32

Krystyna Kozłowska

4. PROCES WZROSTU KOMÓREK I JEGO





MOLEKULARNE ASPEKTY


Proces, w którym zwiększa się masa i objętość organizmu nazywamy wzro-

stem.

Zjawisko wzrostu jest sumą dwóch procesów:

1. wzrostu pojedynczych komórek (powiększenie ich masy i objętości), 2. zwiększenia liczby komórek (podział).

Zwiększenie się masy i objętości żywego organizmu zachodzi zatem dzięki procesom wzrostu. Podkreślić należy, że zjawisko wzrostu dotyczy zarówno pojedynczej komórki jak i zespołu komórek czyli populacji.

Wzrost pojedynczej komórki należy rozumieć jako powiększenie się jej ma-sy, objętości. Wzrost zespołu komórek dokonuje się głównie dzięki zwiększeniu się ilości tych komórek na drodze podziałów mitotycznych. Nie wszystkie zespo-

ły komórkowe wykazują ten sam charakter wzrostu.

Grupy komórkowe, które wykazują ten sam charakter wzrostu (tj. podobne tempo i zdolność do podziału) określamy jako populacje komórkowe.

Rodzaje populacji komórkowych

U człowieka wyróżniamy następujące populacje:





1.


rozrastające się – powiększenie ilości komórek zachodzi dzięki dużej ilości mitoz, a wzrost ma charakter wykładniczy. Takie populacje komórkowe występują w warunkach prawidłowych, w okresie życia

embrionalnego. W zakresie tej populacji większość komórek jest niezróżnicowana. Z takim rodzajem populacji komórkowych spotykamy

się też w patologii, gdyż ten typ wzrostu charakterystyczny jest dla wczesnych etapów wzrostu nowotworów złośliwych.





2.


wzrastające – należą tu komórki, które dzielą się aby zapewnić wzrost tkanek. Komórki tej populacji dzielą się jako komórki w pełni zróżnicowane. Ten wzrost typowy jest zatem w okresie pozapłodowym, w okresie wzrostu całego organizmu. Podział komórek nastę-

puje dlatego, aby tkanka wzrastała. Wskaźnik mitotyczny na ogół ni-ski, zwiększa się gwałtownie pod wpływem stymulatorów. Do tej populacji należą m.in. komórki nadnerczy, nerki, ślinianek, tarczycy, trzustki.

Proces wzrostu komórek i jego molekularne aspekty

33





3.


odnawiające się – należy tu grupa komórek, które ulegają szybkiemu niszczeniu i aby ilość komórek wchodzących w skład tej populacji w danym narządzie była względnie stała, występują liczne mitozy.

W tej populacji duża utrata komórek równoważona jest ich dużym

przyrostem. Dla przykładu: erytrocyty są to komórki szybko rozpadające się, ale jednocześnie ilość komórek wkraczających na drogę erytropoezy równoważy ich ubytek; innym przykładem jest naskórek, gdzie złuszczające się komórki są zastępowane przez intensywnie

dzielące się komórki warstwy rozrodczej; podobnie jest w przypadku komórek gruczołów śluzowych czy plemników.





4.


statyczne - to grupy komórek, w których nie stwierdza się żadnej aktywności mitotycznej. Komórki tej populacji charakteryzują się tym, że w ciągu życia osobniczego równolegle ze wzrostem organizmu

powiększają tylko swą objętość, proporcjonalnie do całkowitej masy ciała, do tej populacji należy np. znakomita większość neurocytów i komórki siatkówki.





Charakter wzrostu populacji


Jeżeli rozpatruje się wzrost komórek w obrębie określonej populacji to moż-

na zauważyć występowanie pewnych faz. Jeśli na populację zadziałał czynnik pobudzający to w pierwszej fazie (stosunkowo krótkiej) nie zauważamy zmian, jest to faza zastoju; zaraz po niej występuje następna faza wzrostu wy-kładniczego, trwa ona przez pewien czas po czym następuje spadek szybkości wzrostu populacji i przejście do fazy stacjonarnej, w której wzrost nie następuje.





lg N

1. Faza zastoju

2. Faza wzrostu

wykładniczego

3. Faza stacjonarna

1

2

3

czas



Ryc. 28. Krzywa wzrostu populacji komórek.





34

Krystyna Kozłowska

Taki charakter wzrostu gdzie wzrost wykładniczy trwa tylko przez pewien okres życia populacji (różny – zależnie od rodzaju populacji) uniemożliwia powstanie bardzo wielkiej liczby komórek. Tak więc taki charakter wzrostu ograni-cza nadmierny rozmiar wzrostu w obrębie populacji.

Jednakże przyczyny dla których populacje komórkowe zachowują się w taki właśnie sposób nie są dokładnie poznane.

Jeżeli przyjąć, że wzrost populacji komórkowych przynajmniej w pewnej fazie ma charakter wykładniczy to można scharakteryzować go krzywą.





lg N





czas





Ryc. 29. Przyrost liczby komórek w zależności od czasu





Wzrost zsynchronizowany


Chociaż jak zauważono, populacja podwaja się wraz z upływem czasu jednak zjawisko to nie dotyczy wszystkich komórek populacji. Nie wszystkie ko-mórki dzielą się równocześnie i tą sama ilość razy. Różne komórki populacji dzielą się przypadkową ilość razy. Jeżeli nawet spowodujemy doświadczalnie zahamowanie wzrostu komórek populacji, a potem usuniemy czynniki hamujące wzrost to tylko przez krótki okres czasu wzrost jest zsynchronizowany (podział

następuje jednocześnie w całej populacji), a wkrótce długość okresu między podziałami poszczególnych komórek staje się coraz bardziej przypadkowa.

Wynika to z tego, że w prawidłowych warunkach życia organizmu wzrost populacji ma charakter niezsynchronizowany.

Zauważono, że w każdej populacji istnieją dwa rodzaje komórek:

a) komórki dzielące się;

b) komórki odpoczywające.

Stosunek ilościowy jednego rodzaju komórek do drugiego, będzie określał

rzeczywistą intensywność wzrostu komórek.

Proces wzrostu komórek i jego molekularne aspekty

35

Dlaczego tak jest, jeszcze nie wiemy. Prawdopodobnie zależy to od całego zespołu czynników regulujących wzrost. Za nim jednak zatrzymamy się nad tym zagadnieniem należy zwrócić uwagę na cykl życiowy komórki.

Cykl komórkowy

Wraz z podziałem komórki macierzystej na dwie komórki potomne kończy się istnienie tej komórki. Dlatego czas upływający między jednym a drugim podziałem wyznacza okres życia komórki.

Okres ten nazywamy cyklem komórkowym.

Cykl komórkowy składa się ze ściśle określonych etapów – faz. Cykl jest okresem specyficznym dla populacji komórkowej (a także dla danej komórki w danej populacji), i czas trwania jego jest różny. Przede wszystkim różna jest faza G1, różnić ona się może nawet dla komórek w obrębie tej samej populacji (waha się od kilku godzin do kilkunastu dni), z tego też m.in. względu wzrost samej populacji nie jest zsynchronizowany.

M

G1 faza





G


podział

F

2

presyntetyczna

G

A

1

Z

4 godz.

S faza syntezy

Y

10 godz.

Cykl





DNA


komórkowy

C

G2 faza

Y

postsyntetyczna

K

9 godz.

L





S


M podział





U


Bardzo wydłużona faza G1 określana jest jako faza G0.

Wspomniane już �śodpoczywające” komórki populacji znajdują się w fazie G0.

Faza S, trwa w komórkach ssaków przeciętnie dziewięć godzin. Faza G2 trwa około czterech godzin. Zauważyć należy, że o ile wzrost całej populacji komórkowej odbywa się głównie dzięki podziałom komórkowym, czyli dzięki powtó-

rzeniom cykli komórkowych to wzrost poszczególnej komórki odbywa się głównie w fazie G1 lub G0. Intensywność wzrostu populacji może się odbywać dzięki skróceniu czasu cyklu komórkowego albo dzięki zwiększeniu się ilości komórek dzielących się. W okresie zarodkowym komórki rosną szybko ponieważ mają



36

Krystyna Kozłowska

cykl komórkowy krótki (około 10 godzin) a także dlatego, że ilość komórek dzielących się jest duża. W organizmach dojrzałych w komórkach zróżnicowanych, cykl komórkowy jest dłuższy i jak wspomniano dla poszczególnych populacji ma wartości stałe. Jeżeli intensywność wzrostu zwiększa się to jedynie dlatego, że zwiększa się ilość komórek dzielących się.

Jeszcze na początku ubiegłego stulecia uważano, że komórki w hodowlach tkankowych mogą dzielić się i odnawiać bez końca. Z biegiem czasu badacze musieli wycofać się z tego poglądu.

Obliczono, że zależnie od typu hodowli po maksymalnie 90 podziałach ko-mórka przestawała dzielić się i rosnąć. Wyciągnięto stąd wniosek, że w genotypie każdej komórki zakodowana jest informacja ile razy komórka może się dzielić. Dopiero mutacje nowotworowe (co związane jest ze zmianą zapisu w genotypie) mogły przesunąć granice życia komórki do 150 – 200 podziałów.

Do tej pory mechanizm tego zjawiska nie jest znany, wysuwa się różne po-glądy mające na celu wyjaśnienie tej sprawy. Badacze uważają, że w komórkach hodowli tkankowych proporcjonalnie do ilości podziałów zwiększa się ilość błędów w DNA, w wyniku czego wzrasta też ilość zmutowanych białek. Koniec podziałów to �śkatastrofa błędów”.





Regulacja wzrostu


Czynnik




wzrostowy

I.

Połączenie się czynnika



wzrostowego z częścią



wiążącą receptora (1)

Receptor





1


wywołuje zmiany kon-



dla czynnika

formacyjne i powoduje:

wzrostu

II.

aktywację części recep-



tora o aktywności kinazy

(2)



III.

aktywację mediatorów





2


inicjujących fazę S



IV. podział komórki





enzym kinaza: tyrozyny, treoniny, seryny

kinazy – enzymy fosforylujące (PO 3-

3 ) substraty



Onkogeny – geny kodujące informacje o procesach wzrostu i różnicowania się. Onkogeny kodują informację o części receptorów dla czynników wzrostu

Proces wzrostu komórek i jego molekularne aspekty

37

(tj. tej części, która wykazuje aktywność enzymatyczną kinaz: tyrozyny, treoniny, seryny). W czasie embriogenezy ekspresja onkogenów wzrasta.

Powierzchnia komórki a proces wzrostu

O tym, że powierzchnia komórek reguluje proces wzrostu świadczą nastę-

pujące zjawiska:

1. zjawisko inhibicji kontaktowej;

2. zmiany jakościowe i ilościowe w glikokaliksie w czasie podziału; 3. mitogeny, lektyny.

Ad. 1. Zjawisko to obserwowane w hodowlach tkankowych polega na tym, że gdy komórki mnożące się pokryją całą powierzchnię hodowlaną i zaczną się układać na powierzchni komórek poprzedniej warstwy – podział ich ustaje.

Kontakt powierzchni jednej komórki z powierzchnią innej hamuje ich proliferację. Zjawisko to występuje wyłącznie w hodowlach komórek prawidłowych.

W hodowlach komórek nowotworowych, których powierzchnia jest zmie-niona zjawisko inhibicji kontaktowej nie występuje.

Ad. 2. W poszczególnych fazach podziału komórkowego występują zmiany w kompleksach cukrowcowo-białkowych budujących powierzchnię komórkową.

Ad. 3. Na powierzchni komórek znajdują się receptory dla substancji, które po związaniu się z tymi receptorami mogą wywołać podziały komórek, takie substancje nazywamy mitogenami.

Na powierzchni komórek znajdują się molekuły adhezji z grupy lektyn, które często są mitogenami. Na powierzchni komórek są również receptory dla lektyn, które wiążąc się z lektynami z innych komórek lub lektynami pochodzącymi z otoczenia komórek (podane z zewnątrz) mają wywołać ich proliferację.





CZYNN

CZY IK

NNII WZ

KI

R

WZO

RST

O U

STU





komórka prawidłowa

komórka nowotworowa



Ryc. 30. Porównanie regulacji wzrostu w komórce prawidłowej i nowotworowej.



38

Krystyna Kozłowska

Komórki prawidłowe wiążą czynniki wzrostu produkowane przez inne ko-mórki; komórki nowotworowe produkują czynniki wzrostu same dla siebie.

Tworząc taki �śsamonapędzający się” system – rosną m. in. dlatego szybciej.

Niektóre aspekty molekularnej regulacji wzrostu

W rozwoju ewolucyjnym organizmy wyższe wykształciły wielopoziomowy system zabezpieczeń przed niekontrolowanym wzrostem. W systemie tym dzia-

łają:

1. geny supresorowe i ich produkty,

2. specyficzne białka – cykliny,

3. specyficzne białka enzymatyczne – kinazy serynowo - treoninowe zależ-

ne od cyklin ( cyclin dependent kinases) cdk,

4. inhibitory tych kinaz.

Gen supresorowy wg definicji Weinberga (1991) to taki gen, którego utrata lub zmutowanie, powoduje różnorodne zaburzenia wzrostu komórek. Genów supresorowych, zwanych też antyonkogenami znamy wiele.

Produkty tych genów lokalizują się w różnych miejscach w komórce i pełnią różną funkcję, ale przede wszystkim zabezpieczają komórki przed niekontrolowaną proliferacją.

Gdy geny supresorowe ulegają mutacjom, może dojść do rozwoju nowotworów.





Kinazy cdk i cykliny




cdk m. cz. (kDa) Cykliny

Inhibitor kinazy Aktywność w fazie cyklu

1

34

A,B

białko p21

S, G2/M

2

33

A, D1, D3, E

białko p21

G1, G1/S, S

3

36

?

?

G1

4

34

D1

białko p21

G1

5

35

D1

?

G1

6

40

D1

?

G1

7

42

H

?

?



Proces wzrostu komórek i jego molekularne aspekty

39

Występowanie i właściwości wybranych białek kodowanych przez geny supresorowe człowieka





Produkt genu


Działanie





Brak lub


Chromosom Gen i występowanie

produktu genu





inaktywacja


w komórce

- czynnik transkrypcyjny Blok proliferacyjny

dla genów hamujących usunięty

wzrost komórek

komórki �ął z G

- indukuje ekspresję

1 �ął

białka p21 - inhibitora

podział �ął wzrost

17 p53 Białko 53 kDa,

Brak w większości

jądro komórkowe

kinaz cdk

- �śstrażnik genomu” -

ludzkich nowotwo-

gdy jest uszkodzenie

rów; w 50% nowo-

DNA – nie następuje

tworów ludzkich

replikacja

mutacje genu p53

po ufosforylowaniu

wiąże się z czynnikami

proliferacja, mutacja

transkrypcyjnymi, ha-

tego genu brak pro-

13 Rb-1

Białko 110 kDa,

mując transkrypcję

duktu stwierdzany w:

jądro komórkowe pewnych genów, komór- siatkówczaku, mię-

ka nie może przejść z G

saku kostnym, raku

1

�ął

sutka

S

brak produktu

Białko 66 kDa,

udział w wiązaniu re-

stwierdzany w: opo-

22 NF-2

błona komórkowa ceptorów błonowych

niakach, osłoniakach

adhezji z cytoszkieletem nerwowych



Cykliny – białka; znamy kilka klas A, B, D, E, H; ich zawartość w czasie cyklu komórkowego – zmienia się; syntetyzowane są i rozkładane cyklicznie; w G1, S aż do metafazy ich poziom rośnie, w anafazie są gwałtownie degradowane.

Cykliny tworzą kompleksy z cdk, co sprawia, że enzymy te są cyklicznie ak-tywowane; rozpad kompleksu – inaktywacja cdk.



Kinazy cdk – białka, m. cz. 32 – 42 kDa, znamy 7 klas: 1, 2, 3......

kinaza 1 – cyklina A, B

kinaza 2 – cyklina A, D

kinaza 3 – ?

kinaza 4, 5, 6 – cyklina D

kinaza 7 – cyklina H



40

Krystyna Kozłowska



P





C





Y


cdk2




2





K





L





I




B

B





N





A


Ryc. 31. Biologiczna rola kompleksu: kinaza cdk – cyklina.



Kompleks ten fosforyluje histon H1 dzięki czemu:

1. tworzą się chromosomy,

2. rozpada się otoczka jądrowa,

3. następuje fosforylacja tubuliny – tworzy się wrzeciono kariokinetyczne.

Zdolność fosforylacji H1 jest miarą aktywności enzymatycznej cdk-1; na przełomie meta- i anafazy cyklinę opłaszcza ubikwityna, taka cyklina niezwykle łatwo ulega proteolizie.

Aktualnie podkreśla się, że takie dwuskładnikowe kompleksy występują w komórkach przede wszystkim nowotworowych natomiast w komórkach prawidłowych występują kompleksy czteroskładnikowe.

Kompleks cykliny B i kinazy cdk2 w jajniku działa jako tzw. MPF (matura-tion promoting factor) i powoduje, że owocyt I rz. �ął owocyt II rz.





syntetyzuje





P


Cyklina B


Cyklina B

się





P


Cyklina B




Cyklina B

rozpada się

Cyklina B

Cyklina B rozpada się





cdk2

cdk2

cdk2

cdk2

cdk2





aktywny MPF nieaktywny MPF początek aktywny nieaktywny aktywacji





M

G

S

G

M

G

1

2

1



Ryc. 32. Kontrola cyklu komórkowego w oogenezie przy udziale MPF.



Inhibitory kinaz – znamy 2 rodziny:

a. białka p16, 18, 19

są to białka antyproliferacyjne

b. białka p21, 27, 57

Proces różnicowania

41

5. PROCES RÓŻNICOWANIA





Jednym z podstawowych problemów biologii rozwoju jest wyjaśnienie mechanizmów, które powodują, że z pojedynczej komórki – zygoty, powstaje skomplikowany organizm, złożony z wyspecjalizowanych komórek, tkanek, narządów, funkcjonujących według odziedziczonego planu.

Zapłodniona komórka jajowa (zygota) jest totipotencjalna co oznacza, że w ramach określonego gatunku – ma nieograniczone możliwości rozwoju – da-jąc początek wszystkim komórkom organizmu, a przecież każda komórka o czym pierwszy wspomniał Virchow, rozwija się przez podział tej pierwszej.

Dopiero w trakcie kolejnych podziałów wyodrębniają się grupy komórek, z których powstają listki zarodkowe, narządy pierwotne a potem w procesie hi-stogenezy tkanki o specyficznych właściwościach (nabłonkowa, łączne, mię-

śniowe, nerwowa), a z tych w organogenezie różnicują się narządy i układy.

Zjawisko powyższe nosi nazwę różnicowania.

Przebiega ono na różnych poziomach organizacyjnych i dotyczy:

1. różnicowania morfologicznego – zmiany kształtu komórki, 2. różnicowania biochemicznego – zmiany ciągu przemian metabolicz-nych,

3. różnicowania czynnościowego – zmiany funkcji.

Etapy różnicowania

Zespół procesów prowadzących do powstania wyraźnie odmiennych części organizmu nazywamy morfogenezą. Proces ten obejmuje dwa odmienne etapy: a) różnicowanie komórkowe – kiedy to z prostej, prekursorowej komórki rozwija się różny rodzaj komórek bez zmian ilościowych w genomie; rozpoczyna się ten etap w okresie gastrulacji i trwa nadal w procesie różnicowania tkanek i narządów;

b) organizacja tkankowa – polega na zespoleniu różnych typów komórek w celu wytworzenia tkanek (histogeneza) i narządów (organogeneza).

Proces różnicowania zachodzi już w czasie bruzdkowania:





syncytiotrofoblast





trofoblast

blastocysta



cytotrofoblast





embrioblast

W drugim tygodniu rozwoju, proces różnicowania jest już bardzo ewidentny.

42

Krystyna Kozłowska

W warunkach prawidłowych proces ten przebiega z zachowaniem dwóch zasad – kanonów różnicowania.

1. Proces różnicowania przebiega bez utraty DNA (komórka różnicująca się nie traci informacji genetycznej) a w nielicznych przypadkach ilość DNA może się zwiększyć (u zwierząt niższych występują dodatkowe

cykle replikacyjne i amplifikacja DNA), ale o tym wiemy dopiero od lat 50-tych XX wieku. Pierwszy znaczący badacz tego procesu Weismann twierdził, np. że różnicowanie to stała utrata genów, która rozpoczyna się wraz z pierwszym podziałem gdzie jedna komórka potomna zawiera informacje dla prawej części a druga dla lewej części ciała.

Zróżnicowanie komórek nie wynika zatem ze zmian w zawartości materiału genetycznego tylko z selektywnej (wybiórczej) ekspresji genów. Stwierdzono przy tym, że 80% genów jest represorowana, a tylko 20% ulega ekspresji w trakcie różnicowania.

W każdym typie komórek ekspresji ulega oczywiście inna część genomu.

2. W warunkach prawidłowych proces różnicowania jest procesem nieod-wracalnym, co oznacza, że z komórki niezróżnicowanej powstaje ko-mórka zróżnicowana a nigdy odwrotnie! np. z komórek mezodermy powstaną komórki tłuszczowe, komórki kości ale komórki tłuszczowe nigdy nie przekształcą się w komórki mezodermy.

Tylko z komórki o prostej strukturze i nieokreślonej funkcji może powstać

komórka o złożonej strukturze morfologicznej i biochemicznej oraz wyspecjali-





zowanej funkcji.


Samorzutnie zachodzący proces odwrotny – proces odróżnicowania obser-wowany jest w stanach chorobowych i jest patologią.

Jednakże wykonane w ostatnich latach eksperymenty dotyczące klonowania zwierząt wydają się podważać ten dogmat – okazuje się, że jądro komórkowe i genom komórek zróżnicowanych wykazują taką plastyczność, iż w momencie kiedy dopasujemy cykle komórkowe można otrzymać i z komórek zróżnicowanych – totipotencjalne zarodki.

Zatem, według aktualnego stanu wiedzy ostrożnie należy przyjmować, że zróżnicowanie komórek nie jest do końca nieodwracalne; genom zróżnicowanej komórki można przeprogramować tak, że może on znowu odzyskać totipotencję ale nie dzieje się to spontanicznie, bez szeregu zaprogramowanych laboratoryjnie reakcji induktorowych.

Komórka musi być w fazie cyklu G1 lub G0 – gdyż przy klonowaniu można było tylko wtedy przeprogramować genom tak, by zróżnicowanym komórkom przywrócić totipotencję.

Proces różnicowania

43

Na tych obserwacjach opierają się także nadzieje, że komórki macierzyste będzie można przekształcić w dowolne tkanki i narządy.

Skąd komórka �świe” jaką część genomu uruchamiać, aby w procesie różnicowania powstały określone substancje, funkcje charakterystyczne dla danej komórki – jak dotąd – jest tajemnicą!

Przypuszcza się, że te ulegające ekspresji geny (20%) to onkogeny; dowo-dem na to są obserwacje, iż w embriogenezie wybitnie zwiększa się – ekspresja onkogenów; w życiu pozapłodowym obserwuje się także wzrost ekspresji onkogenów np. w różnicujących się komórkach krwi.

Różnicowanie a cykl komórkowy

Z macierzystej komórki niezróżnicowanej, w kolejnym podziale może powstać przynajmniej jedna lub dwie zróżnicowane komórki potomne. Widać więc, że proces różnicowania jest w jakiś sposób związany z podziałem komó-

rek.

Wielu badaczy stawia sobie pytanie jaka jest rola cyklu komórkowego w ini-cjowaniu genetycznych decyzji, które zmienią niezróżnicowaną jeszcze generację komórek prekursorowych w późniejsze bardziej dojrzałe generacje.

Cykle komórkowe mają dwojaką rolę:

a) mogą przyczyniać się do tego, aby powstały dwie potomne komórki z tymi samymi szlakami syntetycznymi jak komórka macierzysta lub b) mogą przyczyniać się do powstania jednej lub dwu komórek ze szlakami syntetycznymi bardzo różniącymi się od tych, które są aktywne w ko-mórkach macierzystych.

Wynika z tego, że istnieją dwa rodzaje cykli komórkowych:

a) cykle, w wyniku których przynajmniej jedna komórka potomna różni się od komórki macierzystej; w tego typu komórkach odbywa się jak gdyby przeniesienie komórek z jednego przedziału do drugiego

b) cykle, w których komórki potomne są takie jak macierzyste; ten rodzaj cykli odpowiedzialny jest jedynie za wzrost liczby podobnych komórek.





komórka

niezróżnicowana



komórka

komórki



macierzysta

potomne

komórka



zróżnicowana



Ryc. 33. Związek procesu różnicowania z podziałem komórek.



44

Krystyna Kozłowska

W zygocie geny są jeszcze nieczynne transkrypcyjnie, a synteza białek odbywa się na matrycy m-RNA zsyntetyzowanych w organizmie matki.

Wśród białek zdeponowanych w zygocie, znajdują się induktory lub represo-ry, które będą uruchamiać aktywność własnych genów lub geny supresjonować (hamować ich aktywność). Poszczególne geny są włączane w różnych stadiach rozwoju, w zależności od rodzaju tkanki.

U człowieka, już w stadium 2 blastomerów rozpoczyna się transkrypcja własnych genów zarodka ale aż do 8 blastomerów w każdym blastomerze są tran-skrybowane takie same geny, bo jeśli się blastomery rozdzieli – to z każdego rozwinąć się może normalny zarodek.

W stadium 8 komórek – zarodek jest już zróżnicowany, po ich podziale powstają dwie grupy komórek: komórki graniczące ze środowiskiem – tworzą stro-nę zewnętrzną, komórki kontaktujące się z innymi blastomerami – utworzą stro-nę wewnętrzną.

Już w tym stadium kontakt wzajemny komórek między sobą wynikający z pojawienia się na ich powierzchni – antygenów różnicowania (CD), które są molekułami adhezji jest elementem indukującym ekspresję genów.

Stwierdzono, że u ssaków kontakt między blastomerami decyduje o powsta-niu różnic między komórkami, a ich wzajemne oddziaływanie ukierunkuje ich determinowany genetycznie, dalszy rozwój w kierunku: trofoblastu lub embrio-blastu.



Molekuły adhezji

45

6. MOLEKUŁY ADHEZJI





Chemicznie substancje te należą do grupy glikoprotein.

Zlokalizowane są dwojako:

1. wbudowane w płaszczyznę błony plazmatycznej są – receptorami; 2. znajdujące się w przestrzeni m/komórkowej – pełnią rolę – ligandów.

ad. 1. znamy 4 grupy:

1. integryny (1982),

2. selektyny (1982),

3. kadheryny (1981),,

4. lektyny (1986).

ad. 2.:

1. fibronektyna,

2. witronektyna,

3. trombospondyna,

4. laminina,

5. kolageny.

Połączenie molekuły adhezyjnej będącej receptorem błonowym z molekułą adhezji obecną w przestrzeni międzykomórkowej, czyli ligandem spowoduje: 1. silne powiązanie z podłożem:





błona



plazmatyczna



receptor

błonowy





Ryc. 34. Połączenie molekuły błonowej z podłożem.





46

Krystyna Kozłowska

2. w trakcie tworzenia narządów i tkanek zmiany kształtu komórek – połą-

czenie z cytoszkieletem:





środowisko

np. fibronektyna



zewnętrzne



- b

łona komórkowa

β

�ą



wnętrze

integryna



komórki

talina

winkulina

elementy

�ą-aktynina

tworzące -

aktyna



cytoszkielet

mikrotubule





Ryc. 35. Połączenie między integryną a elementami cytoszkieletu.



Kadheryny i integryny uczestniczą w ruchach morfogenetycznych, ale do te-go w przestrzeni międzykomórkowej niezbędna też jest fibronektyna, witronektyna, laminina.

3. przekazywanie sygnałów do komórek wywołując ich wzrost i różnicowanie:



Aktywacja



enzymów

SYGNAŁ





cytoplazma





regulacja ekspresji genów

integryna





regulacja kontroli



wzrostu

�ą

β





błona



plazmatyczna

ligand





Ryc. 36. Udział molekuł adhezji w przekazywaniu sygnałów.



Molekuły adhezji

47

4. tworząc połączenia między elementami substancji międzykomórkowej i elementami cytoszkieletu warunkują w komórkach prawidłowych

utrzymywanie stałego ich kształtu, jak również tworzą odpowiednio silne związki z podłożem, uniemożliwiając komórkom dowolny, przy-

padkowy ruch.

W życiu zarodkowym bardzo ważna rolę, w wielu przypadkach udowodnioną, pełnią kadheryny (znamy już ich ponad 20).

Już w stadium 8 – 16 blastomerów pojawiająca się na ich powierzchni E-kadheryna powoduje ciasne przyleganie ich do siebie, co umożliwia ułożenie się komórek na obwodzie, utworzenie w środku wolnej przestrzeni (jamy) i powstanie blastocysty.

Na powierzchni ludzkich zarodków przedimplantacyjnych pojawiają się oprócz E-kadheryny także integryny i selektyny.



Pojawienie się: N-kadheryny

F-kadheryny warunkuje różnicowanie komórek w kierunku neuroektodermy C-kadheryny warunkuje wydłużanie się tkanek i narządów – np.

tworzenie naczyń, kanalików



W komórkach młodego organizmu albo w populacjach komórek różnicują-

cych się (np. kom. krwi – leukocytach), ważną rolę w procesie różnicowania pełnią integryny, które nazywamy antygenami różnicowania ( cluster and differentiation) CD.

Również lektyny, najsłabiej poznane molekuły adhezji, o których wiadomo, że są bardzo liczne zarówno w błonach jak i substancji m/komórkowej – uważa się, że pełnią rolę w adhezji.

Lektyny mogą się wiązać z inną lektyną i tworzyć powiązanie lektyna – lektyna lub też swoim obszarem wiążącym CRD (carbohydrate recognition domain

– obszar wiążący węglowodany) łączyć się z mannozą, która jest składową glikoprotein obecnych w glikokaliksie wszystkich komórek.





CRD





Ryc. 37. Schemat struktury lektyn i rozmieszczenie w nich grup CRD.



48

Krystyna Kozłowska

Transdyferencjacja – proces przeróżnicowania się komórek zachodzi w embriogenezie, polega na przemianie fenotypu nabłonkowego na fibrobla-styczny i wymaga połączenia się odpowiednich integryn z kolagenem typu I.

Proces ten odgrywa wielką rolę w embriogenezie twarzy.

Piętnowanie genomowe – imprinting genomu

Obecnie wiadomo, że rozwój i różnicowanie ssaków wymaga obecności genomu matki i ojca. Przez 100 lat dominowała idea Mendla stwierdzająca, że gamety żeńska i męska są równoważne. Jednakże w latach 80-tych XX wieku stało się jasne, że znaczenie ma fakt, czy gen jest odziedziczony od matki czy ojca.



usuwano przedjądrze męskie



2 żeńskie – nie rozwijał się trofoblast

wprowadzano przedjądrze żeńskie



gdy były dwa przedjądrza męskie – nie rozwijał się embrioblast.

Wynika z tego, że genomy rodzicielskie nie są równowartościowe – są jakoś naznaczone – zjawisko, w którym rodzic wyciska na genie własne, stosowne do płci piętno, nazywamy genowym piętnowaniem – imprinting genomu.

Do prawidłowego rozwoju organizmu czasami konieczna jest wybiórcza ekspresja tylko jednego z alleli – ojcowskiego lub matczynego. Piętno genomowe polega na metylacji allelu, który nie będzie ulegać ekspresji.

Brak w rozwoju prawidłowego skomponowania genów o imprintingu matczynym i ojcowskim powoduje śmierć zarodka. Imprinting genomu zachodzi podczas gametogenezy. Modyfikacje DNA komórek płciowych danego osobnika są zachowane w gametach i zygocie.

Wymazywanie imprintingu następuje dopiero podczas tworzenia komórek płciowych potomstwa; ich komórki płciowe uzyskują imprint typowy dla danego osobnika.



Wybrane przykłady ekspresji genów ojcowskich i matczynych

Efekt Piętno ojcowskie

Piętno matczyne

1. Komórki macierzyste

Proliferują Różnicują się

2. Ogólny wzrost organizmu

Stymuluje Redukuje

3. Aktywność mózgu

Podwzgórze Nowa

kora

4. Ogólna reakcja

Hiperkineza Hipokineza





Molekuły adhezji

49

Obecnie pogląd jest taki, że chociaż w genomie różne geny współpracują ze sobą to również ze sobą konkurują.

Mówi się, że geny są samolubne. Geny z piętnowaniem ojcowskim wydają się inicjować mechanizmy korzystne dla genów z piętnowaniem ojcowskim a matczyne dla genów z piętnowaniem matczynym. Rodzaj wielu embriopatii zależy od tego, czy mutacja występuje w obrębie genu ojcowskiego, czy matczynego.

Geny różnicowania

Od 1991 roku stosunkowo dużo wiemy o genach różnicowania, ale u robaków i owadów.

1. geny polarności – wyznaczają przedni i tylny biegun ciała;

2. geny segmentacji – wyznaczają poszczególne odcinki ciała (głowa, od-włok itp.);

3. geny wyposażające każdą komórkę w zestaw informacji określających lokalizację komórki wewnątrz zarodka.

U człowieka takich genów jeszcze nie wykryto, ale postuluje się, że podobną funkcję pełnią geny HOX.

Geny homeotyczne – homeotic genes – geny HOX

Geny homeotyczne – posiadają obszar wysoce konserwatywny ewolucyjnie (podobny u różnych gatunków) zwany homeoboxem; składa się on ze 183 nu-kleotydów kodujących informacje o 61 aminokwasowym polipeptydzie. Ten polipeptyd, czyli produkt homeoboxu posiada tzw. homeodomeny – obszary, które wiążą się z DNA (czasem nawet wewnątrz własnego genu) i wobec tego działają jako czynniki transkrypcyjne. A wiadomo, że do procesu różnicowania niezbędne są czynniki transkrypcyjne, wchodzą one bowiem w skład kompleksu transkrypcyjnego, który aktywuje enzym prowadzący proces transkrypcji.



transkrypcja

gen

mRNA





białko

homeobox



DNA



nowe cechy





różnicowanie

homeodomena - obszar wiążący się z DNA



Ryc. 38. Schemat ilustrujący udział genu HOX w różnicowaniu.





50

Krystyna Kozłowska

Oprócz homeodomen, u człowieka poznano wiele innych czynników tran-skrypcyjnych; najlepiej poznany jest palec cynkowy, bardzo dobrze dostosowany do rozpoznania DNA.



DNA





A





wiązanie się



z DNA



Cys

His



struktura palca

B

cynkowego



His

Cys





Ryc. 39. Dopasowanie palca cynkowego do spirali DNA.



U człowieka poznano 38 genów z homeoboxami; geny poznane dotychczas zlokalizowane są na 4 różnych chromosomach, poszczególne geny oznacza się cyframi:



Hox A (Hox 1) – chromosom 7



np.: A1



Hox B (Hox 2) – �ś 17

B5



Hox C (Hox 3) – �ś 12

C9

Hox D (Hox 4) – �ś 2

D13

Ostatnie odkrycia biologii molekularnej wskazują, że geny homeotyczne są ułożone wzdłuż chromosomów w takim porządku, który odpowiada topografii ich ekspresji w ciele. Są to jednak obserwacje dotyczące zwierząt. U człowieka wiadomo, że ekspresja genów Hox pojawia się w czasie rozwoju narządów osiowych (kręgosłup, cewa nerwowa) – można zatem podejrzewać, że są to geny polarności ale jasnej odpowiedzi jeszcze nie ma ze względu na moralne i prawne ograniczenia prowadzenia badań na człowieku.

W procesie różnicowania jak już wspomniano, dużą rolę odgrywają antygeny znajdujące się na powierzchni zwane antygenami różnicowania CD ( cluster and differentiation), niektóre z nich są jednocześnie molekułami adhezji i choć ich rola na komórkach zarodka nie jest w pełni poznana to wiadomo, że biorą udział w procesie różnicowania.

Śmierć komórki

51

7. ŚMIERĆ KOMÓRKI





Komórki w organizmie giną w wyniku:

1. działania czynników szkodliwych – �św wypadku” - taka śmierć zachodzi na skutek martwicy – nekrozy ( gr. necrosis – obumieranie); 2. naturalnej śmierci – gdy: �śdożywają dni swoich” – taki rodzaj śmierci zachodzi na drodze apoptozy czyli śmierci zaprogramowanej, samobójczej ( apoptosis – więdnięcie, opadanie płatków, liści).

To, że obumieranie komórek nie zawsze jest zjawiskiem szkodliwym a nawet może być istotne dla prawidłowego rozwoju i funkcjonowania organizmu – najwcześniej zorientowali się embriolodzy, bo już w pierwszej połowie XX wieku zauważyli np. u ssaków, że w czasie formowania się kończyn, aby powstały smukłe palce – muszą zginąć bez szkody dla rozwoju organizmu, ko-mórki w przestrzeniach międzypalcowych.

Jednakże dopiero w 1972 roku z ogłoszonych badań wynikało, że nie tylko podczas rozwoju, ale i w dojrzałym organizmie komórki giną, aby mógł on prawidłowo funkcjonować.

Apoptoza jest wykorzystywana przez organizm do kontrolowanej eliminacji komórek na różnych etapach rozwoju osobniczego, stanowi to podstawę morfo-genezy umożliwiając zanik bezużytecznych komórek i kształtowanie się np. ręki, powstawanie światła w różnych odcinkach przewodu pokarmowego czy też światła w przewodzie słuchowym.

Apoptoza pełni kluczowa rolę w rozwoju układu nerwowego eliminując około 85% komórek nerwowych, które w rozwoju nie utworzyły połączeń z innymi komórkami.

Apoptozie w rozwoju układu immunologicznego ulega także około 95% tymocytów w czasie różnicowania się limfocytów T.

U zwierząt niższych apoptoza jest kluczowym elementem metamorfozy –

przekształcenia larwy w owada, kijanki w żabę.

Po zakończeniu procesów rozwojowych apoptoza również pełni rolę umoż-

liwiającą wymianę komórek we wszystkich tkankach. Apoptoza jest odpowie-dzialna np. za hormonalnie uwarunkowane zmiany w cyklicznym obumieraniu komórek błony śluzowej macicy, za zanik grasicy, prostaty. Codziennie ginie około 1011 komórek.

52

Krystyna Kozłowska

Apoptoza pełni też rolę ochronną, powodując śmierć powstałych komórek nowotworowych lub zainfekowanych wirusami.

Naturalny bowiem czas życia komórek w prawidłowych warunkach jest zróżnicowany i charakterystyczny dla danego typu komórek np.:



1. owocyt po owulacji żyje 24 godz.

2. leukocyty

neutrofile

monocyty

kilka dni

3. komórki nabłonka jelitowego



4. keratynocyty

28 dni



5. komórki nerwowe

6. odontoblasty

czas życia osobniczego

7. komórki siatkówki

8. komórki mięśnia poprz. prążkowanego



W populacjach komórkowych organizmu, częstotliwość podziałów komórkowych jest równoważona obumieraniem komórek, informacje o tym zakodo-wane są w genomie, dlatego mówimy, że jest to śmierć zaprogramowana.

Równowaga ta jest zaburzona dopiero we wzroście nowotworowym gdzie więcej komórek może powstawać niż obumiera.

W embriogenezie, w procesie fizjologicznego zaniku narządów (w starzeniu się) a także w czasie różnicowania się komórek w dojrzałym organizmie jak np.: przy powstawaniu komórek krwi, naskórka, tymocytów w grasicy, dochodzi do śmierci naturalnej, zaprogramowanej, która jest niezbędna do prawidłowego rozwoju czy funkcjonowania organizmu. Taki rodzaj naturalnej, zaprogramowanej śmierci określamy jako APOPTOZĘ.

Apoptoza u kręgowców odgrywa kluczową rolę w organogenezie, w tym, w rozwoju układu immunologicznego. U dorosłych apoptoza przeciwdziała roz-rostom klonów komórek autoreaktywnych czy nowotworowych, zapewnia też selekcję i pozostanie komórek z najwłaściwszym repertuarem receptorów.

Komórki mogą też ginąć w inny, nie zaprogramowany sposób wywołany przez czynniki szkodliwe:

a.

chorobotwórcze;

b.

toksyczne;

c.

traumatyczne.

wówczas komórki giną tak jak powiedziano na drodze martwicy – nekrozy.





Śmierć komórki

53



Nekroza pęcznieją organella





kondensacja

ch

romatyny

k. prawidłowa

pęcznienie



obrzęk

utrata ciągłości błony

Apoptoza





k. prawidłowa

obkurcza się

fragmentacja

ciałka apoptotyczne



Ryc. 40. Porównanie apoptozy i nekrozy.





Zestawienie cech morfologicznych





nekrozy





apoptozy


1. komórka ulega obrzękowi

1. komórka traci wodę (do 50%), obkurcza się

2. kondensacja chromatyny

2. chromatyna tworzy grudki

3. pęcznieją organella

3. organella nie zmieniają się

4. wakuolizacja cytoplazmy

4. jądro rozpada się na fragmenty

5. utrata ciągłości bł. plazmatycznej

5. na błonie plazmatycznej tworzą się pęcherzyki

6. zawartość komórki wylewa się na zewn. 6. komórka rozpada się na fragmenty z utworzeniem 7. w otoczeniu rozwija się stan zapalny

ciałek apoptycznych, które są fagocytowane



7. nie ma śladu po komórce, nie ma śladu zapalenia





Indukcja apoptozy i przebieg zdarzeń molekularnych w komórkach różnych tkanek nie są identyczne ale, szczegółów jeszcze nie znamy.

Można jednak przyjąć, że apoptoza zawsze wymaga:

1. indukcji – wywołanej przez czynniki – zewnątrz- lub wewnątrzpochodne 2. ekspresji genów, których produkty są niezbędne do przebiegu tego procesu.



54

Krystyna Kozłowska

Mechanizm uruchamiania tego procesu u człowieka nie jest całkowicie poznany, ale wiemy jakie mogą być induktory apoptozy.





aktywacja pewnych antygenów i receptorów błonowych





zaburzenia cyklu

Sygnał

uszkodzenie DNA

komórkowego

śmierci



samobójczej

szok termiczny



usunięcie czynników

wzrostowych

promieniowanie X





Aktywacja

proteaz





Apoptoza


Ryc. 41. Induktory apoptozy.



Natomiast wiedza dotycząca pkt. 2 pochodzi głównie z badań na zwierzę-

tach.

Wiadomo, że u zwierząt i człowieka są geny zwane �śgenami śmierci”. Najlepiej geny te poznane są u obleńców (robaki) są to geny ced-3 i ced-4.

W morfogenezie, zaprogramowanej śmierci ulegają tylko te komórki, w któ-

rych wystąpi ekspresja powyższych genów. U tych zwierząt poznano też gen hamujący apoptozę, jest to gen ced-9.

U człowieka �śgeny śmierci” są słabo poznane; ostatnio wykryto 2 geny w limfocytach T związane z apoptozą: gen ALG-2 koduje białko wiążące Ca2+

i działa jak induktor apoptozy, gdyż podwyższając stężenie Ca2+ w komórkach prowadzi do apoptozy (blokery kanałów wapniowych, związki chelatujące przeciwdziałają apoptozie); taką rolę w limfocytach T pełni też gen ALG-3.

Genem ułatwiającym apoptozę jest też gen p53 – �śgen drogi ku śmierci”.

U człowieka gen p53 wiąże się z apoptozą:

1.

apoptoza zachodzi w tych komórkach, które nie mogą naprawić DNA; 2.

uszkodzenie DNA (mutacje) - zwiększa się ekspresja genu p53;

3.

białko p53 hamując cykl komórkowy, stwarza możliwość naprawy

DNA, komórka dzieli się, nie umiera.

Śmierć komórki

55

Znamy też geny hamujące apoptozę, należą one do rodziny Bcl-2, kodują białka bcl-2 (homolog białka ced-9).

Geny bcl-2 obecne w wielu komórkach ulegają ekspresji zarówno w życiu prenatalnym jak i u organizmów dorosłych.

Składniki komórki zaangażowane w proces apoptozy

1. Białka z domeną śmierci (DD – death domain) wbudowane w błonę plazmatyczną lub wiążące się z tymi wbudowanymi:

a. antygeny błonowe – glikoproteiny





Fas wykryty u zwierząt 1991 r.





APO-1 wykryty u ludzi 1993 r.





CD 95




CD 40 na limfocytach B



b. receptory błonowe – najlepiej poznany receptor dla TNF (cyto-kina – tumor necrosis factor) – TNFR1

c. białka posiadające domenę śmierci ale niezwiązane z bł. plazmatyczną tylko z Fas np.– FADD lub z TNFR1 – TRAD.





Fas (CD 95)





TNF R1 (receptor dla TNF)





TRADD





Niektóre czynniki wiążące się z białkam

i DD





FADD





Ryc. 42. Białka z domeną śmierci (DD).



2. Czynniki wiążące się z substancjami wymienionymi powyżej i tworzące kompleks sygnałowy dla śmierci samobójczej.

3. Proteazy (enzymy rozkładające białka) – kaspazy.





56

Krystyna Kozłowska

I. podrodzina

II. podrodzina

III. podrodzina

kaspaza

1

kaspaza

3 kaspaza

2

kaspaza

4

kaspaza

6 kaspaza

9

kaspaza

5

kaspaza

7 kaspaza

11

kaspaza

10

kaspaza

8

kaspaza

13

kaspaza

14



Regulatory tego procesu:

a. substancje hamujące apoptozę –

ƒ białka Bcl-2,

ƒ SODD (silencer of death domain).

b. substancje promujące apoptozę – np. białka Bax



TNF-�ą

Białka Bcl-2





HAMUJĄ





APOPTOZA



DD



WYWOŁUJĄ



SODD



(SILENCER DD)



Bax

�śwyciszacz” białek DD





Ryc. 43. Regulatory apoptozy.





Regulatory apoptozy


Hamują apoptozę:

- Białka bcl-2 – hamują białka p53, komórki mogą się dzielić, wbudowane w błonę mitochondriów zapobiegają uwalnianiu cytochromu c,

- Białka SODD – blokują DD.

Pobudzają apoptozę:

Białka Bax, Bad, itp. – wbudowane w błonę mitochondriów, umożliwiają uwalnianie cytochromu c.





Śmierć komórki

57



ligand



dla



Fas

TNF





Fas



CD 95





błona



plazmatyczna



DD

FADD

DD



TRADD

1

FADD





kompleks



sygnałowy



apoptozy





3 AKTYWACJA

KASPAZ





rozszczepienie



białek



5 komórkowych





Aktywacja



genu p53

naprawa DNA

2

podział komórki

uszkodzenie DNA





aktywacja enzymów

Cytochrom c

4



rozkładających kwasy

uwolniony

nukleinowe





jądro



komórkowe



A P O P T O Z A





Ryc. 44. Sekwencja wydarzeń w komórce ulegającej apoptozie.





58

Krystyna Kozłowska





Pro-



kaspaza-8





Pro-

Pro-

kaspaza-9

kaspaza-3



Kaspaza-9



Kaspaza-8

Pro-

kaspaza-9



Kaspaza Kaspaza-3





apoptosom


efektorowa Kaspaza-6




Kaspaza-7



Apoptoza





Apoptoza

Kaspaza-3

Ryc. 45. Przebieg apoptozy wywołanej przez czynnik wiążący się z receptorem błonowym (wg T. Baudino, SIGMA-ALDRICH).



Informacje dotychczas podane o apoptozie są wiadomościami elementar-nymi, w zestawieniu z aktualną wiedzą na ten temat; jednym z przykładów, jak ta wiedza obecnie jest rozbudowana może być ryc. 45.

Z informacji tu zawartych należałoby zwrócić szczególną uwagę przynajmniej na strukturę tworzącą się podczas procesu apoptozy nazwaną apoptosomem, na składniki, z których jest utworzona i funkcję, którą pełni.

Telomery – Telomeraza

Telomery u człowieka to końce chromosomów zbudowanych z powtarzają-

cych się sekwencji: TTAGGG (na nici 3’); liczba takich powtórzeń wynosi około 2000 i zmniejsza się wraz z podziałami komórek i wiekiem osobniczym.

W ciągu roku komórki człowieka tracą około 15 powtórzeń sekwencji telomerowej i u ludzi starszych są wyraźnie krótsze.

Telomery zapewniają stabilność chromosomów oraz służą w rozpoznawaniu chromosomów homologicznych w czasie podziałów. Po każdej replikacji (po każdej fazie S) dochodzi do utraty krótkiej sekwencji telomerowej.

Telomery służą zatem jako zegar mitotyczny zapobiegający nieograniczo-nym podziałom komórek somatycznych.

Śmierć komórki

59

Telomery traktowane są również jako molekularne zegary odmierzające ilość podziałów – a zatem czas życia komórki.

Po określonej liczbie podziałów, długość telomerów spada poniżej pewnej wartości krytycznej, wówczas szybko następuje śmierć komórki.

�śOszukać” ten zegar molekularny może jedynie enzym telomeraza, która po-trafi wydłużać telomery.

Telomeraza to enzym, który wiąże się do końca 3’ telomerów i katalizuje dodawanie krótkich odcinków bogatych w guaninę.

Enzym ten aktywny jest w okresie embrionalnym, w komórkach młodych, dzielących się i różnicujących, a także w gametach i komórkach nowotworowych.





60

Krystyna Kozłowska

8. ZAPŁODNIENIE





Zapłodnienie jest serią procesów a nie jednym wydarzeniem i polega na zespoleniu gamet żeńskiej i męskiej, w wyniku czego powstaje komórka zwana zygotą, która jest materiałem do rozwoju nowego osobnika, zawierającego wszystkie cechy przekazane przez komórki rodzicielskie.



błona plazmatyczna z



akrosom

osłonką glikoproteinową



główka



jądro



szyjka





mitochondria



włókno osiowe –

wstawka

aksonema





witka





Ryc. 46. Gameta męska.



osłonka przejrzysta (zona

pellucida) zbudowana z



glikoprotein



błona plazmatyczna





cytoplazma





jądro komórkowe



ziarna korowe





ko

k mórki ziarn

omórki zia irste tzw.

niste t

worzące

wi

weniec pr

ieniec omienisty

promienis ( t c

y orona



(corona

ra

r diata)

adiata)





Ryc. 47. Gameta żeńska.





Zapłodnienie

61

Osłonka przejrzysta komórki jajowej:

1. działa jako bariera pozwalająca tylko plemnikom tego samego gatunku związać się z komórką jajową i do niej wejść;

2. po zapłodnieniu zapobiega polispermii;

3. zapobiega przedwczesnej implantacji.

Zapłodnienie jest specyficzne gatunkowo, co oznacza, że plemniki jednego gatunku nie mogą się zespolić z komórką jajową innego gatunku. Istota mole-kularna tego zjawiska w pełni nie jest poznana, choć wiadomo, iż dużą rolę odgrywają glikoproteiny osłonki przezroczystej, które są specyficzne gatunkowo i łączą się z ligandami obecnymi na powierzchni plemnika.

Poznano już 3 takie glikoproteiny, które oznaczono:





ZP1 – m. cz. 200.000





ZP2 – m. cz. 120.000





ZP3 – m. cz. 83.000





Receptor



komórki jajowej





nie połączą się !





ligand



plemnika





Ryc. 48. Specyfika łączenia się receptora z liganiem.



ZP-1, ZP-2, ZP-3 u każdego gatunku mogą być inne i na tym m. in. może polegać specyfika gatunkowa procesu zapłodnienia.

Jak już powiedziano zapłodnienie jest procesem wieloetapowym. Plemnik, aby połączyć się z komórką jajową – musi przebyć długą drogę – z pochwy do jamy macicy, a potem do cieśni jajowodu w kierunku jego bańki. Długość tej drogi wynosi około 18 cm, a czas wędrówki plemnika u ludzi wynosi 2 – 8 godzin, natomiast szybkość wędrówki jest większa niż wynikałoby to z ruchów własnych plemnika (śr. 100 mm/sek), gdyż w ich przemieszczaniu się pomagają skurcze mięśni gładkich macicy i jajowodów.





62

Krystyna Kozłowska

Plemniki typu Y (żyjące krócej) zachowują zdolność do zapłodnienia ko-mórki jajowej przez 12 – 24 godz.; plemniki X (żyjące dłużej) wykazują tę zdolność przez 48 – 72 godz.

Miejscem zapłodnienia jest najczęściej najszersza część bańki jajowodu lub 1/3 dalszej części jajowodu.

Kwaśny odczyn (pH) w pochwie nie jest dobry dla plemników natomiast śluz wydzielany przez gruczoły szyjki macicy ma odczyn zasadowy, a to ułatwia ruch plemnikom.

Owocyt nie zapłodniony obumiera po 24 h.

Z 200 – 300 mln plemników znajdujących się w pochwie – do bańki jajowodu dotrze tylko kilka tysięcy, do komórki jajowej dotrze 300 – 500, ale wniknąć może tylko 1!

Droga, którą przebywa plemnik nie jest bezsensowną wędrówką, ma ona ważny biologiczny sens. Plemniki, które wniknęły do dróg rodnych kobiety nie są bowiem zdolne do zapłodnienia komórki jajowej. Dopiero w trakcie drogi, którą przebywają, plemniki uzyskują zdolność zapłodnienia gamety żeńskiej.

To uzdolnienie (uzdatnienie), które nabywają plemniki, czyli kapacytacja

(capacitation) jest procesem trwającym około 7 godz. Polega ona na wielorakich zmianach molekularnych w błonie plazmatycznej plemnika prowadzących do uzdatnienia ich do przejścia przez wieniec promienisty i połączenie się z receptorami komórki jajowej. Po zakończeniu kapacytacji następuje hiperaktywacja ruchowa i metaboliczna plemników. A poza tym obecne w bł. plazmatycznej plemnika białko PH–20 o aktywności hialuronidazy, umożliwia gamecie męskiej przejście przez warstwę komórek ziarnistych otaczających komórkę jajową.





komórka jajowa

jądro

komórki ziarniste

cytoplazma

plemnika





osłonka

przejrzysta





1 2




3





4





1 2 3





4


Ryc. 49. Etapy wnikania plemnika do komórki jajowej (wg K. Moore).



Zapłodnienie

63

Zakończenie kapacytacji umożliwia zajście dalszych zmian, które w efekcie pozwolą plemnikowi przejść przez osłonkę przejrzystą i wejść do komórki jajowej.

Reakcja receptorowa – najpierw konieczne jest powiązanie plemnika z osłonką przejrzystą. Reakcja receptorowa, wymaga połączeń wielu receptorów z ligandami.

Na powierzchni komórki jajowej występują specyficzne receptory - wspo-mniane już – glikoproteiny ZP1-3 dla ligandów na plemnikach.

ZP glikoproteiny osłonki przejrzystej łączą się z:

3

1. lektyną obecną na powierzchni plemnika

ważniejsze ligandy

2. białkiem ZRK m. cz. 95 kDa o aktywności kinazy

na powierzchni plemnika

3. białkiem – spermadhezyną (12 – 16 kDa)





glikoproteiny ZP 1-3





osłonka przejrzysta komórki



jajowej





enzymy akrosomalne





ligandy dla glikopretein osłonki



na powierzchni plemnika





filamenty aktynowe





Ryc. 50. Reakcja receptorowa

Zakończenie reakcji receptorowej umożliwia wystąpienie dalszego etapu za-płodnienia, czyli reakcji akrosomalnej. Glikoproteina ZP3 indukuje tę reakcję.

Ziarna akrosomalne ulegają egzocytozie, w wyniku czego uwalniane są enzymy umożliwiające częściową degradację osłonki przejrzystej.

Obecnie uważa się, że najważniejszym enzymem inicjującym penetrację plemnika przez osłonkę jest akrozyna (proteaza serynowa) poza tym w reakcji tej uczestniczą inne różnorodne enzymy akrosomalne, jak np. inne proteazy i neuraminidaza.





64

Krystyna Kozłowska

cytoplazma komórki



jajowej



jądro plemnika





pęcherzyk

enzymy akrosomalne



wyrostek

włókna

akrosomalny



- proteazy

akrosomalny

filamenty –



- neuraminidaza

pośrednie

osłonka



- akrozyna

(aktynowe)

przezroczysta





Ryc. 51. Reakcja akrosomalna.



Następny etap zapłodnienia to: fuzja komórki jajowej z plemnikiem.

Proces zapłodnienia wiąże się z ekspresją na gametach różnych molekuł adhezji oraz ich wzajemnym oddziaływaniem, np.: integryny komórki jajowej są receptorem dla fertyliny (dezintegryna) obecnej na powierzchni plemnika; dopiero połączenie tych molekuł adhezji umożliwia fuzję dwóch gamet: plemnika i komórki jajowej.

Wówczas dochodzi do aktywacji oocytu:

1. oocyt ulega aktywacji dzięki białku obecnemu w błonie plemnika –

oscylinie, które powoduje wzrost stężenia Ca2+ w cytoplazmie oocytu, 2. poziom MPF spada w ciągu dwóch godz. do 20%, oocyt kończy II podział mejotyczny, wydalone zostaje drugie ciałko kierunkowe z kom-plementarnym zestawem chromosomów,

3. odtwarza się otoczka jądrowa i wtedy jądro oocytu staje się przedją-

drzem żeńskim z haploidalną liczba chromosomów

Wyżej wymienione wydarzenia trwają od 1 – 6 godz.

Natomiast wszystkie części plemnika po wejściu do komórki jajowej poza jądrem komórkowym są degradowane.

Na tym etapie w komórce jajowej znajdują się 2 jądra komórkowe:

Zapłodnienie

65



jedno nazwano: przedjądrze żeńskie

każde z haploidalną liczbą

drugie nazwano: przedjądrze męskie

chromosomów



Taka komórka nazywa się zygotą.

Standardowe opisy implikują, że po zapłodnieniu 2 przedjądrza łączą się, żeby powstała zygota, która zawiera diploidalną liczbę chromosomów.

Obecnie już wiemy, że do takiego spotkania (kariogamii) nigdy nie docho-

dzi.

Po zapłodnieniu przedjądrza żeńskie i męskie znajdują się w zygocie obok siebie i kopiują swoje chromosomy (replikacja DNA) wchodząc w fazę S, ale faza S przebiega w każdym z nich we właściwym dla niego tempie.

Po replikacji mamy zatem 2 przedjądrza, każde z diploidalną ilością DNA; powstają także chromosomy, otoczki jądrowe rozpadają się, tworzy się wrzeciono kariokinetyczne i są 2 zestawy chromosomów z dwóch przedjądrzy.

Tak więc, w zygocie, żeński i męski genom pozostają odrębne do chwili pierwszego podziału. W metafazie chromosomy z dwóch przedjądrzy ustawiają się w płaszczyźnie równikowej i dopiero w tym momencie materiał genetyczny obojga rodziców miesza się ze sobą. Potem, chromosomy się rozdzielają, wę-

drują do biegunów komórki i każdy ich zestaw otrzymuje otoczkę jądrową; zygota dzieli się na 2 komórki – blastomery i dopiero te posiadają materiał genetyczny obojga rodziców.

W świetle powyższego – zygota nie jest więc jeszcze nowym osobnikiem.

Sekwencja wydarzeń w procesie zapłodnienia:

1. kapacytacja i przejście przez wieniec promienisty;

2. reakcja receptorowa;

3. reakcja akrosomalna;

4. fuzja błony komórki jajowej z błoną plemnika;

5. aktywacja oocytu, zakończenie II podziału mejotycznego, mieszanie się materiału genetycznego obydwu gamet.

W czasie powstawania pierwszych blastomerów następuje rozpad otoczki jądrowej przedjądrzy i w metafazie gdy dojdzie do wymieszania materiału genetycznego obojga rodziców – kończy się zapłodnienie i rozpoczyna się nowy etap rozwoju – bruzdkowanie.



66

Krystyna Kozłowska





Blok przeciw polispermii


U człowieka zapłodnienie jest procesem monospermicznym:

1. pod wpływem wzrostu stężenia Ca2+ rozpoczyna się tzw. reakcja korowa, uniemożliwiająca innym plemnikom wniknięcie do komórki jajowej (polispermia); z pęcherzyków korowych komórki jajowej, na jej powierzchnię wydzielane są silnie kwaśne hydrolazy, pod wpływem któ-

rych glikoproteiny siarczanowe osłonki ulegają polimeryzacji i tworzą niemal krystaliczną błonę zwaną błoną zapłodnienia; zawartość ziaren korowych dyfundując do otoczki przezroczystej hydrolizuje też ZP3.

2. między osłonką przezroczystą a błoną plazmatyczną komórki jajowej tworzy się przestrzeń okołożółtkowa – to jest druga bariera dla plemnika, który przypadkowo zdołałby pokonać barierę pierwszą, gdyż tam są też obecne enzymy z ziaren korowych.

Te wydarzenia trwają od 1 – 6 godzin.



Proces zapłodnienia





Sekwencja wydarzeń

Udział molekuł





Efekt biologiczny


w procesie zapłodnienia





powierzchniowych


1. Kapacytacja



Plemnik – białko PH–20

Przejście przez warstwę ziarnistą

(7 godzin)

hialuronidaza

otaczającą komórkę jajową





Komórka jajowa: glikoproteiny



2.



ZP3





Plemnik:



Reakcja

Indukcja reakcji akrosomalnej

receptorowa

ligandy {1. lektyna

2. białko ZRK – kinaza

3. spermadheryna





Wydzielane przez plemnik prote-



azy i neuramidaza degradują

Reakcja



osłonkę przezroczystą umożliwia-

akrosomalna

3.

jąc zetknięcie molekuł adhezji



komórki jajowej z molekułami

plemnika i fuzję tych komórek

4.

Integryna komórki jajowej –

Fuzja komórki jajowej receptor.

Fuzja gamet

z plemnikiem

Fertylina plemnik – ligand





Wzrost Ca2+ w cytoplazmie oocytu,





obniżenie poziomu MPF, dokoń-





czenie II podziału mejotycznego

5.

Aktywacja oocytu

Oscylina – plemnik

powstanie przedjądrza żeńskiego –

(1 – 6 godzin)

zygota.



Replikacja DNA w obydwu przed-



jądrzach, pierwszy podział – ko-



niec zapłodnienia



Zapłodnienie

67

Blok przeciw polispermii (1 – 6 godzin)





Sekwencja wydarzeń

Udział molekuł





Efekt biologiczny


w procesie zapłodnienia





powierzchniowych


1. Reakcja

korowa

(kwaśne hydrolazy)

Polimeryzacja glikoprotein

siarczanowych

2. Błona zapłodnienia (kwaśne hydrolazy)

Hydroliza ZP3