który jest prądem podstawowym
detektora i na taśmie rejestratora otrzymuje się linię prostą.
Jeśli z kolumny eluowana jest substancja wykazująca powinowactwo elektronowe to wychwytuje ona
elektrony tworząc jony ujemne.
M + e M-
Te jony zderzając się z jonami dodatnimi gazu nośnego, tworzą cząsteczki obojętne:
M + N M + N
W wyniku tych przemian natężenie prądu podstawowego detektora ulega zmniejszeniu. Gdy elucja
substancji z kolumny się zakończy wówczas natężenie prądu powraca do stanu początkowego a na
chromatografie przebieg opisywanych zjawisk jest zapisywany w postaci piku.
Inne detektory stosowane w chromatografii gazowej:
- Detektor cieplno-przewodnościowy (TCD)  katarometr reaguje na wszystkie chromatografowane
substancje (oprócz gazu, który jest gazem nośnym) i daltego jest powszechnie stosowany, szczególnie
w analize gazów.
- Detektor płomieniowo-fotometryczny (FPD) jest odmianą detektora płomieniowo-jonizacyjnego i jest
przeznaczony do elektrycznego wykrywania śladowych ilości związków siarki i fosforu.
- Detektor siarkowy chemiluminescencyjny (SCD) jest odmianą detektora płomieniowo-
fotometrycznego i jest przeznaczony do wykrywania bardzo małych ilości związków siarki np.
siarkowodoru, tlenosiarczku węgla, ditlenku siarki, disiarczku węgla, soli siarczków organicznych.
- Detektor termojonowy (TID) nazywany także alkalicznym detektorem płomieniowo  jonizacyjnym
(AMD) lub detektorem azotowo  fosforowym (NPD) stosowany jest do wykrywania śladowych ilości
związków azotu oraz związków halogenoorganicznych.
- Detektor Argonowy (ArD) może być stosowany do oznaczania zanieczyszczeń np. organicznych w
argonie, za jego pomocą nie można wykrywać gazów trwałych. którego potencjał jonizacji jest większy
od potencjału wzbudzenia argony
- Detektor Helowy (HDI) może służyć do oznaczania śladowych ilości zanieczyszczeń w czystym helu
- Detektor fotojonizacyjny (PID) szczególnie przydatny do wykrywania piktogramowych ilości
węglowodorów aromatycznych
- Detektor jonizacyjno-wyładowczy (DID) używany jest szczególnie do analizy gazów o wysokiej
czystości, w tym używanych w przemyśle półprzewodnikowym, za jego pomocą można analizować w
takich gazach jak wodór, tlen, azot, argon i hel, śladowe ilości metanu, tlenku dwutlenku węgla,
wodoru, tlenu, azotu oraz argonu, jest używany do badań czystości monomerów np. etylenu i
propylenu stosowanych do produkcji polimerów, bardzo dobrze nadaje się do analizy zanieczyszczeń w
arsynie, fosfinie, krzemometanie i germanowodorze.
- Detektor jonizacji elektronowej nazywany także detektorem selektywności masy (MSD) umożliwia
analizę wszystkich grup związków chemicznych np. halogenowęglowodorów, związków
fosforoorganicznych i azotoorganicznych, gazów i związków nieorganicznych.
Kolumny
W kolumnie chromatograficznej zachodzi właściwy proces chromatografowania i dlatego wybór rodzaju
kolumny, a szczególnie jej wypełnienia ma decydujący wpływ na jakość rozdzielania składników
mieszaniny, czyli na wynik analizy chromatograficznej. Wypełnienie, długość i średnica-są oceniane
przy wyborze kolumny.
Rozróżnia następujące rodzaje kolumn:
- zwykłe analityczne pakowane o średnicy wewnętrznej 2-6 mm i długości kilku metrów(zwykle 1-3m)
- mikropakowane o średnicy 0,8-1,2 mm i długości do kilkunastu metrów
- kapilarne o średnicy 0,2-0,6 mm i długości do kilkudziesięciu metrów
- preparatywne o średnicy ponad 6 mm i długości kilku metrów
- mikrokapilarne o średnicy powyzej 0,1 mm i długości do kilkudziesięciu metrów.
Standardowa handlowa długość kolumn kapilarnych wynosi 15, 30 i 60 m a standardowe średnice mają
wymiary 15, 25, 32 i 53 �m(najczęściej)
Kolumny o średnicy
- 25 �m mają lepszą zdolność rozdzielczą
- 32 �m mają ok. 4 razy większą pojemność sorpcyjną, można do nich dozować większe próbki i
oznaczać mniejsze ilości analizowanych substancji
- 15 �m są zalecane do analizy przy połączeniu chromatografii gazowej ze spektrometrią mas
WYKA
AD 7
Analiza jakościowa w chromatografii gazowej
Analizę jakościową rozdzielanych w kolumnie substancji można wykonać dwoma sposobami
1)Na podstawie parametrów retencji, ponieważ w takich samych warunkach chromatograficznych
analizowana substancja ma zawsze taką samą retencję.
2) Na podstawie fizykochemicznego badania frakcji z zastosowaniem detektorów jakościowych np.
połączenie z metodami spektroskopowymi (MS, IR)
Analiza ilościowa w chromatografii gazowej
Analiza ilościowa jest oparta na liniowej zależności między sygnałem z detektora, którego miarą jest
wysokość piku lub jego powierzchnia, a stężeniem substancji analizowanej w gazie nośnym
O dokładności i precyzji oznaczeń ilościowych metodą GC w dużym stopniu decydują:
- stałe warunki pracy oraz stała prędkość przepływu gazu nośnego
- dobra odtwarzalność techniki dozowania próbek
- dobór właściwego detektora
Zastosowanie chromatografii gazowej
��identyfikacja związków, w tym lotnych substancji nieorganicznych i szerokiej gamy lotnych związków
organicznych
��ilościowe oznaczanie składników w próbce
��kontrola procesów technologicznych  jest podstawowym elementem układu automatyzacji procesów
technologicznych
��wyznaczanie niektórych stałych fizykochemicznych np. współczynników aktywności, entalpii i ciepła
właściwego roztworu i innych
��badania kinetyki reakcji katalitycznych
��oznaczanie pestycydów, zanieczyszczeń organicznych, kwasów tłuszczowych
Chromatografia cieczowa
W chromatografii cieczowej fazą ruchomą jest ciecz, a fazą nieruchomą ciało stałe(chromatografia
adsorpcyjna), rzadziej ciecz osadzona na nośniku (chromatografia podziałowa).
Stosując chromatografię cieczową można analizować znacznie więcej związków chemicznych niż za
pomocą chromatografii gazowej  ok. 80%. Mogą to być ciecze i ciała stałe w tym związki łatwo
ulegające rozkładowi termicznemu, polimery i związki nieorganiczne.
Warunkiem analizy związków techniką chromatografii cieczowej jest ich rozpuszczalność.
Zasada działania chromatografu cieczowego:
- ze zbiornika z pompą zasysa się fazę ruchomą, nazywaną też eluentem.
- eluent poprzez dozownik jest tłoczony do kolumny chromatograficznej wypełnionej fazą stacjonarną,
która może być umieszczona w termostacie.
- składniki próbki rozdzielają się w kolumnie i na wyjściu z niej są wykrywane przez detektor.
- sygnał elektryczny z detektora po wzmocnieniu zapisywany jest w postaci piku chromatograficznego
Zawory dozujące
Zawór dozujący zbudowany jest w ten sposób, że w jednym położeniu dz
wigni można przepłukać i
napełnić wymienną pętlę dozowniczą o określonej objętości, ciekłą próbką lub roztworem
analizowanego ciała stałego a w drugim wprowadzić próbkę do układu.
Pojemność pętli dozowniczej może być różna i w zależności od rodzaju detektora i kolumny może ona
wynosić od 10źl do 10 ml. Mniejsze próbki są dozowane za pomocą zaworów, które nie mają
zewnętrznych wymiennych pętli dozowniczych. Zamiast pętli mają one w korpusie wyżłobienia o stałej
pojemności.
Pompa
Jest ważną częścią chromatografu cieczowego, ponieważ powoduje ona przepływ fazy ruchomej z
optymalną prędkością przez wypełnienie kolumny stawiające duży opór
Dozownik
ń�Służy do wprowadzenia próbki pod ciśnieniem atmosferycznym do kolumny, w której panuje ciśnienie
do kilkudziesięciu MPa.
ń�Powinien być tak skonstruowany, żeby nie było w nim przestrzeni martwych, tzn. nie przemywalnych
fazą ruchomą.
ń�Zły dozownik lub złe dozowanie może być przyczyną pojawienia się z
le rozdzielonych, szerokich i
niesymetrycznych pików.
ń�Obecnie w chromatografach cieczowych stosuje się najczęściej zawory dozujące.
Kolumny
- to rurki zamknięte z dwóch końców filtrami i końcówkami umożliwiającymi połączenie z dozownikiem i
detektorem lub inną kolumną
- najczęściej wykonuje się je ze stali nierdzewnej, rzadziej ze szkła lub polimerów
- kolumny przechowuje się zamknięte i zalane rozpuszczalnikiem
Oprócz kolumny właściwej stosuje się przedkolumnę. Ma ona taką samą lub mniejszą średnicę jak
kolumna właściwa i znacznie mniejszą długość  10-30mm. Zwykle jest wypełniona takim samym
materiałem jak właściwa kolumna rozdzielcza.
Znacznie przedłuża czas życia kolumny właściwej chroniąc ją przed zanieczyszczeniami znajdującymi
się w próbce lub eluencie lub powstającymi w wyniku kontaktu składników próbki z wypełnieniem
kolumny.
WYKA
AD 8
Wypełnienie kolumny
- w wysokosprawnej chromatografii cieczowej kolumnowej  rozmiar ziaren 5-10źm
- cząsteczki mniejsze od 3źm nie są stosowane, gdyż powodują zbyt duże opory fazy ruchomej.
Faza ruchoma
- rodzaj i ilość rozpuszczalników stanowiących eluenty w chromatografii cieczowej mają znacznie
większy wpływ na proces chromatografowania niż gaz nośny w chromatografii gazowej.
- faza ruchoma w chromatografii cieczowej jest czynnikiem aktywnym  czasem niewielki dodatek
drugiego rozpuszczalnika do eluentu wywiera duży wpływ na jakość rozdzielania składników mieszaniny
- przy wyborze fazy ruchomej należy uwzględnić rodzaj i skład rozdzielanej mieszaniny, rodzaj
zastosowanego wypełnienia kolumny i rodzaj detektora.
Rozpuszczalniki stosowane jako fazy ruchome w HPLC powinny:
- wykazywać odpowiednią zdolność rozpuszczania próbki
- umożliwiać detekcję próbki
Należy umieć
- charakteryzować się wysokim stopniem czystości
to na egzamin
- nie reagować chemicznie ani z fazą stacjonarną, ani z rozdzielaną próbką
- charakteryzować się trwałością w warunkach chromatografowania
Efektywność wymywania substancji z adsorbentu zależy od mocy elucyjnej rozpuszczalnika.
Rozpuszczalniki sklasyfikowano wg wzrastającej mocy elucyjnej i powstały w ten sposób tzw. szeregi
eluotropowe rozpuszczalników.
W przypadku polarnych faz stacjonarnych (np. żel krzemionkowy, tlenek glinu) rozpuszczalniki są
ułożone wg rosnącej mocy elucyjnej następująco:
n-pentan, n-heksan, cykloheksan, tetrachlorek węgla, toluen, benzen, eter dietylowy, chloroform,
dichlorometan, tetrahydrofuran, dichloroetan, aceton, octan etylu, acetonitryl, pirydyna, etanol,
metanol, woda i kwas octowy.
Moc elucji przy chromatografowaniu na niepolarnej fazie stacjonarnej (np. węglowej) jest odwrotna i
wzrost mocy elucji można obserwować w szeregu:
woda, metanol, etanol, aceton, propanon, eter dietylowy, butanol, octan etylu, n-heksan, benzen.
Miarą mocy elucyjnej rozpuszczalników, czyli miarą ich zdolności wymywania substancji
chromatografowanych z kolumny są indeksy polarności.
Chromatografia w normalnym układzie faz
Polarne fazy stacjonarne (np. żel krzemionkowy) i mniej polarne fazy ruchome (np. heksan, izooktan,
chloroform, chlorek metylenu)
Chromatografia w odwróconym układzie faz
Faza stacjonarna słabo polarna lub niepolarna i bardziej polarna faza ruchoma (np. tetrahydrofuran,
acetonitryl, metanol, woda)
Elucja izokratyczna
Skład mieszaniny jest jednakowy przez cały czas chromatografowania próbki (stała siła elucyjna)
Elucja gradientowa
W czasie rozdzielania składników jednej próbki skład eluentu zmienia się, a jego siła elucyjna się
zwiększa, dlatego że po kolei wymywamy wszystkie składniki.
Zastosowanie
W przypadku chromatografowania w normalnym układzie faz mieszanin zawierających składniki
znacznie różniące się polarnością.
W przypadku chromatografowania w odwróconym układzie faz mieszanin zawierających składniki o
bardzo różnej rozpuszczalności w fazie ruchomej.
Dobór składu fazy ruchomej
Zasada ogólna:
1) Analizę niepolarnych substancji (np. węglowodorów i ich pochodnych halogenowych
lub związków tlenowych, zawierających duże rodniki węglowodorowe) które
rozpuszczają się dobrze w hekasnie wykonuje się zwykle w odwróconym układzie faz.
Stosuje się fazę ruchomą zawierającą 0-30% wody w metanolu lub acetonitrylu.
2) Do bardzo słabo polarnych związków można stosować mieszaninę acetonitryl-
chloroform lub acetonitryl-chlorek metylenu.
3) Substancje o pośredniej polarności rozpuszczające się w estrach, alkoholu i
chloroformie mogą oddziaływać z grupami aktywnymi żelu krzemionkowego i
polarnymi grupami faz związanych z żelem krzemionkowym. Do ich analizy stosuje
się mieszaniny zawierające 2-50% organicznego rozpuszczalnika polarnego w
rozpuszczalniku niepolarnym  węglowodorze lub halogenowęglowodorze.
RACZEJ tego
4) Wiele polarnych związków organicznych rozpuszcza się w wodzie i często rozdziela
nie będzie na
się je w odwróconym układzie faz. Faza ruchoma zawiera w tym przypadku 0-50%
egzaminie.
rozpuszczalnika organicznego (metanol, acetonitryl) w wodzie. Związki
chromatografowane w takich warunkach opuszczają kolumnę w kolejności
zminiejszającej się ich polarności.
Jeśli są to substancje jonowe to w celu poprawy efektywności chromatografowania
do fazy ruchomej dodaje się sole, kwasy i roztwory buforowe.
5) Związki jonowe chromatografuje się na wymieniaczach jonowych, stosując roztwory
buforowe jako eluenty.
Eluenty izoeluotropowe  to mieszaniny rozpuszczalników mające różny skład, ale jednakową moc
elucyjną. Mogą mieć różną selektywność, dzięki czemu bez zmiany retencji substancji
chromatografowanych można lepiej rozdzielić składniki mieszaniny.
Do określenie przybliżonego składu eluentów izoeluotropowych służy nomogram.
Detektory:
W HPLC używane są przede wszystkim detektory spektrofotometryczne lub elektrochemiczne.
Ich zasada działania polega na rejestrowaniu różnicy określonej właściwości samego eluentu i roztworu
substancji chromatografowanej w tym eluencie.
Najbardziej rozpowszechnionym detektorem w chromatografii cieczowej kolumnowej są detektory
działające na zasadzie absorpcji światła nadfioletowego (UV) lub nadfioletowego i widzialnego (UV-Vis).
Najprostsze monochromatyczne detektory UV umożliwiają wykrywanie chromatografowanych
substancji przy jednej długości fali  254nm. Jest to długość fali światła pochłanianego przez większość
substancji organicznych (65%), a jednocześnie łatwa do uzyskania technicznie za pomocą lampy
rtęciowej.
Obecnie powszechnie stosowane są detektory spektrofotometryczne, w których możliwa jest płynna
regulacja długości fali światła w całym zakresie nadfioletu i jego części widzialnej (190-600nm). Taki
detektor po zatrzymaniu przepływu fazy ruchomej umożliwia rejestrację widma absorpcji substancji
znajdującej się w detektorze i ustalenie długości fali, przy której występuje maksimum absorbancji, co
pozwala na wykrycie substancji z maksymalną czułością.
Aby detektor UV dobrze działał użyty eluent nie powinien absorbować światła przy zastosowanej
długości fali.
Detektor UV jest niewrażliwy na zmiany przepływu fazy ruchomej i na zmiany temperatury.
Zasada działania:
- światło lampy deuterowej jest skupione przez układ optyczny w komórce przepływowej, w której
część światła jest absorbowana przez wykrywane substancje.
- następnie promień światła rozszczepiany na siatce dyfrakcyjnej pada na matrycę diodową (diody
mogą rejestrować intensywność światła w zakresie 190-600nm w ciągu 10ms)
- każda fotodioda przeznaczona jest do pomiaru wąskiego spektrum światła. Jednoczesna rejestracja
prądów z poszczególnych fotodiod umożliwia rejestrację całego widma absorpcji analizowanego
związku chemicznego.
Detektor ten umożliwia stwierdzenie czy pik eluowany z kolumny, odpowiada jednej substancji czy
może w jednym piku mieszczą się dwie substancje. Możliwe jest także wykonanie analizy ilościowej
składników ukrytych w jednym piku.
Detektor fluorescencyjny
Istota detekcji fluorescencyjnej polega na pomiarze intensywności światło o określonej długości fali
emitowanego przez wykrywany związek w wyniku jego wzbudzenia, które odbywa się światłem o
większej energii niż światło emitowane.
Jest najbardziej specyficznym i selektywnym detektorem spośród wszystkich detektorów w
chromatografii cieczowej.
Detekcja za pomocą detektora fluorescencyjnego jest najprostsza wówczas gdy wykrywany związek ma
naturalną zdolność do fluorescencji. Jeśli nie to przeprowadza się związki niefluoryzujące we
fluoryzujące. Wykonuje się to przed lub za kolumną dodając do analizowanej próbku lub do eluentu
odzcynniki (np. chlorek densylu), które reagując ze związkami analizowanymi, tworzą ich fluoryzujące
pochodne.
Stosując detektor fluorescencyjny należy pamiętać, że na uzyskane efekty detekcji wpływ ma rodzaj
elementu.
WYKA
AD 9
Detektor refraktometryczny
Jest najbardziej uniwersalnym detektorem spośród stosowanych w HPLC.
Detekcja polega na pomiarze różnicy współczynnika załamania światła eluentu i eluentu zawierającego
w sobie substancję wymytą z kolumny.
Budowa
Przez jedną jego komórkę przepływa sam eluent, a przez drugą mieszanina eluentu i substancji
analizowanej
Im większa jest różnica w wartościach współczynników załamania światła mierzonych w obu komórkach
tym większa jest czułość detekcji.
Można przyjąć, że detektor refraktometryczny jest detektorem o średniej czułości i w optymalnych
warunkach można nim wykryć 1 ppm chromatografowanej substancji.
Wskazania detektora zmieniają się ze zmianą składu fazy ruchomej dlatego detektor ten nie nadaje się
do pracy w przypadku elucji gradientowej. Jest wrażliwy na zmiany ciśnienia i temperatury, dlatego
musi być termostatowany z dokładnością ą0,01 C
Stosuje się go do wykrywania węglowodanów, alkoholi i kwasów alifatycznych.
Detektory elektrochemiczne
Najczęściej stosowane to polarograficzne i kulometryczne, służące do wykrywania substancji
nieorganicznych i organicznych podlegających reakcjom elektrochemicznego utleniania i redukcji. Są
one bardzo użyteczne ze względu na ich selektywność i czułość względem niektórych związków. Są
stosowane zwłaszcza do analizy związków biologicznie czynnych  syntetycznych i naturalnych np.
katecholamin.
Pewnym ograniczeniem w chromatografii z detekcją elektrochemiczną jest fakt, że nie można jej
stosować w normalnym układzie faz, ponieważ faza ruchoma mniej przewodzi prąd elektryczny, co
zwykle osiąga się przez dodatek soli. A co za tym idzie eluent musi zawierać wodę.
SPEKTOMETRIA MAS
To uniwersalna technika analityczna zaliczana do metod spektroskopowych, której podstawą jest
pomiar stosunku masy do ładunku elektrycznego cząsteczki.
Współcześnie istnieje wiele odmian tej techniki, z której każda posiada inne zastosowanie i wymaga
stosowania aparatów o innej konstrukcji. Wszystkie te techniki są jednak oparte na jonizacji cząsteczek
lub atomów, a następnie detekcji liczby i stosunku masy do ładunku powstających jonów. Wyniki
działania spektrometru mas są przedstawiane w postaci tzw. widma masowego.
Wszystkie spektrometry mają natomiast wspólny schemat blokowy, w którym są ujęte podstawowe
elementy składowe:
- z
ródło jonów  urządzenie w którym następuje jonizacja cząsteczek przy użyciu różnorodnych
technik.
- analizator  w którym wcześniej powstałe jony ulegają rozdziałowi na podstawie stosunku ich masy
do ładunku
- detektor  urządzenie  zliczające jony napływające z analizatora
Spektrometr mas rejestruje elektrycznie naładowane cząstki i daltego, aby widmo mogło powstać
badana substancja musi ulec jonizacji, chyba że jest już w postaci jonowej.
Układ wprowadzania próbek (raczej nie będzie na egzaminie do odwołania)
Jest kilka alternatywnych sposobów wprowadzania próbki do spektrometru mas, a zastosowany układ
zależy na ogół od lotności i natury próbki oraz metody jonizacji. Wprowadzenie próbki do układu jest
dość istotnym przedsięwzięciem, ponieważ w najczęściej stosowanych przyrządach cały układ musi być
utrzymany pod bardzo niskim ciśnieniem (w wysokiej próżni), aby jony mogły poruszać się bez
przeszkód.
Próbki analizowane mogą być w postaci gazu, cieczy lub ciała stałego i od charakteru próbki zależy
sposób jej wprowadzania.
Układy zimne
Gazy lub związki bardzo lotne w temperaturze pokojowej mogą przeciekać do spektrometru mas przez
szklany piasek(chyba) i dostawać się rurką szklaną do z
ródła jonów
Układ z wlotem gorącym
1. Bardzo podobny do wlotu zimnego z tym, że można go ogrzewać do ok. 300 C w celu odparowania
związków, które następnie doprowadza się do z
ródła jonów za pomocą ogrzewanego przewodu. Aby
uniknąć katalizowanego rozkładu próbki lub przegrupowania, wskazane jest wytwarzanie całego układu
AGHIS (z ang. All-glass heated inlet system)
2. Wlot przez septum, składający się z ogrzewanego zbiornika z nierdzewnej stali do którego
wprowadza się ciepłe próbki, które odparowane pod niskim ciśnieniem i w wysokiej temperaturze
dyfundują przez układ zaworowy do z
ródła jonów.
Oba wloty zimny i gorący wymagają próbki w ilości do miligrama.
Wprowadzenie bezpośrednio za pomocą sondy (włącznie do tego miejsca)
Związki, które nie są wystarczająco lotne, aby mogły być wprowadzane przez wlot zimny lub gorący,
można umieszczać bezpośrednio w z
ródle jonów za pomocą sondy przechodzącej bezpośrednio przez
próżniową śluzę. Pod niskim ciśnieniem panującym wewnątrz typowego z
ródła, w którym zachodzi
jonizacja elektronami, oraz w wyniku ogrzewania liczne związki stają się wystarczająco lotne, aby
mogły dawać dobre widma.
Stosując zmodyfikowaną konstrukcję sondy, można wprowadzając ją nie wprost do z
ródła, ale tuż nad
nim lub jako strumień elektronów używanych do jonizacji.
Wlot przez chromatograf gazowy
Stosujemy, gdy analizujemy mieszaniny związków, a nie jak poprzednio czyste lub prawie czyste
związki. Widmo mas mieszaniny jest zwykle zbyt złożone, aby można je było interpretować bez
wątpliwości, dlatego wskazany jest rozdział składników mieszaniny przed badaniem metodą
spektroskopu mas.
Stosowane są dwie metody połączenia chromatografu z MS:
1. Należy wprowadzić z chromatografu do spektrometru tylko część próbki, aby nie spowodować
przeciążenia układu  uzyskuje się to za pośrednictwem separatorów, gdzie oddziela się z reguły
nadmiar gazu nośnego od próbki (stosując np. membrany półprzepuszczalne) i wtedy wprowadza się ją
do spektrometru.
2. Jeżeli w chromatografie gazowym stosuje się kolumnę kapilarną o niewielkim przepływie gazu
nośnego, a układ odpompowujący spektrometru masowego ma wystarczającą wydajność, to możliwe
jest bezpośrednie połączenie chromatografu masowego ze spektrometrem masowym  są to zazwyczaj
chromatografy o wysokiej sprawności i takie połączenia są najczęściej spotykane.
Wlot z roztworów
Połączenie spektrometru mas z przepływającym strumieniem cieczy stanowi pewne techniczne
wyzwanie, gdyż niezbędne jest tutaj odparowanie całego eluentu, a następnie usunięcie
rozpuszczalnika, zanim rozpuszczona substancja zostanie wprowadzona do z
ródła jonów i poddana
jonizacji w fazie gazowej. Jeżeli nie uda się usunąć nadmiaru rozpuszczalnika to spowoduje to
powstanie niedopuszczalnie wysokiego ciśnienia w z
ródle jonów.
Termosprej  jedyny szeroko rozpowszechniony interfejs(połączenie między spektrometrem mas i
chromatografem) w którym ciecz jest podgrzewana i przepuszczana dyszę, co powoduje wytwarzanie
aerozolu. Sam proces rozpylania nosi nazwę nebulizacji. Szybkie pompowanie pozwala na uniknięcie
większości rozpuszczalnika, a jonizacja zachodzi w wyniku reakcji chemicznych.
Przepływ ciągły lub dynamiczne bombardowanie szybkimi elektronami  wprowadzenie cieczy
do z
ródła jonów skonstruowanego w ten sposób, że jonizacja zachodzi bezpośrednio z fazy ciekłej.
Elektrosprej  polega na wprowadzeniu strumienia cieczy o niewielkim przepływie w silne pole
elektryczne pod ciśnieniem atmosferycznym. Pole elektryczne jest wytwarzane przez przyłożenie
napięcia 3-6kV między kapilarą, a elektrodą o przeciwnym znaku. Pole powoduje akumulację ładunków
w powierzchniowej warstwie cieczy na końcu kapilary, która to warstwa ulega rozerwaniu, a
znebulizowana ciecz tworzy strumień naładowanych kropelek. Odparowanie rozpuszczalnika zawartego
w kropelkach powoduje ich kurczenie, aż do momentu, w którym siły odpychania kolumbowskiego
zbliżą się do poziomu spójności i spowodują ich rozerwanie. Krople mogą w ten sposób ulegać
kaskadowemu rozszczepieniu do coraz to mniejszych kropelek, aż do momentu, gdy pole elektryczne
na ich powierzchni stanie się wystarczająco duże, aby spowodować desorpcję jonów.
Zasada spektrometru mas w analizie substancji organicznych w pierwszym etapie polega na
wytworzeniu jonów tej substancji. Metoda wytwarzania jonów tej substancji może być różna w
zależności od sposobu w jakim następuje jonizacja.
We współczesnej spektrometrii mas stosuje się:
- jonizację strumieniem elektronów
- jonizację polem elektrycznym
- jonizację chemiczną
- desorpcję polem elektrycznym
- spektrometrię mas jonów wtórnych
- bombardowanie szybkimi atomami
- jonizację w iskrze
- jonizację w indukcyjnie sprzężonej plazmie
- elektrorozpylanie
- jonizację w wyniku desorpcji laserem
Jonizacja i fragmentacja
Jon dodatni może zostać wytworzony z cząsteczki poprzez proste usunięcie jednego elektronu  proces
destrukcyjny.
Proces jonizacji można przedstawić równaniem:
M M+ + e
Jon M+ jest nazywany jonem molekularnym (lub jonem macierzystym) i jest charakteryzowany
dwoma parametrami: ładunkiem (z) i masą (m).
W spektrometrach masowych jony są analizowane wg stosunku masy do ładunku (m/z). Jeżeli
utworzony jon będzie miał ładunek jednostkowy, wówczas z będzie równy +1 i stosuenk masy do
ładunku będzie równy liczbowo masie jonu.
W celu wytworzenia jonu molekularnego z obojętnej cząsteczki niezbędne jest dostarczenie energii
przynajmniej równej pierwszemu potencjałowi energetycznemu cząsteczki. Wartość ta zależy od natury
pierwszego orbitalu, gdyż zazwyczaj z niego urywany jest elektron.
W spektrometrii mas w większości metod jonizacji stosuje się energie wyższe niż pierwszy potencjał
jonizacyjny. Jony z nadmiarem energii wewnętrznej łatwo ulegają dysocjacji. Proces ten powszechnie
nazywany jest fragmentacją. Prowadzi on do powstania nowych jonów i cząstek obojętnych.
Jon molekularny może ulegać rozpadowi na:
- parzystoelektronowy jon i nieparzystoelektronową cząstkę obojętną.
- nieparzystoelektronowy jon i parzystoelektronową cząstkę obojętną.
Procesy fragmentacyjne mogą przebiegać z oderwaniem parzyto- lub nieparzystoelektronowych
cząstek obojętnych, a powstałe jony i cząstki mogą się dalej rozpadać wg ustalonych schematów. Taki
proces fragmentacji prowadzi do powstania szeregu jonów, które tworzą widmo masowe danego
związku. Wszystkie drogi fragmentacji tworzą schemat fragmentacji charakterystyczny dla danego
związku.
Jonizacja elektronowa EI
Jest najstarszym, ale w dalszym ciągu najczęściej stosowanym sposobem jonizacji GC-MS.
W tym układzie elektrony emitowane z włókna żarowego (filamentu), przelatując przez komorę
jonizacji w kierunku anody oddziaływują z cząsteczkami próbki powodując ich jonizację. Najpierw
tworzy się jon molekularny, który póz
niej wg ustalonych schematów, charakterystycznych dla danego
typu cząsteczek, ulega fragmentacji.
Energia potrzebna do jonizacji cząsteczek jest różna, pierwszy jony pojawiają się już prz energii 15-20
eV  potencjał jonizacji. Wydajność jonizacji gwałtownie wzrasto do ok. 50eV po czym osiąga
względnie stałą wartość. Zazwyczaj pracuje się przy potencjale 70 eV. Fragmentacja uzależniona jest
od energii jonizacji, im jest ona większa tym więcej fragmentów powstaje.
Warto wiedzieć:
1. Widmo powstające w spektrometrze masowym to: widmo fragmentacyjne.
2. Czym się różni pik chromatograficzny od piku powstającego w widmie
masowym(fragmentacyjnym)?- Pik chromatograficzny- krzywa Gausa, pik masowy- sygnały
prądowe (stosunek masy do ładunku i natężenia)
3. Jak narysować widmo fragmentacyjne danego związku (będzie lub nie będzie podany stosunek
masy do ładunku) np. wody.
WYKA
AD 10
Wadą EI jest to, że energia jonizacji jest zbyt wysoka dla niektórych grup związków, przez co następuje
silna fragmentacja cząsteczki i brak możliwości obserwacji jonu molekularnego.
W przypadku jonizacji strumieniem elektronowym EI próbka musi być przeprowadzona w stan pary,
musi się więc charakteryzować pewną lotnością w temperaturze pokojowej lub po ewentualnym
ogrzaniu. Wymaganie to stanowi poważne ograniczenie EI, gdyż nie może być spełnione dla bardzo
wielu klas związków organicznych, takich jak np. aminokwasy, peptydy, białka, cukry, kwasy
nukleinowe.
Jonizacja chemiczna CI
Opiera się ona na reakcji jonu gazu reakcyjnego z badaną cząsteczką. Jako gazy reakcyjne stosuje się
najczęściej metan, propan, izobutan, amoniak. Do komory jonizacyjnej wprowadza się analit z dużą
ilością gazu reakcyjnego. W takich warunkach istnieje znacznie większe prawdopodobieństwo
bombardowania elektronami cząsteczek gazu reakcyjnego, niż cząsteczek analitu.
Przykładowa droga jonizacji chemicznej z zastosowaniem metanu:
CH4 + e CH4�++2e
Wytworzony jon CH4+ ulega kolejnym przemianom:
Jon CH4+ mogą reagować z analitem M według reakcji:
CH4++M CH3 + MH
Powstają w ten sposób w widmie jony o masach M+1 a także w niewielkich ilościach jony powstałe z
przyłączenia do cząsteczek jonów wtórnych i główne fragmenty jonizacji cząsteczki.
Analizator jonów
Zadaniem analizatora w spektrometrze mas jest rozdzielanie wiązki jonów wg wartości stosunku m/z.
Najpopularniejsze to spektrometry sektorowo-magnetyczne. Są to urządzenia drogie, duże i
stosunkowo wolne, ale ogromną ich zaletą jest bardzo duża rozdzielczość (rozróżniają one masy z
dokładnością do pięciu miejsc po przecinku)
W układach GC-MS bardzo często stosowane są spektrometr kwadrupolowy i pułapka janowa. Oba
mają dość niską rozdzielczość( praktycznie rozróżniają jony z dokładnością do jednostki masy), ale są
bardzo szybkie i zbierają pełne widmo substancji w czasie ok. 0,3s. Noszą nazwę spektrometrów niskiej
rozdzielczości (Low Resolution)
Kwadrupolowy spektrometr mas
Zbudowany jest z czterech elektrod, do których parami przyłożone jest napięcie elektryczne. Między
elektrody wprowadzany jest strumień jonów. Do elektrod przykłada się stale napięcie U i pole
elektryczne o częstotliwości radiowej. Dobierając odpowiednio te parametry można część jonów
wydzielić na elektrodach a inne przepuścić przez układ. Zmieniając w czasie napięcia przyłożone do
elektrod rejestruje się jony o określonej masie. W ciągu ułamka sekundy można zebrać pełne widmo
badanego związku. Analizator kwadrupolowy ma zatem właściwości filtrujące i dlatego nazywany jest
często filtrem mas. Jest najczęściej stosowanym analizatorem w układach OC-MAS.
Pułapka jonowa
Jest analizatorem charakteryzującym się dużą czułością i szybkością skanowania oraz szerokim
zakresem pomiarowym lecz niską rozdzielczością.
W pułapce jonowej, w odróżnieniu od innych spektrometrów, jonizacja i analiza przebiega w tym
samym miejscu. Eluent z chromatografu gazowego trafia do cylindrycznej komory wielkości kilkunastu
cm3, do której pierścieniowej ścianki przyłożone jest napięcie zmienne o wysokiej częstotliwości. Nad
komorą umieszczone jest włókno żarowe emitujące elektrony, a pod komorą detektor jonów.
Wytworzone przez elektrodę pole elektryczne utrzymuje jony wewnątrz pułapki. Odpowiednie zmiany
tego pola powodują, że kilka razy w ciągu sekundy jony opuszczają pułapkę w kolejności wzrastającego
stosunku m/z trafiając do detektora. Przyrząd ten wyposażony jest w dwustopniowy układ próżniowy:
pompa rotacyjna (wstępna) daje wstępną próżnię rzędu 10-2 Torr, a pompa dyfuzyjna (molekularna)
10-5 Torr.
Detektory
Zadaniem detektora w spektrometrze mas jest rejestracja jonów przechodzących przez analizator.
Najczęściej stosowane detektory to:
�� Puszka Faraday a
�� Powielacz elektronowy
�� Detektor mikrokanalikowy
�� Detektor fotopowielaczowy
�� Detekcja w analizatorze cyklotronowego rezonansu jonów (ICR)
WYKA
AD 11
ATOMOWA SPEKTROMETRIA ABSORPCYJNA (ASA)
Spektrometria atomowa jest metoda analityczną opartą na interpretacji widm atomowych i
wykorzystująca ilościowe zależności między przejściami elektronowymi a oddziałujacą na nie energią.
Metody oparte na spektroskopii atomowej obejmuja trzy rózne techniki analityczne:
�� Emisję atomową
�� Absorpcję atomową
�� Fluorescencje atomową
��
Metoda atomowej spektrometrii absorpcyjnej jest jedną z częściej stosowanych metod oznaczania
śladowych zawartości pierwiastków.
Metoda ta polega na pomiarze absorpcji promieniowania elektromagnetycznego przez wolne atomy
utworzone najczęściej na drodze termicznej stosując tzw. plazmę niskotemperaturową ( 1000-4000 K )
Badane atomy wprowadza się do środowiska absorbującego w postaci roztworu. Wolne atomy
otrzymuje się z roztworów perzez doprowadzenie energii.
Liczba wolnych atomów w plazmie jest proporcjonalana do steżenia roztworu badanego czyli:
N=r*e
Metoda opiera się na dwóch prawach:
Prawo Kirchoffa  jeżeli układ atomów silnie emituje promieniowanie o okreslonej długości fali to
także silnie absorbuje promieniowanie o tej samej długości fali.
Prawo Lamberta  Beera- absorbancja promieniowania przez ośrodek materialny jest proporcjonalna
do długości drogi promieniowania w tym ośrodku oraz do stężenia adsorbujących cząsteczek atomów.
A=log =log =�bN
�- molowy współczynnik absorpcji przy długości fali 
b- długość drogi optycznej
N- liczba wolnych atomów w środowisku absorbującym
Schemat spektrometru ASA:
y
ródło promieniowania
y
ródła promieniowania w spektrometrach absorpcji atomowej powinny emitować linie rezonansowe
oznaczonego pierwiastka charakteryzujące się:
�� Stabilnością
�� Małą szerokością połówkową pasma
�� Dużym natężeniem
Właściwości takie wykazują:
�� lampy z katodową wnęką (ang. HCL);
�� lampy z wyładowaniem bezelektronowym (ang. EDL);
Lampa z katodową wnęką  jest to rurka szklana z okienkiem kwarcowym wypełniona gazem
szlachetnym ( Ne, Ar) pod ciśnieniem 2-8 HPa
W rurce znajduje się anoda najczęściej z wolframu i katoda wykonana z metalu, którego linie
rezonansowe lampa ma emitować.
Mechanizm powstawania energii promienistej:
�� Dodatnie jony gazu szlachetnego wypełniającego lampę bombardują katodę i wybijają z niej
atomy metalu
�� Wybite atomy metalu w stanie gazowym ulegają wzbudzeniu i emitują promieniowanie
�� Widmo takiego promieniowania składa się z linii charakterystycznych dla atomów metalu katody
oraz atomów gazu wypełniającego lampę
�� W procesie pomiaru należy za pomocą monochromatora wybrać pożądaną linię analityczną a
pozostałe wyeliminować
WNIOSEK
Musimy mieć tyle lamp, ile pierwiastków chcemy oznaczać.
Produkowane są także lampy wielopierwiastkowe, których katoda jest wykonana z mieszaniny kilku
pierwiastków np. Cu i Mg i Al.; Fe, Cu i Mn; Cu, Zn, Pb i Sn; Cr, Co, Cu, Mn i Ni  zwykle
charakteryzują się one gorszymi parametrami
Lampa z wyładowanie elektronowym
Lampy te stosuje się zwykle do pierwiastków dla których nie można zbudować lamp katodowych np.
As, Sb, Se, Te.
Jest to rurka kwarcowa zawierająca gaz szlachetny ( Ne, Ar) pod zmniejszonym ciśnieniem 0.2-0.8 hPa
i niewielką ilość pierwiastków (1-2mg), którego promieniowanie winno być emitowane. Pobudzenie do
promieniowania następuje przez działanie pola elektrycznego dużej częstości ( między 10 i 100MHz)
Wytwarzane są dla pierwiastków: As,Sb,Se,P,Hg,Bi,Cs,Ge,K,Rb,Tl
Atomizery
Zadaniem atomizerów jest wytworzenie z próbki analitycznej wolnych atomów oznaczanego pierwiastka
z dużą wydajnością.
Atomizer musi spełniać dwa podstawowe wymagania:
Zapewniać dobrą wydajność wolnych atomów z analizowanej próbki
Zapewnić występowanie prostej proporcjonalności między stężeniem oznaczanego pierwiastka w
próbce a stężeniem atomów tego pierwiastka w plazmie absorbującej promieniowanie.
Rozróżnia się następujące typy atomizerów:
�� Płomieniowy ( ang. Flame- F-AAS)
�� elektrotermiczne (bezpłomieniowe) (ang-electrothermal  ET-AAS)
�� wodorowe  dla pierwiastków łatwo tworzących wodorki;
�� wykorzystywane zimne pary rtęci  dla oznaczania rtęci, dla substancji stałych z atomizacja w
plazmie laserowej
Atomizacja płomieniowa
W atomizerach płomieniowych substancje analizowane są w postaci roztworu. Przejście od roztworu do
gazu atomowego składa się z dwóch etapów:
Nebulizacji- polegającej na rozproszeniu analizowanego roztworu w delikatną mgłę i przeprowadzeniu
jej w sposób jednorodny do płomienia
Atomizacji-atomizacja zachodzi w płomieniu palnika, do którego doprowadza się gaz utleniający, gaz
palny i roztwór analizowanej substancji w postaci aerozolu.
Gaz utleniający:
�� Powietrze
�� Tlen
�� Tlenek azotu(I)  N2O
Gaz palny:
�� Acetylen
�� Gaz świetlny
�� Propan-butan
Procesu fizykochemiczne i reakcje chemiczne zachodzące po wprowadzeniu analizowanego roztworu do
płomienia:
�� Odparowanie rozpuszczalnika
�� Stopnienie soli i przeprowadzenie jej w stan par
�� Reakcja dysocjacji termicznej- podstawowa reakcja dostarczająca wolnych atomów zdolnych
do absorpcji promieniowania
�� Reakcja jonizacji
�� Reakcja wzbudzenia
�� Reakcja syntezy
Pozostałe procesy należą do reakcji przeszkadzających, zmniejszają powiem liczbę wolnych atomów
Dysocjacja termiczna soli jest zależna od temperatury płomienia a wydajność reakcji rośnie
wykładniczo ze wzrostem temperatury. Konieczne jest zróżnicowanie temperatury płomienia dla
różnych pierwiastków.
W przypadku pierwiastków, które tworzą w płomieniu trwałe tkanki lub wodorotlenki konieczne jest
stosowanie płomienia redukującego z użyciem jako gazu utleniającego podtlenku azotu( w wyniku
reakcji nie powstaje ani woda ani dwutlenek węgla, mogących reagować z analizowanymi metalami)
WYKA
AD 12
Atomizacja elektrotermiczna:
Najczęściej stosowane są kuwety grafitowe.
Budowa kuwety grafitowej:
�� Rurka o długości 20-50 mm i średnicy wewnętrznej 4-6 mm
�� W górnej części rurki jest otwór do wprowadzania próbki
Próbki ciekłe dozuje się za pomocą mikropipetek, a objętości dozowane są w zakresie od 0,005 do 0,1
cm3 . Możliwe jest także bezpośrednie dozowanie substancji stałych. Stosuje się różne techniki
ogrzewania, w tym programowane ogrzewanie oporowe. W czasie ogrzewania kuweta grafitowa
znajduje się w atmosferze bardzo czystego gazu obojętnego, którym najczęściej jest argon.
Ogrzewanie odbywa się w sposób programowy i wyróżnia się 3 jego fazy:
1. Faza pierwsza- suszenie dozowanej próbki w niskiej temp. od 300 do 500 K, czas trwania 30-60s
2. Faza druga- spopielanie i usunięcie niektórych składników matrycy, następuje w temp. 500-
1000K
3. Faza trzecia- atomizacja. W tej fazie przeprowadza się oznaczaną substancję w stan plazmy
termicznej.
W tej fazie zachodzą takie procesy jak: parowanie substancji, rozkład związków, dysocjacja do
atomów, reakcje redukcji.
Proces atomizacji zależy od :
�� Temp., która zależy od oznaczanej substancji (1000-3700K)
�� Szybkości ogrzewania, trwa 1-2 s
Ważną rolę odgrywa także gaz obojętny (Ar), który zapewnia bierność chemiczną plazmy oraz
ochronę kuwety przed utlenieniem i zniszczeniem.
Umieć na egz
ten wykres!
Technika wodorkowa:
Zasada wodorkowej techniki atomizacji polega na wytworzeniu lotnych wodorków i przeprowadzeniu
ich do kuwety absorpcyjnej, gdzie w podwyższonej temp.(1000K) następuje termiczny rozpad
wodorków i powstają wolne atomy.
Silnymi środkami redukującymi , np. borowodorkiem sodu (NaBH4), można wytworzyć w roztworach
kwaśnych lotne wodorki z następującymi pierwiastkami: Se, Te, As, Sb, Bi, Ge, Sn, Pb
Zaleta techniki wodorkowej: (umieć na egz!)- można oddzielić pierwiastek analizowany od matrycy i
przeprowadzić go w postaci czystej do kuwety.
Technika zimnych par rtęci:
W tej technice stosowane są kuwety przepływowe. Są to rurki kwarcowe lub szklane z okienkami
kwarcowymi.
W takiej technice można oznaczać w postaci zimnych par: (umieć na egz!)
�� Rtęć w postaci Hg2+ w roztworach po redukcji Sn2+ i wypłukaniu wolnej rtęci strumieniem Ar
�� Rtęć w gazach, w przypadku gdy stężenie rtęci np. w powietrzu jest zbyt małe, można
przeprowadzić wstępne wzbogacenie najlepiej na wacie złotej, a następnie przez szybkie
ogrzewanie do temp. 700-800K powoduję się desorpcję rtęci z amalgamatu w przepływającym
gazie
Monochromatory:
Ich zadaniem jest spektralny rozkład promieniowania elektromagnetycznego, które przeszło przez
atomizer.
Monochromator musi skierować przez szczelinę wyjściową do detektora tylko linię rezonansową, która
jest absorbowana przez atom w atomizerze, pozostałe długości fali powinny być wyeliminowane.
W atomowej spektrometrii absorpcyjnej stosuje się najczęściej monochromatory typu siatkowego.
Detektor:
Do pomiaru natężenia promieniowania stosuje się fotopowielacze.
Sygnał z fotopowielacza jest wzmocniony, przetworzony i przekazany do miernika.
Analiza ilościowa metodą ASA:
Podstawą ilościowych oznaczeń jest fakt, że absorpcja promieniowania zależy od liczby wolnych
atomów w środowisku absorbującym, a liczba ta zależy od całkowitego stężenia analizowanego
pierwiastka w próbce.
Wykorzystuje się równanie przedstawiające prostoliniową zależność absorbancji A od stężenia
analizowanego pierwiastka w próbce.
ASA jest typową metodą porównawczą a metodyka oznaczeń oparta jest na trzech sposobach
postępowania:
�� Metodzie krzywej wzorcowej
�� Metodzie dodatku wzorca
�� Metodzie wzorca zewnętrznego
Metoda dodatku wzorca:
�� Oznaczenie oparte jest na krzywej kalibracyjnej sporządzonej w obecności składników matrycy
�� Wzrastające ilości roztworu wzorcowego są dodawane do kolejnych porcji próbki, przy czym
przyjmuje się, że składniki matrycy wpływają w jednakowy sposób na procesy zachodzące w
atomizerze.
�� Najczęściej tak dobiera się dodawaną ilość wzorca, aby wprowadzana ilość analitu odpowiadała
w przybliżeniu zawartości analitu w próbce, a drugi dodatek był w przybliżeniu dwukrotnie
większy
Główne zalety ASA:
�� Bardzo dobra czułość
�� Niska granica wykrywalności
�� Dobra selektywność- określana zdolnością rozdzielczą aparatu
�� Odtwarzalność oznaczeń- zależy od : wstępnej obróbki chemicznej próbki, stabilności
techniki pomiarowej , odtwarzalności wytwarzania plazmy
Ograniczenia metody ASA związane są z występowaniem interferencji, które w sposób zasadniczy
wpływają na dokładność analizy.
Wyróżnia się 2 grupy czynników zakłócających :
�� Czynniki aparaturowe
�� Czynniki matrycowe
Efekty matrycowe:
Matryca jest tym wszystkim, co wprowadzamy do układu poza pierwiastkiem oznaczanym i ma duży
wpływ na dokładność oznaczeń.
Matryca ma duży wpływ na podstawowe procesy zachodzące w atomizerze:
�� Parowanie
�� Dysocjacje
�� Wzbudzenie i jonizację atomów
Aby przeciwdziałać niekorzystnym wpływom matrycy, dodaje się do próbki różnego rodzaju bufory:
�� Dejonizujące, które zmniejszają i stabilizują jonizację
�� Korygujące, zwiększające dysocjację związków do wolnych atomów
Czynniki aparaturowe są związane w dużej mierze z zakłóceniami spektralnymi.
Interferencje spektralne to :
�� Absorpcja molekularna
�� Rozproszenie światła
�� Bezpośrednie nakładanie się linii
�� Emisja własna kuwety grafitowej
Interferencje chemiczne:
�� W fazie ciekłej
�� W fazie stałej
Interferencje chemiczne powstają:
* Na skutek powstawania lotnych form chemicznych analitu w etapie suszenia i spopielania
(powody: najczęściej obecność chlorowców w próbce, skutek: obniżenie czułości);
* Tworzenie się stabilnych węglików w reakcji z grafitem
(powód: reaktywność grafitu i wysoko  termiczna stabilność utworzonych węglików, skutek: mniejsza
wydajność atomizacji.);
* Blokady powierzchni grafitu przez matrycę w etapie atomizacji
(powód: obecność matrycy w etapie atomizacji, skutek: zmiana wydajności atomizacji);
* Reakcji analitu ze związkami matrycy z fazie pary
(powód: obecność reaktywnych składników matrycy w fazie gazowej podczas atomizacji, skutek:
tworzenie się lotnych form monochlorków, obniżenie wydajności atomizacji);
* Kondensacji analitu na zimniejszych częściach kuwety
(powód: zwiększony transport analitu do zimniejszych części kuwety powodowany obecnością
matrycy, skutek: usunięcie analitu w formie kondensatu).
WYKA
AD 13
Metody minimalizacji interferencji:
�� Korelacja tła
�� Wzorcowanie metodą dodatków
�� Selektywna ekstrakcja oznaczanego pierwiastka
�� Właściwy dobór kuwety grafitowej
�� Wybór technik wprowadzania próbki
�� Modyfikacja kuwety grafitowej
�� Zastosowanie modyfikatorów matrycy
METODY ELEKTROANALITYCZNE
Podstawy metod elektroanalitycznych
Wiele metod elektroanalitycznych opiera się na elektrochemicznych właściwościach roztworów a
szczególną rolę odgrywają wodne roztwory elektrolitów
Jony w roztworach są to indywidua chemiczne obdarzone ładunkiem elektrycznym dodatnim- kationy
lub ujemnym- aniony
Oddziaływania elektrostatyczne występujące w roztworach:
�� Jon- jon pomiędzy jonami o tym samym znaku u jonami o znakach przeciwnych mają charakter
sił elektrostatycznych a ich wielkość określa prawo Coulomba
�� Jon- dipol między jonami a dipolami elektrycznymi rozpuszczalnika
�� Dipol- dipol
�� Inne- oddziaływania w tym tworzenie wiązań wodorowych i oddziaływania siłami van der Waalsa
W chemii roztworów ważną rolę odgrywa rozpuszczalnik, którym w przypadku elektrolitów przeważnie
jest woda.
Cząsteczka wody jest dipolem, ponieważ posiada trwały elektryczny moment dipolowy, który wynika z
�� Występowania poważnych różnic w elektroujemności wodoru i tlenu
�� Faktu, że atom tlenu ma wolną parę elektronową
Budowa cząsteczki wody
Potencjał elektrody- podwójna warstwa elektryczna
Elektrodą ( półogniwem ) w elektrochemii nazywamy układ złożony z dwóch faz przewodzących, z
których jedną jest metal lub inny stały przewodnik a drugą jest elektrolit.
Potencjał elektrody jest ściśle związany z powstawaniem podwójnej warstwy elektrycznej na granicy
faz elektroda/elektrolit.
We wnętrzu fazy homogenicznej (np. materiału elektrody lub roztworu elektrolitu) panuje równowaga
sił wzajemnego oddziaływania poszczególnych naładowanych lub polarnych cząsteczek tak, że suma sił
działających na cząsteczki jest równa zeru. W takim stanie równowagi kationy i aniony są
rozmieszczone równomiernie w elektrolicie. Przy zanurzeniu do elektrolitu elektrody następuje
zakłócenie tego stanu równowagi.
Na granicy faz następuje:
�� Zorientowanie dipoli rozpuszczalnika (wody) w pobliżu powierzchni elektrody i powstaje tzw.
wewnętrzna warstwa Helmholtza będąca monomolekularną ukierunkowaną warstwą
rozpuszczalnika
�� Anizotropia ładunku na granicy faz wywołana ukierunkowaniem dipoli rozpuszczalnika
powoduje, że za warstwą rozpuszczalnika jony mogą ulegać wzbogaceniu lub zubożeniu w
stosunku do średniego stężenia w elektrolicie. Taka wzbogacona lub zubożała w jony strefa
nazywa się zewnętrzną warstwą Helmholtza. Nadmiar lub niedobór jonów w tej warstwie
indukuje równy, co do wartości, ale o przeciwnym znaku ładunek na powierzchni elektrody
�� W kierunku elektrolitu ładunek nadmiarowy jest rozmyty i powstaje w ten sposób nadmiarowa
warstwa dyfuzyjna ( warstwa Gouya- Chapmana)
Schemat budowy podwójnej warstwy elektrycznej
Reakcje elektrodowe
Reakcje elektrodowe dotyczą przepływu ładunku z elektrody do roztworu lub z roztworu do elektrody-
można je określić mianem reakcji redox. Dotyczą one procesów utleniania i redukcji.
Cu(s) - 2e utlenianie Cu(aq) 2+
Cu(aq)2+ +2e Cu(s)
redukcja
Ogólne równanie wszystkich reakcji elektrodowych
Postać utleniona + ne postać zredukowana
Ogólną postać reakcji elektrodowych przedstawiamy często w postaci reakcji połówkowych
Przykład ogniwa: ogniwo Daniella
W ogniwie Daniella, którego schemat można zapisać:
Przebiega reakcja chemiczna:
Zn + Cu2+ ą� Zn2+ + Cu
Na anodzie zachodzi proces utleniania
Zn ą� Zn2+ + 2e
A na katodzie proces redukcji:
Cu2+ + 2e ą� Cu
W elektroanalizie chemicznej stosuje się dwa rodzaje ogniw:
�� Ogniwa galwaniczne (elektrochemiczne)
�� Ogniwa elektrolityczne
Ogniwo galwaniczne to układ zawierający dwie płyty, najczęściej z metalu lub grafitu zanurzone w
roztworze lub roztworach elektrolitów.
W ogniwie zachodzi egzoenergetyczna reakcja utleniania- redukcji. Znaczna część uwalnianej energii
zostaje przekazana do otoczenia w postaci pracy elektrycznej.
Ogniwo składa się z dwóch półogniw, które są układem dwufazowym. Faza metaliczna (lub grafitowa)
półogniwa nazywa się elektrodą. Reakcja chemiczna zaczyna przebiegać w momencie połączenia
elektrod przewodnikiem metalicznym a roztworów tzw. kluczem elektrolitycznym ( rurka zawierająca
roztwór soli zamknięta materiałem półprzepuszczalnym) umożliwiającym przepływ jonów przy
jednoczesnym zabezpieczeniu przed mieszaniem się roztworów.
Na anodzie zachodzi proces utleniania a na katodzie proces redukcji.
Siła elektromotoryczna ogniwa (SEM) równa jest różnicy potencjałów wewnętrznych między
przewodnikami wykonanymi z tego samego metalu, dołączonymi do anody i katody, gdy przez ogniwo
nie przepływa prąd elektryczny. Można ją wyznaczyć doświadczalnie lub obliczyć korzystając z tzw.
potencjałów standardowych.
Za punkt odniesienia przyjmuje się standardowe półogniwo wodorowe (SPW), którego potencjał
ustalony umownie jest równy zero. SEM ogniwa zbudowanego z półogniw standardowych (stężenia
jonów w roztworze równe 1 mol/dm3) oblicza się z różnicy potencjałów standardowych katody i anody
SEM = E0K  E0A
Ogniwo elektrolityczne
Ogniwa elektroanalityczne są to układy, w których do elektrod jest podłączone zewnętrzne z
ródło
prądu.
Zjawisko przepływu prądu wykorzystywane jest do monitorowania różnych reakcji elektrolizy
stosowanych w kulometrii, elektrograwimetrii a także w metodach woltamperometrycznych.
Podział metod elektroanalitycznych
Metody elektroanalityczne obejmują wiele technik pomiarowych opartych na badaniu reakcji
elektrodowych i procesów zachodzących między elektrodami.
Podstawę tych metod stanowi pomiar wielkości elektrycznych (napięcie, natężenie prądu, opór
elektryczny) związanych ze stężeniem bądz
całkowitą ilością oznaczanej substancji.
Podział metod elektroanalitycznych
1. Metody, w których reakcja elektrodowa przebiega przy zerowym prądzie Faradaya, czyli bez
przyłożonego napięcia zewnętrznego. Metodą taką jest potencjometria oparta na SEM ogniwa
złożonego z niespolaryzowanych elektrod.
2. Metody, w których reakcja elektrodowa przebiega przy niezerowym prądzie Faradaya, czyli z
przyłożonym do elektrod napięciem z zewnętrznego z
ródła prądu. Metod takich jest wiele i
różnią się one w sposób zasadniczy. Można w tej grupie wyróżnić:
a. Metody polarograficzne
b. Metody woltamperometryczne
c. Metody amperometryczne
d. Metody elektrograwimetryczne
e. Metody kulometryczne
3. Metody, w których nie przebiega reakcja elektrodowa
a. Konduktometria
b. Oscylometria
c. Dielektrometria
4. Metody oparte na badaniu zmian w elektrycznej warstwie podwójnej np. tensammetria, oparta
na pomiarze zmian pojemności warstwy podwójnej zachodzących w wyniku adsorpcji lub
desorpcji związków powierzchniowo czynnych.
WYKA
AD 14
METODY ELEKTROFORETYCZNE
Elektroforeza - wędrówka jonów w polu elektrycznym i proces rozdzielania tych cząsteczek wskutek
różnicy szybkości ich migracji.
Zastosowanie elektroforezy - analiza i oczyszczanie makrocząsteczek/białek/kwasów nukleinowych oraz
cukrów, aminokwasów, peptydów, nukleotydów, jonów i in.
Szybkość poruszania się cząstki w polu elektrycznym: � =ź E
gdzie: � [cm/s]  szybkość migracji
ź [m2/s V]  ruchliwość
elektroforetyczna
E [V/m]  natężenie pola elektrycznego,
Wpływ parametrów środowiska:
F - siła działająca na cząstkę w polu elektrycznym
F =� qE
q - ładunek cząstki
6p�h�rv =� qE
� - lepkość środowiska
r - promień cząstki
qE
v =�
6p�h�r
Ruchliwość elektroforetyczna (ź) jest charakterystyczna dla danego jonu i jest wprost
proporcjonalna do jego ładunku q [C], i odwrotnie proporcjonalna do promienia r [pm]
q
m� =�
Podział metod elektroforetycznych:
6p�h�r
�� Elektroforeza swobodna
�� Elektroforeza w nośnikach:
o bibułowa
o żelowa [agarozowy, PAGE]
Etapy elektroforezy:
�� przygotowanie próbki
�� wybór odpowiedniego nośnika i systemu buforów elektroforetycznych
�� rozdział elektroforetyczny
�� detekcja
Schemat urządzenia do elektroforezy bibułowej:
ELEKTROFOREZA BIBUA
OWA:
Przykrywa
�� Nośnik: bibuła chromatograficzna, octan celulozy
�� Technika kombinowana: elektrochromatografia
Linia startowa
(%)
(+)
Bibuła
ELEKTROFOREZA NA ŻELACH
Roztwory buforowe
Żele agarozowe do 2%
Żele poliakrylamidowe
- używane do cząstek większych
- używane do cząstek mniejszych
ELEKTROFOREZA NA ŻELACH AGAROZOWYCH:
�� Są to galaretki półprzezroczyste, kruche, nie są tak odporne jak żele poliakrylamidowe
�� Ich głównym składnikiem jest agaroza
�� Stosowana w biologii molekularnej do analizy kwasów nukleinowych
�� Immunoelektroforeza białek
�� Elektroforeza kwasów nukleinowych na żelach agarozowych:
o Elektroforeza DNA w żelu agarozowym jest standardową metodą pozwalającą na
rozdzielenie, identyfikacje lub oczyszczenie fragmentów DNA.
o Technika horyzontalna - rozdział według rozmiaru cząsteczek
o Żele agarozowe o różnym stężeniu stosuje się do rozdziału fragmentów DNA od 200 pz
do 50 000 pz
�� Detekcja kwasów nukleinowych w agarozie:
o Barwniki fluerescencyjne - np. lub bromek etydyny pozwalają na uwidocznienie
makrocząsteczek po zakończeniu elektroforezy lub wybarwienie przed separacją.
Znaczniki uwidaczniają położenie prążków w świetle UV lub widzialnym. Czułość detekcji
jest porównywalna z barwieniem srebrem lub jest nieco lepsza.
IMMUNOELEKTROFOREZA BIAA
EK NA ŻELACH AGAROZOWYCH:
Metody wykorzystujące swoiste reakcje Ag-Ig
�� Elektroforeza białek i immunodyfuzja Ig - linie precypitacyjne charakterystyczne dla reakcji Ag-
Ig
�� Immunoelektroforeza rakietowa - elektroforeza w agarozie z dodatkiem Ag
�� Immunoelektroforeza krzyżowa - kombinacja zwykłej elektroforezy na żelu agarozowym i
elektroforezy rakietowej
IMMUNOELEKTROFOREZA - zależy od specyficznych reakcji antygen-przeciwciało i służy do detekcji
rozdzielonych białek. Po niskonapięciowej elektroforezie próbek na żelu agarozowym wprowadza się
surowice odpornościowe, które dyfundują przez żel i tworzą widoczne osady z rozdzielonymi
antygenami.
Elektroforeza na ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM:
�� polimer akrylamidu i bisakrylamidu (czynnik sieciujący)
�� posiada wysoką zdolność rozdzielczą
�� odporny na działanie czynników chemicznych
�� przezroczysty, bezbarwny, sprężysty
�� zapewnia powtarzalność rozdziałów
�� Elektroforeza kwasów nukleinowych odbywa się zazwyczaj w układzie pionowym
Elektroforeza w żelach poliakrylamidowych stosowana w biologii molekularnej do analizy małych
cząsteczek kwasów nukleinowych.
Duże
cząsteczki
Małe
cząsteczki
Detekcja kwasów nukleinowych w żelach poliakrylamidowych:
�� Barwienie srebrem:
o Utrwalanie żelu
o Barwienie azotanem srebra
o Odbarwianie tła
ELEKTROFOREZA BIAA
EK W ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM:
�� Elektroforeza natywna -
o Metoda Ornstein a  Davis a
o ruchliwość elektroforetyczna jest uzależniona od ładunku i rozmiaru cząsteczki
o układ nieciągły, niedenaturujący
�� Elektroforeza w warunkach denaturujących (SDS, mocznik) + reduktor (�-merkaptoetanol, DTT)
o Rozdział na zasadzie sita molekularnego
o Metoda Laemmli ego: bufor elektrodowy: Tris-glicyna
o Metoda Shagerravona: bufor elektrodowy: Tris-tricyna
o Jest możliwe wyznaczanie masy cząsteczkowej białka:
odległość wędrówki białka
Rf =�
odległość wędrówki znacznika
Rf =� f (log M ) M - masa cząsteczkowa białka
Metody detekcji stosowane w żelowej elektroforezie:
�� Coomasie Brilliant Blue (0,1-1�g)
�� sole cynku (10-100 ng)
�� sole srebra (1-10 ng)
�� SYPRO orange (2-10 ng)
�� Selektywne wybarwianie enzymów (wizualizacja enzymów, które w wyniku katalizy produkują
barwny substrat)
�� barwniki fluorescencyjne (wymagają odpowiednich urządzeń - lamp)
Czynniki wpływające na szybkość migracji cząsteczek w żelu:
�� masa cząsteczki
�� koncentracja żelu / stopień usieciowania
�� napięcie / natężenie prądu
�� temperatura
�� siła jonowa buforu elektrodowego
�� pH buforu elektrodowego
IZOELEKTRYCZNE OGNISKOWANIE (IEF)
�� Rozdział przebiega w gradiencie pH wytworzonym przez amfolity (czyli mieszanina kwasów
wielokarboksylowych, które wędrują w polu elektrycznym i wytwarzaja pH w żelu)
�� Jeśli białko jest naładowane ujemnie to wędruje w kierunku katody, jeżeli dodatnio to w
kierunku anody, natomiast jeżeli nastąpi zrównoważenie ładunku białka (pH odpowiada pI) to
białko zatrzymuje się w miejscu
�� Metoda charakteryzuje się wysoką rozdzielczością
ELEKTROFOREZA 2D - dwuwymiarowa
�� Połączenie izoelektrycznego ogniskowania i elektroforezy SDS-PAGE
�� 1 kierunek: immobilizowany gradient pH, czyli ogniskowanie izoelektryczne które przeprowadza
się na specjalnych paskach, a następnie pasek nakłada na żel i prowadzi elektroforeze SDS-
PAGE w kierunku prostopadłym do IEF (2 kierunek)
�� dostajemy żel pełen plam obraz w postaci kropek
�� metoda ta służy do badań np. ekstraktów komórkowych, kiedy badamy wszystkie białka jakie
się w niej znajdują
�� np. może służyć do porównania między komórkami normalnymi, a nowotworowymi (widzimy
jakie białka występują w komórkach chorych a nie występują w zdrowych)
�� do klasyfikacji białek używamy najczęściej sekwencjonowania aminokwasów
WYKA
AD 15
BLOTTING
Elektrotransfer jest przenoszony na membrany:
�� nitrocelulozowe
�� nylonowe
�� PVDF
o transfer DNA
o transfer RNA
o transfer białek
Białka rozkładamy na żelu, przykładamy membranę i wszystko przechodzi na membranę, a żel
pozostaje czysty. Transfer jest kompletny jak żel będzie całkowicie czysty.
Po transferze następuje detekcja.
-� barwienie Coomasie Brillant Blue, Ponceau S
-� reakcje specyficzne ze znakowanymi enzymami przeciwciałami i przeprowadzenie reakcji
barwnej
-� reakcje z przeciwciałami znakowanymi izotopami  autoradiografia
-� hybrydyzacja kwasów nukleinowych /sondy-autoradiografia, fluorescencja/
Detekcja immunologiczna białek metodą Western Blot
Mieszanie białek, barwienie na membranie ą� powstają prążki ą� inkubacja z przeciwciałami ą�
przeciwciała przyłączają się do jednego, konkretnego białka ą� powinniśmy zobaczyć tylko jeden prążek
Metoda ta pozwala na identyfikację konkretnego białka.
Immunodetekcja białek  reakcje specyficzne z przeciwciałami
�� Immunoglobuliny znakowane enzymami [HRP,AP]  reakcja barwna
�� chemiluminiscencja, chemifluorescencja, bioluminescencja - przeciwciała znakowane są
enzymem, który przeprowadza taką reakcję w wydzieleniem światła
�� Immunoglobuliny znakowane izotopami  autoradiografia
�� Immunoglobuliny znakowane Au
Detekcja kwasów nukleinowych
-� hybrydyzacja  kwasy nukleinowe denaturuje się do postaci jednoniciowej, tworzą się krótkie
odcinki komplementarne do danej sekwencji. Odcinki komplementarne są ze znacznikiem 
może to być izotop, barwnik fluorescencyjny, biotyna.
-� detekcja  autoradiografia, fluorescencja, detekcja immunologiczna
ELEKTROFOREZA KAPILARNA
- w większości przypadków swobodna (nie zawsze)
Budowa:
-� z
ródło wysokiego napięcia (0-30kV)
-� dwa pojemniki z buforem
-� dwie elektrody
-� kapilara
-� system dozowania próbek
-� detektor  UV-Vis, fluorescencyjne, MS, elektrochemiczne, NMR
Kapilara  rurka krzemionkowa z otoczką poliamidową; średnica, od 20 do 100 mikrometrów, 50
mikrometrów  najbardziej popularna; długość  20-100 cm
Przepływ elektroosmotyczny
-ścianki  ładunek ujemny
- wnętrze  ściana ładunków dodatnich
Kiedy przykładamy napięcie następuje cały ruch cieczy wymuszony obecnością chmury kationów i
wszystkie jony płyną do katody. W detektorze pojawiają się najpierw kationy, potem jony neutralne a
na końcu aniony.
Wprowadzanie próbek
-� najczęściej nadciśnienie wpycha płyn do wnętrza
-� podciśnienie z 2 strony, które wciąga
-� różnica poziomów w naczynkach
-� wprowadzanie rurki za pomocą prądu  ryzyko, że nie wszystkie składniki przejdą do kapilary.
Optymalizacja metody rozdziału  Nieograniczone pole manewru, można wybierać różne metody i
parametry:
�� średnica wewnętrzna kapilary
�� długość kapilary
�� skład buforu
�� napięcie
�� temperatura
�� detekcja
Warianty elektroforezy kapilarnej:
�� kapilarna elektroforeza strefowa  szybkość migracji jonów to wypadkowa ich stosunku ładunku
do masy cząsteczek. Składniki poruszają się z różną prędkością pod wpływem przyłożonego
napięcia. Metoda ta pozwala na rozdzielenie substancji drobno i wielkocząsteczkowych.
�� izoelektryczne ogniskowanie  nakładamy próbkę, następuje zogniskowanie na całej długości
kapilary. Po zogniskowaniu wywiera się ciśnienie na kapilarę, aby prążki przemieścić do
detektora i umożliwić odczytanie. Składniki kapilary rozdzielane są w gradiencie pH
wytwarzanym we wnętrzu kapilary, poruszając się pod wpływem przyłożonego napięcia do
momentu osiągnięcia strefy pH odpowiadającej punktowi izoelektrycznemu danej substancji.
Rozdziela się związki o charakterze amfoterycznym.
�� żelowa elektroforeza kapilarna  można rozdzielać cząsteczki ze względu na ich różnicę
wielkości. Rozdział zachodzi w kapilarze wypełnionej żelem o odpowiedniej średnicy porów, w
której szybkość migracji makromolekuł zależy od wielkości ich cząsteczek. Możliwy jest rozdział
kwasów nukleinowych, oligonukleotydów, peptydów i białek.
�� izotachoforeza kapilarna  2 rodzaje elektrolitów: wiodący  jony bardzo szybko poruszając się i
opóz
niony: jony o niskiej ruchliwości. Próbkę wprowadza się pomiędzy dwa elektrolity. Po
przyłożeniu napięcia jony wędrują za buforem  wiodącym według malejącej ruchliwości.
Składniki próbki dzielą się na jony, które szybciej i wolnej się wydzielają. Kolejność wydzielania:
najpierw jony chlorkowe, potem białka i na końcu jony cynowe.
�� micelarna chromatografia elektrokinetyczna  do buforu dodajemy detergentu (surfaktant 
środek powierzchniowo czynny) w stężeniu, które przekracza krytyczne stężenie micelacji.
Tworzą się micele- hydrofilowe grupy układają się na zewnątrz miceli, hydrofobowe  wewnątrz.
Składniki próbki dzielą się ze względu na stopień hydrofobowości. Po przyłożeniu prądu
następuje przepływ elektroosmotyczny do ujemnej elektrody. Micele na zewnątrz mają ładunek
ujemny, części hydrofobowe z micelami będą opóz
nione w stosunku do cząsteczek
rozpuszczonych. Najwcześniej otrzymamy cząsteczki rozpuszczone i neutralne, a potem micele
 najdłuższy czas retencji mają te cząsteczki hydrofobowe przyłączone do miceli.
�� elektrochromatografia kapilarna  kolumna chromatograficzna kapilarna, wypełniona fazą
stacjonarną. Oddziałują części hydrofobowe. Przepływ jest wymuszony, przy użyciu prądu.
Zjonizowane części niehydrofobowe bardzo szybko przejdą przez kapilarę. W przypadku
analitów obdarzonych ładunkiem, wykorzystywana jest również ich ruchliwość w polu
elektrycznym.
Zastosowania
- analiza różnych jonów  aniony, kationy
- analiza leków
- analiza białek, węglowodanów, kwasy nukleinowe itp.